可溶性i型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備elisa試劑中的應用及其elisa試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備ELISA試劑中的應用及其ELISA試劑盒，ELISA試劑盒含有可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白包被的反應板、酶標抗體、顯色液和終止液，將該試劑盒用于檢測I型鴨病毒性肝炎抗體具有特異性強、重現性好、敏感度高，與用全病毒作包被抗原的ELISA試劑盒檢測的符合率高，可用于臨床樣品的檢測。
【專利說明】可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備EL ISA試劑中的應用 及其ELISA試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化學領域，具體涉及可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備ELISA 試劑中的應用和檢測I型鴨病毒性肝炎血清抗體的ELISA試劑盒。

【背景技術】
[0002] 我國是世界上養鴨數量最多的國家，鴨的飼養量約占世界的70%，養鴨業在我國 農業經濟中占有重要地位。鴨肝炎病毒（Duck Η印atitis Virus，DHV)可引起雛鴨的鴨病 毒性肝炎（Duck Viral Η印atitis，DVH)。DVH是一種高度致死性傳染病，以發病急、病程 短、發病率和死亡率高為特點。
[0003] 鴨肝炎病毒屬于小RNA病毒科（Picornaviridae)禽肝炎病毒屬 (Avih印atovirus)，本病毒有三個血清型，分別為DHAV-UDHAV-2和DHAV-3,無免疫交叉反 應。在我國，主要流行1型鴨病毒性肝炎，給我國養鴨業造成了巨大的經濟損失，威脅著養 鴨業的健康發展。因此對DHAV等鴨源病毒進行研究具有重要的社會和經濟意義。
[0004] 對鴨肝炎及鴨肝炎病毒進行研究，離不開鴨肝炎病毒及其抗體的檢測試劑及檢測 方法。可用于DHV及其抗體檢測的試劑及方法雖很多，如血凝實驗、協同凝集實驗、中和實 驗、瓊脂擴散、ELISA、熒光抗體、免疫組化、膠體金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和 試驗，但因其操作復雜、費時、成本高，不能用于快速檢測因而不適于基層推廣應用。ELISA 法具有操作簡便快速、特異性強、敏感性高、重復性好等優點。早在1991年，Zhao等運用中 和實驗、瓊脂擴散試驗、ELISA法對DHV抗體進行檢測，陽性檢出率分別為18. 8%、68. 8%和 68. 8% ;楊萍萍等以氯仿去脂、0. 22 μ m孔徑濾膜過濾、凝膠柱濃縮層析方法純化得到的病 毒作為包被抗原，也建立了檢測DHV血清抗體的間接ELISA方法。但該方法在具體使用中 受到限制，一致未能推廣，其主要原因之一是檢測DHV血清抗體的間接ELISA方法對抗原純 度要求很高，但由于病毒必須依靠宿主細胞才能增殖，因此進行全病毒抗原純化時難于與 宿主蛋白分離。
[0005] 隨著對DHAV-1分子生物學研究的不斷深入，將重組表達蛋白（特別是大腸桿菌原 核表達蛋白）抗原運用到鴨肝炎病毒抗體的檢測中成為可能。大腸桿菌表達的重組蛋白抗 原易于制備和純化，且表達重組蛋白抗原的宿主細胞大腸桿菌比制備DHV抗原的宿主細胞 (如鴨胚及鴨源細胞、雞胚等）與DHV的宿主（鴨）親緣關系更遠，檢測時由于抗原純度而 產生非特異性的可能性也減少。但重組表達的蛋白抗原運用到鴨肝炎病毒抗體的檢測還有 一個困難，就是大腸桿菌表達易形成不溶性的包涵體，包涵體由于雜蛋白含量較低、可避免 蛋白酶降解、難溶于水等特點而使其易于分離純化。包涵體中的目標蛋白雖然其肽鏈是完 整的，但卻是非天然形式、無生物學活性的表達蛋白，包涵體的溶解非常困難，需要用強變 性劑高濃度尿素、SDS等來打斷分子內和分子間的非共價鍵、離子鍵等，為獲得有活性的蛋 白，繼而需要進行蛋白復性，而包涵體蛋白溶解后的復性不僅費時、費力，且復性率低。
[0006] DHAV具有微RNA病毒科成員相似的特點，為單股正鏈RNA，完整基因組長度約為 7. 7kb，由5'非翻譯區、一個大的開放閱讀框（ORF)、3'非翻譯區組成，ORF含有6750nt，編 碼2249AA的多聚蛋白，隨后被病毒編碼的蛋白酶切割，首先分解成PI、P2和P3產物，然后 PI、P2和P3(P1編碼結構蛋白、P2和P3編碼非結構蛋白）又進一步分別分解為VP0/VP1/ VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C和3A/3B/3C/3D蛋白，產生12個成熟的病毒蛋白。3D是DHAV的 一種非結構蛋白，雖然不是病毒粒子的組成成分，但在病毒生命循環中扮演著重要角色，在 合成負鏈RNA、合成復制酶過程中占有主導的作用，加之其本身的酶催化活性，使得3D蛋白 在病毒的生存過程中必不可少，因此，在病毒感染機體內可能產生3D抗體，但目前未見3D 蛋白是否可以作為抗原檢測DHAV抗體的ELISA方法報道；同時，獲得高純度有活性的抗原 并應用于制備ELISA檢測試劑盒，對于鴨病毒性肝炎抗體的檢測的有重要的意義和推動作 用。


【發明內容】

[0007] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測 I型鴨病毒性肝炎抗體ELISA試劑中的應用；本發明的目的之二在于提供檢測I型鴨病毒 性肝炎抗體ELISA試劑盒。
[0008] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0009] 1、可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試 劑中的應用，所述可溶性蛋白的制備步驟如下：將SEQ ID N0. 3所示序列的第9?1376 位核苷酸連接于pET-32 (a) +載體的多克隆酶切位點處，然后以大腸桿菌Rosetta、BL21 或BL21 (DE3)PLYS為宿主菌，在Amp抗性的LB培養基中活化后，在IPTG終濃度為0. 2? 1. Ommol/L、溫度為20?39°C條件下誘導表達4?12小時，收集菌液，離心后收集菌體，將 收集的菌體用20mmol/L、pH為8. 0的Tris-HCl懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進行離心， 上清用Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化，透析，超濾得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。
[0010] 優選的，所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3) PLYS。
[0011] 優選的，所述誘導表達為加入IPTG至終濃度為0. 8mmol/L，在溫度為25°C條件下 誘導表達6小時。
[0012] 優選的，所述活化的具體步驟為：將表達菌株接種于Amp抗性的LB培養基中，在 37°C、120r/min條件下過夜培養，然后將培養液與Amp抗性的LB培養基按體積比為1 :100 擴大培養至〇D6(?為0. 6即可。
[0013] 更優選的，所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎6次，3〇SeC/次，每次間隔 30sec〇
[0014] 2、檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑盒，所述試劑盒含有可溶性I型鴨肝 炎病毒3D蛋白包被的反應板。
[0015] 優選的，所述反應板的制備方法為將1 μ g/mL的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白按 每孔100 μ L加入反應板中，4°C過夜包被，次日PBST洗板5次，拍干即可。
[0016] 優選的，所述試劑盒還含有酶標抗體、顯色液和終止液。
[0017] 更優選的，所述酶標抗體為HRP標記羊抗鴨IgG或HRP標記兔抗鴨IgG，所述顯色 液為TMB，所述終止液為濃度為2mol/L的H 2S04。
[0018] 本發明的有益效果在于：本發明公開了可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測 I型鴨病毒性肝炎抗體ELISA試劑中的應用，且將其構建為檢測試劑盒，獲得的試劑盒具有 特異性強、重現性好、敏感度高，與用全病毒作包被抗原的ELISA試劑盒檢測的符合率高， 對I型鴨病毒性肝炎的診斷具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0020] 圖1為I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因 PCR擴增產物電泳結果（M :DL 2000Marker，1 :3D 基因 PCR 擴增產物）。
[0021] 圖2為I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因載體構建過程中PCR鑒定和酶切 鑒定結果（A :pJET-l. 2+/DHAV-H-3D 質粒 PCR 鑒定，M :DL2000Marker，1 :PCR 產物；B : pJET-1. 2+/DHAV-H-3D 質粒酶切鑒定，M :DL15000Marker，1 :Kpn I /Xho I 雙酶切條帶，2 : Xho I 單酶切條帶；C :pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質粒的 PCR 鑒定，M :DL2000Marker，1 :PCR產 物；D :pET32a+/DHAV-H-3D質粒的酶切鑒定，1 :Kpn I /Xho I雙酶切結果，2 :Xho I單酶 切條帶）。
[0022] 圖3為可溶性3D蛋白表達條件的優化（Μ為低分子量蛋白質標準品；A:表達菌 的篩選，1為pET-32 (a) +空載體表達產物，2-4分別為pET-32 (a) +/DHAV-H-3D重組質粒轉 化Rosetta、BL21和BL21 (DE3)PLYS三種不同表達宿主菌的表達產物；B :誘導表達時間的 優化，1-5依次為誘導12h、10h、8h、6h和4h的BL21 (DE3) PLYS宿主菌表達產物；C :誘導表 達溫度的優化，1-6 分別為 39°C、37°C、35°C、30°C、25°C和 20°C 的 BL21 (DE3)PLYS 宿主菌 表達產物；D :IPTG 濃度優化，1-5 分別為 0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L 和 1. Ommol/L的IPTG誘導的表達產物。
[0023] 圖4為3D蛋白Western-blot檢測及純化蛋白電泳（A為3D蛋白的免疫印跡檢測 結果，Μ為蛋白質Marker，1為3D蛋白印跡。B為SDS-PAGE檢測純化的3D蛋白，Μ為低分 子量蛋白質Marker, 1為純化的3D蛋白）。

【具體實施方式】
[0024] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實施例1、克隆I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因
[0026] I 型鴨肝炎病毒株 H(DHAV-H) (GenBank JQ301467)、E. coli DH5 α 菌種和 pET-32(a) +載體均由四川農業大學禽病防治研究中心保存并提供。各種分子生物學試劑購 于生物試劑公司。
[0027] 根據DHAV-H的基因組序列（GenBank JQ301467)設計擴增3D基因的引物，具體引 物如下：
[0028] PI ：5, -gg￡gtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3, (SEQ ID Ν0· 1)，下劃線表示 Κρη I酶切位點；
[0029] P2 :5' -acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3' (SEQ ID Ν0· 2)，下劃線表不 Xho I酶切位點；然后將設計的引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。
[0030] 取保存的DHAV-H病毒液以滅菌PBS作5倍稀釋，添加1/100體積的雙抗（青霉 素、鏈霉素的終濃度分別為l〇〇IU/mL和100yg/mL)后于37°C溫育lh，然后接種9日齡發 育良好、無母源抗體的鴨胚，棄去24h內死亡胚，收集24?72h死亡胚的尿囊液及胚體，按 照Trizol試劑盒說明書提取病毒RNA。
[0031] 將提取的病毒RNA反轉錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增，反轉錄和 PCR擴增體系如表1所示。
[0032] 表1反轉錄和PCR反應體系
[0033]

【權利要求】
1. 可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑中 的應用，其特征在于，所述可溶性蛋白的制備步驟如下：將SEQ ID NO. 3所示序列的第9? 1376位核苷酸連接于pET-32 (a) +載體的多克隆酶切位點處，然后以大腸桿菌Rosetta、 BL21或BL21 (DE3)PLYS為宿主菌，在Amp抗性的LB培養基中活化后，在IPTG終濃度為 0. 2?1. Ommol/L、溫度為20?39°C條件下誘導表達4?12小時，收集菌液，離心后收集菌 體，將收集的菌體用20mmol/L、pH為8. 0的Tris-HCl懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進行 離心，上清用Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化，透析，超濾得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)PLYS。
3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述誘導表達為加入IPTG至終濃度為 0. 8mmol/L，在溫度為25°C條件下誘導表達6小時。
4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述活化的具體步驟為：將表達菌株接種 于Amp抗性的LB培養基中，在37°C、120r/min條件下過夜培養，然后將培養液與Amp抗性 的LB培養基按體積比為1 :100擴大培養至0D_為0. 6即可。
5. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破 碎6次，30sec/次，每次間隔30sec。
6. 檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有可溶性I 型鴨肝炎病毒3D蛋白包被的反應板。
7. 根據權利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于：所述反應板的制備方法為將 1 μ g/mL的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白按每孔100 μ L加入反應板中，4°C過夜包被，次日 PBST洗板5次，拍干即可。
8. 根據權利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有酶標抗體、顯 色液和終止液。
9. 根據權利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于：所述酶標抗體為HRP標記羊抗 鴨IgG或HRP標記兔抗鴨IgG，所述顯色液為TMB，所述終止液為濃度為2mol/L的H 2S04。
【文檔編號】G01N33/68GK104297493SQ201410606977
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】汪銘書, 程安春, 曹乾大, 陳孝躍 申請人:四川農業大學