焦糖色素中2、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羥基-丁基咪唑的液相色譜檢測方法
【專利摘要】一種焦糖色素中副產物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羥基-丁基咪唑的固相萃取結合高效液相色譜的檢測方法，該方法包括以下步驟：1.待測樣品溶液制備；2.樣品檢測；3.結果分析。該方法具有快速檢測，高靈敏度、準確度高、成本低和通用性強等優點。
【專利說明】焦糖色素中2、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羥基-丁基 咪唑的液相色譜檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種焦糖色素中副產物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四 羥基-丁基咪唑的檢測方法，屬于食品安全檢測的檢驗方法。

【背景技術】
[0002] 焦糖色素是一種食品添加劑，俗稱醬色，是一種濃紅褐色的膠體物質，占整個食品 著色劑銷量的90 %以上。可應用于醬油，醋，啤酒，醬菜，罐頭，糖果，湯料，焙烤食品，烤煙及 止咳糖漿等各個方面。在焦糖色素的形成過程中主要發生兩大類反應--美拉德反應和焦 糖化反應，其中普通焦糖色素的生產過程中主要發生焦糖化反應，生產過程中加入氨(銨） 催化劑的焦糖色素生產以美拉德反應為主。研究發現，美拉德反應過程中能夠產生許多對 人體有害的化學物質，如2-甲基咪唑（2-MEI)、4-甲基咪唑（4-MEI)和2-乙酰基_4_(1，2， 3,4_四羥基丁基）咪唑（THI)。2-MEI和4-MEI作為神經毒素，具有強烈的致驚闕作用，并 且美國國家毒品管理計劃和其它研究者已經有明確的毒理學數據證明其具有致癌的風險。 2011年，國際腫瘤研究機構（IARC)將甲基咪唑類化合物認定為2B類致癌物，而THI可引 起免疫毒性。鑒于咪唑類化合物的毒性，歐盟委員會已經對III類焦糖色素中THI和4-MEI 建立了限量規定，分別為10和200 mg/kg。因此，建立焦糖色素中2-MEI、4-MEI和THI的檢 測方法對保證焦糖色素的品質乃至使用焦糖色素著色的包括食品在內的眾多產品的品質 尤其重要。
[0003] 焦糖色素是一種黑褐色粘稠液體或固體，基質極其復雜。如何去除大量基質的干 擾，成為準確分析微量甚至痕量的目標物的關鍵。目前，針對焦糖色素中4-MEI含量的測 定，我國唯有食品添加劑焦糖色衛生標準GB8817-2001，采用薄層法測定，而對于2-MEI和 THI的測定尚無國家標準，也沒有限量規定。近年來，國內的分析工作者僅在2-MEI和4-MEI 的檢測方法有報道，對于THI檢測方法研究尚無報道；而國內外一些分析工作者建立的焦 糖色素中2-MEI、4-MEI或THI的檢測方法，前處理方法主要有：柱層析、液液萃取、離子對萃 取、固相萃取等。柱層析、液液萃取、離子對萃取操作繁瑣，對于大量的樣品分析十分不利， 且這些前處理方法用于THI提取凈化的報道較少。三種目標物的的檢測方法主要有薄層色 譜法、氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法、毛細管電泳法、氣-質聯用技術和液-質聯用 技術。其中的方法大多數都只能檢測2-MEI、4-MeI或THI中的一種或兩種物質。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種焦糖色素中副產物2-MEI、4_MEI和THI同時檢測的方 法，該方法包括如下步驟：（1)待測樣品溶液的制備；（2)樣品檢測；和（3)結果分析。
[0005] ( 1)待測樣品溶液的制備包括如下具體步驟： (a)制備固相萃取上樣溶液：稱取焦糖色素樣品I g (準確至0.001 g),置于10 mL容 量瓶中，加水定容至刻度。取0.2 mL上述樣品溶液，加入0. I mL鹽酸溶液（0. I m〇L/L)，力口 水定各至2mL，混勾后待固相卒取凈化。
[0006] (b)固相萃取柱活化：選擇混合型陽離子交換固相萃取柱，基質為聚苯乙烯-二乙 烯基苯高聚物，60 mg、3 mL，使用前依次用2 mL甲醇、2 mL水活化。
[0007] (c)固相萃取：將（a)制備好的樣品溶液加入（b)中剛活化好的小柱中，控制流速 小于0. 5 mL/min，抽干，加入I mL水和I mL甲醇淋洗，控制流速小于I. 0 mL/min，抽干，用 洗脫液(氨水+甲醇=5+95 (v/v))2 mL洗脫收集，控制流速小于0. 5 mL/min，抽干。將收 集液在低于50 °C條件下，氮氣吹干，殘渣用1.0 mL乙腈-0.05 %氨水（10:90, V/V)定容， 渦旋混合I min，過0.22 Mm水系微孔濾膜，即制得待測樣品溶液。
[0008] 本發明的實施方案中，步驟（a)中稱量Ig樣品定容到IOmL水中，取0. 1~0. 3mL樣 品溶液準備固相萃取，優選〇. 2mL，上樣溶液加水定容至2~3mL，優選2mL。
[0009] 本發明的實施方案中，步驟（c)中1?2mL水和1?2 mL甲醇淋洗，優選ImL水和1 mL甲醇淋洗，優選2mL洗脫液洗脫。收集液可以在低于50 °C條件下吹干或者旋轉濃縮揮 干，殘渣加入定容溶液后需要渦旋Imin或者超聲波30秒溶解并過0. 22 Mm水系微孔濾膜。
[0010] (2)樣品檢測包括如下具體步驟： 標準品溶液的制備：分別準確稱取2-MEI、4-MEI和THI標準品，用水溶解，分別配成0. 5 mg/mL的儲備溶液，使用時，用水稀釋成標準使用溶液。
[0011] 用液相色譜-光電二極管陣列檢測器（LC-DAD)測定待測樣品溶液和標準品溶液。 儀器參考條件如下： 色譜柱：Agilent Polaris C18-A 柱（250 mmX4.6 mm, 5 Mm);流動相：A 為乙腈，B 為0. 05 %氨水溶液，A:B=10:90 ;流速：0. 6 mL/min ;柱溫：30 °C ;進樣量：10 ML ;DAD檢測 器檢測波長：2-MEI、4- MEI 為 215 nm ;THI 為 287 nm。
[0012] 測定各化合物峰面積，然后分別作2-MEI(4-MEI或THI)-2-MEI (4-MEI或THI) 濃度（ng/mL)標準曲線，曲線方程見式（1): y=ax +b .........(1) 式中：X-2-MEI或4-MEI或THI峰面積； y--2-MEI或4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升（ng/mL)。
[0013] (3)結果分析包括如下具體步驟： 試樣溶液的測定：待測試樣溶液中2-MEI或4-MEI或THI的響應值應在標準曲線線性 范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。
[0014] 定性判定：按照上述條件測定試樣和標準工作溶液，如果試樣中的目標物色譜峰 保留時間與標準工作溶液一致(變化范圍在±2. 5 %之內）；并且樣品色譜峰的光譜圖與標 準溶液的一致，則可判斷樣品中存在目標化合物2-MEI或4-MEI或THI。
[0015] 分析結果的表述： 試樣中2-MEI (4-MEI或THI)含量按公式（2)計算： X= (C-C0) *V*103/m/IO6.......................................... (2) 式中： X--試樣中2-MEI或4-MEI或THI的含量，單位為克每千克（mg/kg ); C--由標準曲線得試樣進樣液中2-MEI或4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升（ ng/mL )； CO--由標準曲線查得空白試樣進樣液中2-MEI或4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克 每毫升（ng/mL ); V--試樣制備液總體積，單位為毫升（mL ); m--試樣質量,單位為克（g ); 結果保留三位有效數字。
[0016] 本發明檢測方法的可行性證實： 配制濃度分別為 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL 和 1000 ng/mL的2-MEI、4-MEI和THI標準工作液，在優化的前處理方法和分離檢測條件下進 行線性范圍試驗，2-MEI、4-MEI和THI線性相關系數分別可達到0. 9992、0. 9994和0. 9990 以上。
[0017] 方法的檢出限和定量限是衡量方法靈敏度的指標。本研究根據3倍信噪比（S/ N=3)得到 2-MEI、4-MEI 和 THI 的最低檢出濃度為 0? 05 Pg/rnUO. 06 Pg/mL 和 0? 03 Pg/mL。 當稱樣為I g時，經本研究確定的前處理方法處理后最終定容到I mL檢測分析，得到2MEI、 4-MEI和THI的檢出限分別為2. 6 mg/kg、3. 0 mg/kg和L 5 mg/kg，根據10倍信噪比（S/ N=IO)得到定量限分別為 8. 5 mg/kg、10. 0 mg/kg 和 5. 0 mg/kg。
[0018] 樣品加標回收率和相對標準偏差測定： 采用本發明的焦糖色素中副產物2-MEI、4-MEI和THI的檢測方法，在焦糖色素中添 加三個濃度水平(見表4,10mg/kg、20mg/kg、200mg/kg) 2-MEI、4-MEI和THI的混合標準溶 液進行加標回收率實驗，實驗步驟同樣品檢測步驟，每個濃度重復6次，結果見表4, 2-MEI、 4-MEI和THI的加標回收率分別在80. 4?93. 4 %、80. 2?93. 0 %和75. 0?84. 6 %之間。相對 標準偏差小于10%。
[0019] 表4方法的回收率及相對標準偏差（n=6)

【權利要求】
1. 焦糖色中副產物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羥基-丁基咪唑的固 相萃取結合高效液相色譜的檢測方法，其特征在于，lg樣品溶于10mL水，取0. 2mL樣品溶 液，加入0. lm〇L/L鹽酸溶液0. lmL，加水定容至2mL，混勻后待固相萃取凈化。
2. 選擇混合型陽離子交換固相萃取柱進行凈化，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。
3. 固相萃取過程中樣品溶液加入剛活化好的小柱中，特征性在于控制上樣流速小于 0. 5mL/min，抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min，抽干，用洗脫液比 例為氨水+甲醇=5+95(v/v)2mL洗脫收集，控制流速小于0. 5mL/min，抽干。
4. 樣品檢測過程特征性在于使用Polaris C18-A柱檢測，流動相：A為0. 05%氨水溶 液；B為乙腈，并且A:B = 10:90。
【文檔編號】G01N30/02GK104359989SQ201410626380
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優先權日:2014年11月7日
【發明者】榮維廣, 馬永建, 吉文亮 申請人:江蘇省疾病預防控制中心