本(ben)發明涉(she)及一種瑪咔芥子油苷分光光度計定量方法(fa)。

背景技術：

芥子(zi)(zi)油苷(gan)也簡(jian)稱為硫(liu)苷(gan)，雖已(yi)有多篇報道闡明芥子(zi)(zi)油苷(gan)(如(ru)芐基(ji)芥子(zi)(zi)油苷(gan)、間甲氧基(ji)芐基(ji)芥子(zi)(zi)油苷(gan))及其降解產物(wu)異硫(liu)氰酸酯(zhi)類(如(ru)烯丙基(ji)異硫(liu)氰酸酯(zhi)、苯基(ji)異硫(liu)氰酸酯(zhi))具(ju)有一(yi)定的抗癌活性，并(bing)且新(xin)鮮瑪(ma)咔(ka)約(yue)含有1％的芥子(zi)(zi)油苷(gan)，是其他如(ru)西蘭花(hua)等十(shi)字花(hua)科植物(wu)所含的芥子(zi)(zi)油苷(gan)含量的100倍左(zuo)右。但當瑪(ma)咔(ka)組織細胞(bao)受到破壞(huai)時(shi)，芥子(zi)(zi)油苷(gan)就會與植物(wu)內源的硫(liu)苷(gan)酶相遇而發生水解，因此如(ru)何準(zhun)確定量分(fen)析瑪(ma)咔(ka)中的芥子(zi)(zi)油苷(gan)的含量顯得尤為重要。

雖有(you)(you)報道采(cai)用酶(mei)(mei)解(jie)(jie)芥(jie)子(zi)(zi)油(you)苷法，利用檢(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)(de)葡萄糖含(han)量來(lai)推(tui)測(ce)(ce)總芥(jie)子(zi)(zi)油(you)苷含(han)量；也有(you)(you)通(tong)過硫酸(suan)酯酶(mei)(mei)對(dui)芥(jie)子(zi)(zi)油(you)苷脫硫酸(suan)根等樣品前處理操(cao)作，再利用HPLC檢(jian)測(ce)(ce)多種芥(jie)子(zi)(zi)油(you)苷的(de)(de)(de)含(han)量。但(dan)第一種方(fang)法存在不能保證(zheng)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)是否(fou)完全以(yi)及很難(nan)排除自身葡萄糖的(de)(de)(de)干擾的(de)(de)(de)問題(ti)，而(er)第二種方(fang)法中的(de)(de)(de)脫硫酸(suan)根操(cao)作繁瑣(suo)復雜不宜于技術的(de)(de)(de)推(tui)廣(guang)。而(er)如(ru)果通(tong)過研究(jiu)降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)物(wu)的(de)(de)(de)成分及其含(han)量來(lai)推(tui)測(ce)(ce)芥(jie)子(zi)(zi)油(you)苷的(de)(de)(de)含(han)量，則(ze)須考慮如(ru)何保證(zheng)降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)的(de)(de)(de)完全度(du)及降(jiang)(jiang)解(jie)(jie)物(wu)的(de)(de)(de)穩定性。因此進(jin)行以(yi)芥(jie)子(zi)(zi)油(you)苷為檢(jian)測(ce)(ce)對(dui)象的(de)(de)(de)定量方(fang)法的(de)(de)(de)研究(jiu)，則(ze)較為適宜。

技術實現要素：

本(ben)發(fa)明(ming)提(ti)供(gong)了一種瑪咔芥(jie)子油(you)苷分光光度計定量方法(fa)。

本發(fa)明采(cai)用如下技術方案：

一種瑪咔芥子油苷分(fen)光光度計(ji)定(ding)量(liang)方法(fa)，包括以下步驟：

(1)取樣品稱定，之后加(jia)入乙醇于(yu)水(shui)浴條件(jian)下回流提取，減壓抽濾(lv)并測之體(ti)積(ji)；

(2)移取樣品溶液，并依次向其中加入CMC-Na溶液、PbCl₂顯色溶(rong)液，每加(jia)入(ru)一次試劑均搖勻(yun)后再加(jia)，搖勻(yun)后放置；

(3)在分光光度計檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、PbCl₂-CMC-Na為(wei)空白作對照。

優(you)選的(de)(de)，所述步驟(1)中乙醇的(de)(de)加入量為樣品質量的(de)(de)25倍，乙醇的(de)(de)體(ti)積分(fen)數為75％。

優(you)選的，所述步驟(1)中水浴(yu)溫度為75℃，回流提取時間為2.5小時。

優選的，所述步驟(2)中CMC-Na溶液的質量分數為0.15％，PbCl₂顯色(se)溶液(ye)濃度為(wei)0.8m mol/L，放置溫度為(wei)19～25℃，放置時(shi)間2小時(shi)。

優選的，所述步驟(3)中空白為0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na。

本(ben)發明提(ti)供的(de)(de)瑪咔芥(jie)子油苷分光光度(du)計(ji)定量方法(fa)通(tong)過對最佳檢(jian)測波長的(de)(de)選擇(ze)、不(bu)同(tong)濃度(du)的(de)(de)乙醇的(de)(de)影(ying)(ying)響(xiang)、不(bu)同(tong)提(ti)取(qu)方法(fa)的(de)(de)影(ying)(ying)響(xiang)、CMC-Na的(de)(de)影(ying)(ying)響(xiang)等條件的(de)(de)系統研(yan)究，以(yi)期確立簡單可靠專屬性強的(de)(de)、適合瑪咔中芥(jie)子油苷含(han)量測定的(de)(de)方法(fa)，為今后的(de)(de)研(yan)究奠定基礎。

附圖說明

圖1是本發明PbCl₂顯色劑(ji)的波(bo)長(chang)掃描(800-200nm)結果；

圖2是本發明(ming)九個不(bu)同濃(nong)度的標準品溶液波長掃描(800-200nm)結(jie)果；

圖3是(shi)本(ben)發明樣品(pin)溶液波長(chang)掃描(800-200nm)結果；

圖4是本發明標準品波(bo)長掃(sao)描(800-200nm)結果；

圖5是本發明標準(zhun)品溶液波長掃描(800-200nm)結果；

圖(tu)6是本發明標(biao)準(zhun)品在(zai)272nm處的(de)標(biao)準(zhun)曲(qu)線；

圖7是本發明穩定性(xing)試驗結(jie)果。

具體實施方式

下面的(de)實施(shi)例是(shi)對本發明(ming)的(de)進(jin)一(yi)步詳細描述。

一種瑪咔芥子油苷分光(guang)光(guang)度(du)計定量方法，包括(kuo)以下步驟：

(1)取樣品稱定(ding)，之后加(jia)入(ru)乙醇于(yu)水(shui)浴條件下回流提取，減壓抽濾并測之體積(ji)；

(2)移取樣品溶液，并依次向其中加入CMC-Na溶液、PbCl₂顯(xian)色溶液(ye)，每(mei)加入一次試劑均搖勻(yun)后再加，搖勻(yun)后放置；

(3)在分光光度計檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、PbCl₂-CMC-Na為空白作對照(zhao)。

最佳檢測波長的選擇

全波長掃描試驗

1)空白參照溶液的全波長掃描試驗

以(yi)水為(wei)空白，按照3.2項(xiang)下顯色(se)方法顯色(se)后在UV 2600分光光度計上進行波長掃描(800-200nm)以(yi)扣除背(bei)景。

2)0.8m mol/L PbCl₂顯色劑(ji)的全波長掃(sao)描試驗

取1mL0.8m mol/L PbCl₂顯色劑于比色皿中，以空白參照溶液為對照，按照相關操作，在UV 2600分光光度計上進行波長掃描(800-200nm)，以檢測0.8m mol/L PbCl₂顯色劑本身對試驗是(shi)否有影(ying)響(xiang)。

3)標準品溶液的(de)全波長掃(sao)描試驗(yan)

取黑芥(jie)子硫苷(gan)酸鉀(jia)水合物適量(liang)，精密(mi)稱(cheng)定置10ml棕色(se)(se)量(liang)瓶中，加甲醇(HPLC級)溶(rong)解并定容至(zhi)刻度，搖勻，制得(de)0.389mg/mL的(de)SH-標準品(pin)母液；分(fen)別精密(mi)移(yi)取0.389mg/mL的(de)SH-標準品(pin)母液0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL、0.80mL、1.00mL置20mL具塞試管中，之(zhi)后，依次(ci)精密(mi)移(yi)加水1.90mL、1.80mL、1.70mL、1.60mL、1.50mL、1.40mL、1.30mL、1.20mL、 1.00mL，搖勻，使之(zhi)均為(wei)2.00mL，之(zhi)后按照3.2項下(xia)顯(xian)色(se)(se)方法(fa)顯(xian)色(se)(se)，平行做兩份樣品(pin)；并以2.00mL水為(wei)空白制得(de)空白參(can)比溶(rong)液；

分(fen)別取參比溶(rong)液及對各個對照品(pin)溶(rong)液，在UV 2600分(fen)光光度計上(shang)進行(xing)波長掃(sao)描(miao)(800-200nm)以檢驗并確定最佳檢測(ce)波長。

4)樣品(pin)溶液的全波(bo)長掃(sao)描試驗

取(qu)樣品溶(rong)(rong)液按顯色反(fan)應顯色，并且每份(fen)(fen)樣品均平行(xing)(xing)做兩份(fen)(fen)；并以2.00mL提取(qu)溶(rong)(rong)劑(ji)為(wei)空(kong)白，制得(de)空(kong)白參比溶(rong)(rong)液；分(fen)別取(qu)參比溶(rong)(rong)液及樣品溶(rong)(rong)液，在UV 2600分(fen)光(guang)光(guang)度計上進行(xing)(xing)波長(chang)(chang)掃描(800-200nm)以檢驗并確定(ding)最佳檢測波長(chang)(chang)。

在272nm與540nm處的檢(jian)測(ce)

將標(biao)準品溶(rong)液、樣品溶(rong)液顯色后，在UV 2600分光光度(du)計272nm、540nm處分別檢(jian)測(ce)各吸(xi)光度(du)值。

不(bu)同濃度的乙醇的影響

鑒于今后試驗將涉及不同濃(nong)度(du)的(de)(de)乙(yi)醇(chun)，故(gu)有(you)必要考察(cha)不同濃(nong)度(du)的(de)(de)乙(yi)醇(chun)作為(wei)空(kong)白參照時對試驗的(de)(de)影(ying)響。本試驗以水為(wei)空(kong)白參照，考察(cha)了95％乙(yi)醇(chun)、70％乙(yi)醇(chun)、45％乙(yi)醇(chun)分別(bie)顯色(se)后的(de)(de)紫(zi)外吸收情況，在最佳(jia)檢測波長處檢測比較各(ge)個樣品。

不同提取方法的影響

乙醇回流提取法

稱取Maca藥粉(fen)適量，精(jing)密稱定，加入25倍量70％乙醇于75℃水(shui)浴(yu)中回流(liu)提(ti)取2.5h，減壓抽濾(lv)，合(he)并(bing)濾(lv)液(ye)，即得(de)乙醇回流(liu)提(ti)取樣品(pin)溶液(ye)；

水煎煮法

稱取(qu)Maca藥(yao)粉適(shi)量，精(jing)密稱定，分別加入10倍量水于電熱套中加熱，進行回流提取(qu)5h后(hou)，趁熱減壓(ya)抽(chou)濾(lv)，即得水煎煮樣品溶液(ye)； 向藥(yao)渣中加入10倍量80％乙醇(chun)冷(leng)浸(室溫)一周(zhou)后(hou)，減壓(ya)抽(chou)濾(lv)，濾(lv)液(ye)于-0.1MPa、39.9℃條件下減壓(ya)濃縮至無醇(chun)味，即得冷(leng)浸樣品溶液(ye)。常壓(ya)蒸餾法(fa)

稱(cheng)取Maca藥粉適量，精密稱(cheng)定，加入10倍(bei)量水進行常(chang)壓(ya)蒸(zheng)餾(liu)，收(shou)集瓶置(zhi)于冰塊附近，蒸(zheng)餾(liu)6h；將接(jie)收(shou)的餾(liu)分(fen)用乙酸乙酯(AR級)萃取后，于-0.1MPa、39.9℃條件下減壓(ya)回收(shou)殘(can)留的乙酸乙酯，即得常(chang)壓(ya)蒸(zheng)餾(liu)餾(liu)分(fen)水層樣品溶液。

0.15％CMC-Na的(de)影響

雖然文(wen)獻報道，在(zai)(zai)分光光度法測(ce)定油(you)菜籽中硫代葡萄糖(tang)甙(dai)過(guo)程中，羧甲基纖維素鈉不參與(yu)顯色反(fan)應，只作(zuo)為分散介質(zhi)，但在(zai)(zai)檢測(ce)瑪(ma)咔中的硫代葡萄糖(tang)甙(dai)芥(jie)子油(you)苷時，是否也需(xu)要CMC-Na作(zuo)為分散介質(zhi)，本(ben)試驗進行了考察(cha)。

0.15％CMC-Na對標(biao)準品溶液的影(ying)響

精密(mi)(mi)移取800μL 0.192mg/mL黑芥子硫苷酸鉀水(shui)合物，并(bing)精密(mi)(mi)移加水(shui)1.20mL補足至2mL于20mL具塞試管中，按(an)3.2項下顯色反(fan)應顯色；同時，以同等(deng)體(ti)積的水(shui)代替0.15％CMC-Na平行(xing)制備對照(zhao)品溶液兩(liang)份；并(bing)以水(shui)為空白，平行(xing)制備加0.15％CMC-Na以及不加0.15％CMC-Na的空白參比溶液各(ge)兩(liang)份；之后進行(xing)波長(chang)掃描(800-200nm)。

0.15％CMC-Na對樣品溶液的影響

按照確定的提(ti)(ti)取方法(fa)提(ti)(ti)取瑪咔，其中提(ti)(ti)取溶劑包括：95％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、85％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、75％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、65％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、55％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、45％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、35％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、25％乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)(chun)、70％甲醇(chun)(chun)(chun)；

各個提取液按(an)照3.2項(xiang)下顯色方法(fa)顯色；并(bing)以(yi)等(deng)體(ti)積的(de)水代替 0.15％CMC-Na平(ping)行制備樣(yang)品溶(rong)(rong)液兩份(fen)；并(bing)以(yi)各自溶(rong)(rong)劑為空白(bai)，平(ping)行制備加與不加0.15％CMC-Na的(de)空白(bai)參比(bi)溶(rong)(rong)液各兩份(fen)；之(zhi)后在最佳檢測波長(chang)處檢測各吸光度(du)值A，以(yi)確(que)定0.15％CMC-Na對(dui)樣(yang)品溶(rong)(rong)液吸光度(du)值的(de)影(ying)響。

標準曲線的制作

標準品溶液的制備

取黑芥子硫苷酸鉀水合物適(shi)量，精密稱定置10mL棕(zong)色(se)量瓶(ping)中，加水(PH＝6.22)溶解并定容至(zhi)刻度，搖勻(yun)，即得(de)0.389mg/mL的SH-標準品母液；

分別精(jing)密移(yi)取0.389mg/mL的SH-標(biao)準品母液0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL置20mL具塞試(shi)管(guan)中(zhong)，之后，依(yi)次精(jing)密移(yi)加水(shui)1.90mL、1.80mL、1.70mL、1.60mL、1.50mL、1.40mL，搖勻，使之均(jun)為(wei)2.00mL；依(yi)次顯(xian)色并依(yi)照(zhao)Std-1至Std-6的順序(xu)依(yi)次標(biao)記，均(jun)平行做兩份；并以2.00mL水(shui)為(wei)空白(bai)制得空白(bai)參(can)比溶液；

最佳檢測波長的驗證

分別取參比溶液及(ji)各(ge)個(ge)對照(zhao)品溶液進行(xing)波(bo)長掃描(800-200nm)，以檢(jian)驗并確(que)定最佳(jia)檢(jian)測波(bo)長；

標準曲線的繪制

在最佳檢測波(bo)長處檢測Std-1至Std-6各個標(biao)準品吸光度值(zhi)A，并(bing)以(yi)各溶液(ye)的濃(nong)度(C)為橫坐標(biao)、吸光度(A)為縱坐標(biao)，進行回歸(gui)分析；

精(jing)密(mi)度試驗(日內與日間)

取(qu)Std-6、Std-4、Std-2標準(zhun)品溶(rong)液，在(zai)最佳檢(jian)測(ce)(ce)波長(chang)處分別每(mei)天(tian)連(lian)續檢(jian)測(ce)(ce)6次、檢(jian)測(ce)(ce)3天(tian)，進(jin)行日內精密度(du)試(shi)驗與日間精密度(du)試(shi)驗。

重復性試驗

取(qu)(qu)同一批樣品2.0g各三份，共(gong)取(qu)(qu)6份，精(jing)密稱定，分別加入(ru)25倍量75％乙醇(chun)于75℃水(shui)浴條(tiao)件下回(hui)流提取(qu)(qu)2.5h，均減壓抽濾，測得體積；顯色后于最(zui)佳檢(jian)測波(bo)長(chang)處分別檢(jian)測。

穩定性試驗

取同(tong)一供試(shi)品溶液，分別(bie)于0min、30min、60min、90min、120min在最佳檢(jian)測波長(chang)處(chu)分別(bie)檢(jian)測其吸光度值(zhi)。

加樣回收率試驗

精(jing)密稱取已知(zhi)含量(liang)的樣(yang)品(pin)1.0g，共(gong)6份，分別加入對(dui)照(zhao)品(pin)11.4mg，按(an)照(zhao)3.2.7重復性試(shi)驗項(xiang)下提取方(fang)法操作制得樣(yang)品(pin)溶液；顯(xian)色后(hou)，于(yu)最佳檢測波長處分別檢測各吸光度值后(hou)計算回收率。

含量測定

取(qu)不(bu)同(tong)批次的Maca粉2.0g各(ge)三(san)份(fen)，共(gong)取(qu)6份(fen)，精密稱定(ding)，按(an)照3.2項(xiang)下確定(ding)的提(ti)取(qu)方法操作制(zhi)得樣品溶液；顯色后(hou)于最(zui)佳檢測波長處分別檢測其(qi)各(ge)自的吸光度值。

實驗結果與討論

最佳檢測波長的選擇

全波長掃描試驗

1)空白(bai)參照溶液的全(quan)波長掃(sao)描試驗

以水為空(kong)白(bai)參照溶液的全波長掃描試(shi)驗結果表明在(zai)800-200nm 的波長掃描范圍內，空(kong)白(bai)參照溶液無(wu)紫外吸收；

2)0.8m mol/L PbCl₂顯(xian)色劑的全波長掃描試驗

由圖1可知，在800-200nm的波長掃描范圍內，0.8m mol/LPbCl₂顯(xian)色(se)劑(ji)在(zai)298nm與418nm處有(you)最大紫外吸收，顯(xian)色(se)劑(ji)本身對(dui)試驗(yan)方法的最大紫外吸收波長540nm無(wu)影響。

3)標準品(pin)溶液的全波(bo)長掃描試驗

由(you)圖2可知，九個不同濃(nong)度的標準(zhun)品溶(rong)液在800-200nm的波長(chang)掃描范圍內，均(jun)在272nm處有最大紫外吸收；

4)樣品溶液(ye)的全波長(chang)掃描試驗

由圖3(左(zuo)：樣品(pin)1，右：樣品(pin)2)可知(zhi)，在800-200nm的波長(chang)范(fan)(fan)圍內，樣品(pin)溶液(ye)均(jun)在272nm處(chu)有最大紫外吸收(shou)；綜上，在800-200nm的波長(chang)掃描范(fan)(fan)圍內，不論是黑芥子硫苷(gan)酸(suan)鉀水合物標準品(pin)溶液(ye)還是樣品(pin)溶液(ye)，均(jun)在272nm處(chu)有最大紫外吸收(shou)。

在272nm與(yu)540nm處的檢測

顯色后的標(biao)準品溶液、樣品溶液分(fen)別在272nm、540nm處檢測(ce)的各(ge)吸光度值如(ru)表1所示；由此可(ke)知，在540nm處所測(ce)得的各(ge)個樣品含量(liang)均遠(yuan)不如(ru)272nm處的結(jie)果高，故進一步(bu)驗證272nm為(wei)最佳(jia)檢測(ce)波長。

表1 272nm與540nm檢測結果(n＝3)

不同(tong)濃度的乙醇的影響

表(biao)2 272nm檢測樣品(pin)結果

在最佳檢(jian)測波(bo)長272nm處檢(jian)測各顯色后的(de)乙醇(chun)(chun)(chun)溶劑(ji)的(de)結果(如表(biao)(biao)2)表(biao)(biao)明(ming)，在波(bo)長272nm處，不(bu)(bu)同濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)乙醇(chun)(chun)(chun)對吸光(guang)度(du)(du)值(zhi)是有影響的(de)，不(bu)(bu)同濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)乙醇(chun)(chun)(chun)的(de)紫外吸收情(qing)況是不(bu)(bu)同的(de)，隨著乙醇(chun)(chun)(chun)濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)增(zeng)加(jia)，其紫外吸光(guang)度(du)(du)值(zhi)越大；并(bing)說明(ming)試驗(yan)涉(she)及(ji)到不(bu)(bu)同濃(nong)(nong)度(du)(du)的(de)乙醇(chun)(chun)(chun)提(ti)取溶劑(ji)時須(xu)以各自溶劑(ji)做空(kong)白參比(bi)溶液。

不同提取方法的影響

表3不同(tong)提取方法所得(de)樣(yang)品在(zai)272nm處檢(jian)測結果(n＝3)

在(zai)UV 2600分(fen)光光度計(ji)272nm處檢測各個樣品，由表3結果(guo)表明，不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)處理(li)方法(fa)(fa)所得芥(jie)子油(you)苷的(de)(de)(de)含(han)量(liang)亦不(bu)(bu)同，其中，乙(yi)醇(chun)回流(liu)提取(qu)法(fa)(fa)所得的(de)(de)(de)樣品中芥(jie)子油(you)苷平均含(han)量(liang)最高(達到1.25％)，水煎煮法(fa)(fa)次之，常壓蒸餾法(fa)(fa)最差；由于(yu)芥(jie)子油(you)苷具有遇(yu)熱(re)不(bu)(bu)穩(wen)定、遇(yu)水會降解(jie)的(de)(de)(de)性質，為減免(mian)芥(jie)子油(you)苷長時間處于(yu)高溫狀態，故確定選擇乙(yi)醇(chun)回流(liu)法(fa)(fa)為樣品的(de)(de)(de)提取(qu)方法(fa)(fa)。

0.15％CMC-Na的(de)影響

0.15％CMC-Na對標準品溶液(ye)的影響(xiang)

由圖4(左：無CMC-Na；右：有CMC-Na)可知，在800-200nm波長掃描(miao)范圍，加(jia)(jia)不(bu)加(jia)(jia)0.15％CMC-Na標準(zhun)品溶液檢(jian)測結果均有一最大吸(xi)收波長272nm，但二者對(dui)比，很明顯(xian)(xian)加(jia)(jia)0.15％CMC-Na時的圖 譜(pu)較好，故對(dui)標準(zhun)品溶液確定顯(xian)(xian)色方法選(xuan)用加(jia)(jia)0.15％CMC-Na的操(cao)作。

0.15％CMC-Na對樣品溶(rong)液的影響

表4 272nm處樣品的檢測結果(guo)(n＝3)

采(cai)用不同濃度(du)的(de)(de)乙(yi)醇(chun)(chun)(甲醇(chun)(chun))為(wei)提取(qu)溶劑(ji)(ji)，并依據乙(yi)醇(chun)(chun)回流法(fa)制(zhi)得樣品后顯(xian)色(se)檢(jian)(jian)測；由表(biao)(biao)4結(jie)果表(biao)(biao)明，雖(sui)然與在(zai)顯(xian)色(se)反應(ying)過程中加(jia)0.15％CMC-Na時相比(bi)，各個樣品溶液的(de)(de)吸光度(du)值在(zai)不加(jia)0.15％CMC-Na時較(jiao)(jiao)大，但就(jiu)穩定性(xing)而(er)言，試驗(yan)過程中，不加(jia)0.15％CMC-Na的(de)(de)樣品溶液20min左右就(jiu)會有黑色(se)顆粒狀物析出(chu)，并對(dui)其檢(jian)(jian)測發現其吸光度(du)值驟降，故綜(zong)合考慮方法(fa)須穩定準確可重復的(de)(de)因素，認為(wei)在(zai)顯(xian)色(se)反應(ying)時須加(jia)入0.15％CMC-Na作為(wei)分散(san)介質(zhi)。同時縱(zong)觀表(biao)(biao)4試驗(yan)結(jie)果知(zhi)(zhi)，采(cai)用70％甲醇(chun)(chun)作提取(qu)溶劑(ji)(ji)時獲得的(de)(de)瑪咔芥子油(you)苷平均含(han)量最高(1.5％左右)，但考慮到甲醇(chun)(chun)較(jiao)(jiao)乙(yi)醇(chun)(chun)對(dui)人體造成的(de)(de)毒性(xing)較(jiao)(jiao)大且(qie)不宜于后期(qi)的(de)(de)工藝技術路線(xian)的(de)(de)生產放大等問題，故選擇乙(yi)醇(chun)(chun)作為(wei)提取(qu)溶劑(ji)(ji)；并由表(biao)(biao)4結(jie)果知(zhi)(zhi)在(zai)不同濃度(du)的(de)(de)乙(yi)醇(chun)(chun)中尤以75％較(jiao)(jiao)佳。

綜上可知，確定的供試品的提取方法為：取樣品2.0g，精密稱定，之后加入25倍量75％乙醇于75℃水浴條件下回流提取2.5h，減 壓抽濾并測之體積。顯色方法為：精密移取樣品溶液2.00mL，并依次向其中加入4mL 0.15％CMC-Na溶液、2mL 0.8m mol/L的PbCl₂顯色溶液，每加入一次試劑均搖勻后再加，搖勻后在22±3℃放置2h。檢測方法為：在最佳檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na為(wei)空(kong)白(bai)作對(dui)照。

標準曲線的制作

最佳檢測波長的確定

分別(bie)取(qu)參比溶(rong)液及各(ge)個對照品(pin)溶(rong)液進(jin)行波長掃描(800-200nm)，結果(guo)由圖2-5知(zhi)標準品(pin)Std-4、Std-5、Std-9的(de)最佳(jia)檢測(ce)波長均為(wei)272nm；進(jin)一(yi)步驗證了最佳(jia)檢測(ce)波長為(wei)272nm。

圖5為標準品(pin)溶液波長掃描(800-200nm)結(jie)果(從左至右為標準品(pin)Std-4、Std-5、Std-9)

標準曲線的制作

在最佳檢測波長272nm處檢測Std-1至Std-6各個標準品吸光度值A，以各溶液的濃度(C)為橫坐標、以吸光度值(A)為縱坐標，進行回歸分析，得回歸方程y＝0.0049x+0.0486(R²＝0.9995)，表明在19.45-116.70μg/ml范圍內線性關系(xi)良(liang)好，如圖6所示。

標準品的溶劑問題

本試驗曾以甲醇作為標準品的溶劑，但反復多次試驗，在272nm處所得的標準曲線的線性關系均不符合要求(R²<0.999)，推測：當甲醇作為溶解標準品的溶劑時，由于不同濃度的標準品溶液在顯色反應前均以水補足至2.00mL，并且以2.00mL水作空白，當標準品加入的量多時(如0.80mL)甲醇的含量比例較多，故以水為空白扣除背景時會造成很大誤差，致使多次試驗的標準曲線的線性關系均不符 合要求(R²<0.999)，故改用水為(wei)溶(rong)解(jie)溶(rong)劑。

顯色劑的用量問題

本試驗曾考察了9個不同濃度的標準品溶液(濃度范圍為19.45-175.05μg/mL)的線性關系，結果從Std-7至Std-9(即濃度范圍為136.15-175.05μg/mL)無法與之前的6個標準品達到很好的線性關系(R²<0.998，即r<0.999)，并且Std-7至Std-9三者的檢(jian)測結果明(ming)顯(xian)趨于(yu)一(yi)定(ding)值(zhi)；推測出現(xian)這種情況的原(yuan)因(yin)為由于(yu)加入的顯(xian)色劑的質(zhi)量是(shi)一(yi)定(ding)的，在(zai)一(yi)定(ding)范(fan)圍(wei)內，增加標準(zhun)品(pin)的含量，所檢(jian)測到的吸光度(du)值(zhi)A也呈一(yi)定(ding)的趨勢(shi)增加；但當超出此范(fan)圍(wei)后，由于(yu)所加顯(xian)色劑是(shi)一(yi)定(ding)的，故過(guo)多的標準(zhun)品(pin)將無法(fa)全部顯(xian)色，進而(er)導致檢(jian)測的吸光度(du)值(zhi)A不呈現(xian)規(gui)律(lv)的增加趨勢(shi)而(er)是(shi)趨于(yu)某一(yi)值(zhi)。另外，考(kao)慮到紫外分(fen)光光度(du)法(fa)檢(jian)測樣(yang)品(pin)時，吸光度(du)值(zhi)的最佳范(fan)圍(wei)為0.2-0.8，故確(que)定(ding)以(yi)濃度(du)19.45-116.70μg/ml為線性考(kao)察范(fan)圍(wei)。

精(jing)密(mi)度試驗(日(ri)內與日(ri)間)

表5日(ri)內(nei)與日(ri)間精密(mi)度結(jie)果(guo)

由表5結果表明(ming)，不論是(shi)日內精(jing)(jing)密(mi)度(du)(du)還(huan)是(shi)日間精(jing)(jing)密(mi)度(du)(du)，RSD值均小于3％，表明(ming)儀器精(jing)(jing)密(mi)度(du)(du)較好。

重復性試驗

由表(biao)6結果可(ke)知芥子油苷平均(jun)含量為1.1486％，RSD＝2.87％，表(biao)明該(gai)方法重(zhong)復性良好。

穩定性試驗

結果RSD＝2.53％≤3％，表明供試品(pin)在(zai)30min內(nei)基(ji)本(ben)穩(wen)定，在(zai)顯(xian)色后的30min內(nei)檢測(ce)結果可信。

表6重復性(xing)試驗結(jie)果(n＝3)

加樣回收率試驗

回收(shou)率(lv)＝(實測量(liang)(liang)－樣品含量(liang)(liang))/加入對(dui)照品量(liang)(liang)×100％

表7芥子油苷回收率(lv)試驗結果(n＝3)

由表7結果可知芥子油苷(gan)平(ping)均(jun)回收率為99.55％，且結果穩定，回收率變化范圍為95％-103％，RSD＝2.73％≤3％，表明該方法準確(que)可靠。

含量測定

表8瑪咔芥子油苷含量(liang)測(ce)定結(jie)果(guo)(n＝3)

由表(biao)8結果表(biao)明芥子(zi)油(you)(you)苷平(ping)均(jun)含(han)量均(jun)約為(wei)1.10％，符合文獻報道(dao)的(de)(de)瑪(ma)(ma)咔(ka)中有1％左右的(de)(de)芥子(zi)油(you)(you)苷含(han)量，并(bing)且(qie)RSD≤3％，表(biao)明確立(li)的(de)(de)瑪(ma)(ma)咔(ka)芥子(zi)油(you)(you)苷紫外(wai)分(fen)光光度計定量檢(jian)測方法重復性良好(hao)，可供今后分(fen)析檢(jian)測瑪(ma)(ma)咔(ka)芥子(zi)油(you)(you)苷的(de)(de)含(han)量。

本發明通過方法學考察，確立了瑪咔芥子油苷紫外分光光度計定量檢測的方法。其中，供試品的提取方法為：取樣品，精密稱定，之后加入25倍量75％乙醇于75℃水浴條件下回流提取2.5h，減壓抽濾并測之體積。顯色方法為：精密移取樣品溶液2.00mL，并依次向其中加入4mL 0.15％CMC-Na溶液、2mL 0.8m mol/L的PbCl₂顯色溶液，每加入一次試劑均搖勻后再加，搖勻后在22±3℃放置2h。檢測方法為：在最佳檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na為空(kong)白作對照。瑪咔芥子(zi)油苷的(de)含量測定(ding)

采(cai)用本試驗所(suo)建立的瑪(ma)咔(ka)芥(jie)子油苷(gan)紫(zi)外分(fen)光光度計(ji)定量(liang)檢測(ce)方 法，檢測(ce)不同(tong)批次的瑪(ma)咔(ka)，結(jie)果芥(jie)子油苷(gan)平(ping)均含量(liang)均約(yue)為(wei)1.10％，RSD≤3％，符合文獻報道的瑪(ma)咔(ka)中(zhong)有1％左右的芥(jie)子油苷(gan)含量(liang)，表明確(que)立的瑪(ma)咔(ka)芥(jie)子油苷(gan)紫(zi)外分(fen)光光度計(ji)定量(liang)檢測(ce)方法，準確(que)可信重復性好(hao)，可供今后分(fen)析檢測(ce)瑪(ma)咔(ka)芥(jie)子油苷(gan)的含量(liang)。

盡管已經示出和描述了本(ben)發(fa)明(ming)的(de)實(shi)施例(li)(li)，對(dui)于本(ben)領域的(de)普(pu)通技術人員(yuan)而(er)言，可以(yi)理解在不脫離本(ben)發(fa)明(ming)的(de)原(yuan)理和精神的(de)情況下可以(yi)對(dui)這(zhe)些實(shi)施例(li)(li)進行(xing)多種變化、修改、替換和變型，本(ben)發(fa)明(ming)的(de)范圍(wei)由所附權利要求及(ji)其等同物限定(ding)。