神經降壓素在診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型和判斷預后中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了神經降壓素在制備診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型試劑中的應用。測定受試者血清中神經降壓素水平，將其與受試者臨床數據進行相關性分析，同時利用基礎生物學實驗驗證，證明神經降壓素與去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型具有強相關性。本發明為臨床上診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型和判斷其預后提供了新的方法。
【專利說明】神經降壓轟在診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型 和判斷預后中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥【技術領域】，涉及神經降壓素的用途，具體涉及神經降壓素在 去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型診斷和預后中的用途。

【背景技術】
[0002] 神經降壓素（Neurotensin, NT)，于1973年被發現，為13個氨基酸組成的直鏈多 膚，分子量是1673。N末端缺少游離的-NH2，C末端可被駿膚酶（Carboxypeptidase)水解， 其排列順序如下：焦谷-亮-酪-谷-口醜-賴-脯-精-精-脯-酪-異亮-亮-0H，來 源于前神經降壓素原前體，主要由開放型的N細胞分泌。神經降壓素通過神經降壓素受體 發揮作用，神經降壓素受體有H種，分別為神經降壓素受體1 (NTRl)，神經降壓素2 (NTR2) 和神經降壓素3(NTR3)，其中NTRl和NTR2為G蛋白偶聯受體，NTR3為非蛋白偶聯受體。研 究顯示，神經降壓素及其受體參與了膜腺癌、結腸癌、和肺小細胞癌等癌癥的發生發展。
[0003] 前列腺癌為男性常見惡性腫瘤之一，在我國其發病率及死亡率呈逐年升高趨 勢。由于早期前列腺癌多為激素依賴性前列腺癌，雄激素剝奪療法對早期前列腺癌患者 具有顯著療效。然而，根據臨床實踐顯示，在接受雄激素剝奪治療2?3年后，幾乎所有 激素依賴性前列腺癌患者會進展為雄激素非依賴的去勢抵抗性前列腺癌，同時雄激素撤 退又會導致前列腺癌細胞向神經內分泌（肥）細胞轉化[Ismail A皿,et al., An化Ogen ablation promotes neuroendocrine cell differentiation in dog and human p rostate，Prostate, 2002, 51 (2) : 117-125]。NE細胞分泌大量的神經多獻，通過旁分泌 作用促進周圍癌細胞不依賴雄激素生長，W及抗調亡和侵襲轉移能力增強，使病情惡 化[Yuan TC,et al.，Neuroendocrine-like prostatecancer cells:Neuroendocrine transdifferentiation of prostate adenocarcinoma cells,Endocr Relat Cancer, 2007, 14(3) :531-547],從而使前列腺癌患者對任何內分泌治療不敏感，使前列腺 癌患者失去治療的機會。目前，尚沒有明確的診斷指標預測和診斷去勢抵抗性前列腺癌神 經內分泌亞型。由于去勢抵抗性前列腺癌具有異質性的特點，個體化診斷去勢抵抗性前列 腺癌的病理類型將為臨床上個體化治療去勢抵抗性前列腺癌提供理論依據和實驗基礎。
[0004] RNA干擾（SiRNA)是機體內廣泛存在的一種雙鏈RNA介導的序列特異性基因沉默 現象[Fire A. , et al. Potent and speci円c genetic interference by double-stranded RNA in Caenorh油ditis 616肖3113.化1:腳61998;391:806-811]，因其具有沉默效率商、特異 性強W及操作簡便等優于傳統基因敲除手段的優點而得到迅速發展，現成為生命科學領域 中重要的石升究工具[Arziman Z. , et al. E-RNAi :a web application to design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Res 2005 ;33:W582-W58引。SiRNA與蛋白質結合形成RNA 誘導沉默復合物（RNA-in化ced silencing complex, RISC)。該復合物能夠結合到同源的 mRNA上并誘導其降解。
[0005] 關于神經降壓素與去勢抵抗性前列腺癌的神經內分泌轉化之間的關系及其作用 機制的研究還未見報道，本發明通過臨床數據和基礎生物實驗數據來研究神經降壓素與去 勢抵抗性前列腺癌神經內分泌轉化之間的關系，本發明的成果可W為臨床診斷去勢抵抗性 前列腺癌的神經內分泌化亞型或判斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型預后提供新 的方法。


【發明內容】

[0006] 本發明提供了神經降壓素在制備診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型的 試劑中的應用。所述試劑可W是能夠檢測血清中神經降壓素含量的任何試劑。在本發明的 具體的實施方案中，所述試劑是ELLSA實驗中使用的神經降壓素抗體。
[0007] 根據本發明的具體的實施方案，當血清中神經降壓素水平高于正常人均水平時， 則診斷接受檢測的去勢抵抗性前列腺癌患者為去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型患 者。
[0008] 本發明還提供了神經降壓素在制備判斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型 預后的試劑中的應用。所述試劑可W是能夠檢測血清中神經降壓素的含量的任何試劑。在 本發明的具體的實施方案中，所述試劑是ELLSA實驗中使用的神經降壓素抗體。
[0009] 根據本發明的具體的實施方案，當血清中神經降壓素水平高于正常人均水平時， 則判斷接受檢測的去勢抵抗性前列腺癌患者的預后差。
[0010] 本發明還提供了檢測神經降壓素的試劑在制備診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內 分泌化亞型試劑盒中的應用。所述試劑可W是能夠檢測血清中神經降壓素的含量的任何試 齊U。在本發明的具體的實施方案中，所述試劑是化LSA實驗中使用的神經降壓素抗體。
[0011] 本發明還提供了檢測神經降壓素的試劑在制備判斷去勢抵抗性前列腺癌神經內 分泌化亞型預后的試劑盒中的應用。所述試劑可W是能夠檢測血清中神經降壓素的含量的 任何試劑。在本發明的具體的實施方案中，所述試劑是ELLSA實驗中使用的神經降壓素抗 體。
[0012] 本發明還提供了檢測神經降壓素和去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型相關 性的方法，所述方法的具體操作步驟如下：
[001引 1.臨床檢測
[0014] (1)檢測正常人和去勢抵抗性前列腺癌患者血清中神經降壓素的含量。
[0015] (2)將步驟（1)測得的數據和去勢抵抗性前列腺癌患者的臨床數據進行相關性分 析。
[001引 2.基礎生物實驗
[0017] (1)使用神經降壓素誘導體外培養的前列腺癌細胞，觀察前列腺癌細胞的變化；
[0018] (2)使用步驟（1)誘導后，抑制神經降壓素的信號通路，觀察前列腺癌細胞變化。
[0019] 通過臨床檢測發現神經降壓素和去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型存在強 相關性。基礎生物學實驗發現神經降壓素能夠誘導前列腺癌細胞發生神經內分泌轉化，而 當抑制神經降壓素的信號通路時，前列腺癌細胞的神經內分泌轉化過程受到抑制。
[0020] 優選地，臨床檢測血清中神經降壓素的含量使用化LSA方法。
[0021] 優選地，本發明使用的體外培養的前列腺癌細胞是LNCaP細胞。
[0022] 抑制神經降壓素信號通路的方法包括加入神經降壓素的枯抗劑、加入神經降壓素 的抑制劑、加入神經降壓素受體的阻斷劑、加入干擾神經降壓素受體表達的試劑。在本發明 的具體的實施方案中，通過加入針對神經降壓素受體的SiRNA來抑制神經降壓素的信號通 路。
[0023] 優選地，上述針對神經降壓素受體的SiRNA是針對神經降壓素受體1的SiRNA (祀 序列；5' -ACCCATGTTTCTCATTAGTGTCT)或是針對神經降壓素受體3的SiRNA(祀序列： CTGAATGTAATGCAAGAATGAAC)。更優選地，針對神經降壓素受體的SiRNA是上述兩種SiRNA 的組合。
[0024] 針對神經降壓素受體1的SiRNA(SiRM)序列信息如下：
[00巧]正向序列；5，-ACACUAAUGAGAAACAUGGGU-3，，
[0026] 反向序列；5' -CCAUGUUUCUCAUUAGUGUCU-3' ；
[0027] 針對神經降壓素受體3的SiRNA (siRM3)序列信息如下：
[0028] 正向序列；5 ' -UCAUUCUUGCAUUACAUUCAG-3 '，
[0029] 反向序列；5, -GAAUGUAAUGCAAGAAUGAAC-3' ；
[0030] 在本發明的具體的實施方案中，Western blot實驗證明，前列腺癌細胞中導入 SiRNA,神經降壓素受體表達受到抑制。
[0031] 在本發明的具體的實施方案中，神經降壓素誘導的體外培養的前列腺癌細胞呈現 NE細胞的形態特征，如細胞呈錐形、出現多個樹狀突起；導入SiRNA的前列腺癌細胞的細胞 則恢復了正常的形態。
[0032] 本發明的去勢抵抗性前列腺癌細胞神經內分泌化亞型的構建是通過下列方法實 現的：在無雄激素的條件下體外培養前列腺癌細胞，使用神經降壓素誘導前列腺癌細胞系， 采用光鏡觀察細胞形態，觀察前列腺癌細胞是否發生了神經內分泌轉化。
[0033] 本發明中術語"對象"是指有生命的人類或非人類的生物體。優選地，所述對象是 前列腺癌患者對象。
[0034] 本發明中術語"水平升高"的意思是在一定的闊值水平之上的水平。
[00巧]本發明的優點和有益效果如下；本發明首次了發現神經降壓素和去勢抵抗性前 列腺癌神經內分泌化亞型的相關性，一方面為診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型 提供新的方法，同時為判斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型患者的預后提供新的途 徑；另一方面為臨床治療去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型提供新的祀向藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1顯示正常人、激素依賴性前列腺癌患者（ADPC)和去勢抵抗性前列腺癌患者 (CRPC)血清中神經降壓素水平的散點圖；
[0037] 圖2顯示神經降壓素和去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌亞型的相關性；
[0038] 圖3顯示神經降壓素和去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌亞型患者預后的相關性；
[0039] 圖4顯示神經降壓素體外誘導前列腺癌細胞發生神經內分泌轉化過程中細胞形 態的變化；
[0040] 圖5顯示SiRNA干擾神經降壓素受體表達的干擾效率的檢測；
[0041] 其中；圖5A表示單獨轉入SiRNA對神經降壓素受體1表達的影響；圖5B表示單獨 轉入siRNA2對神經降壓素受體2表達的影響；圖5C表示siRNA3對神經降壓素受體3表達 的影響；
[0042] 圖6顯示SiRNA對前列腺癌細胞神經內分泌轉化的影響；
[0043] 其中；圖6A表示單獨轉入陰性對照SiNT對前列腺癌細胞神經內分泌轉化的影響； 圖6B表示單獨轉入SiRNA對前列腺癌細胞神經內分泌轉化的影響；圖6C表示單獨轉入 siRNA2對前列腺癌細胞神經內分泌轉化的影響；圖抓表示單獨轉入siRNA3對前列腺癌細 胞神經內分泌轉化的影響；圖6E表示同時轉入SiRNA和siRNA3對前列腺癌細胞神經內分 泌轉化的影響。

【具體實施方式】
[0044] 下面結合具體的實施例進一步說明本發明，本發明的實施例僅用于解釋本發明， 并不意味著限制本發明的保護范圍。
[0045] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0046] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0047] 實施例1神經降壓素與去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化的相關性研究
[0048] 本實施例中，神經降壓素在血清中的水平是神經降壓素的空腹水平。空腹水平的 意思是采取血樣前1化沒有攝取食物。
[0049] 1、全部研究對象選自天津市泌尿外科研究所病理證實的64例經過不等時間抗雄 治療前列腺癌患者，且該些對象于2014. 04-2014. 06期間在天津市泌尿外科研究所行PSA 監測檢查，其中18例未見生化復發，余46例已經發生了雄激素抵抗（趨勢抵抗性前列腺 癌，根據 EAU Guideline)。
[0050] 2、研究方法
[0051] 2. 1神經降壓素的血清濃度檢測
[0052] 2. 1. 1步驟；采集前列腺癌患者血清樣品，采用PH犯NIX PHARMACEUTICALS的 Neurotensin Fluorescent Immunoassay Kit,將試劑及血漿樣品置于室溫下（20 ?25°C) 進行溫度平衡；計算試劑用量，樣本與標準品進行雙份實驗；配制IXEIA緩沖液，水化標準 神經降壓素蛋白、陽性對照W及結合蛋白。配制標準品：打開。取6個離也管，Wl?6標 記，向6號管中加900yllXEIA緩沖液加IOOiil標準品溶液，混勻，濃度為lOOOOOng/ml ; 從5號到1號依次倍比稀釋標準品濃度。使用移液器取50 y 11號?5號離也管內標準品、 陽性對照、病人血清加入到抗體包埋的板孔內，每次取樣時更換槍頭；使用移液器向每個孔 內加入25 y 1結合蛋白，4°C賠育過夜；加入25 y 1生物素表達的多膚，室溫賠育1.化，移去 各孔液體，W 350 Ull XEIA緩沖液洗涂四次。向各孔加入100 Ul SR-HRP，室溫賠育比，移 去各孔內液體，W 350 y 11XEIA緩沖液洗涂四次。向各孔加入IOOy 1底物反應液，室溫下 避光下賠育15min ;向各孔加100 y 1反應終止液；使用325nm激發和425nm發射光檢測每 孔英光強度，建立標準曲線，計算各樣本神經降壓素的血清濃度。
[0053] 2. 1. 2統計方法
[0054] 統計學采用雙側t檢驗，P<0. 05為差異顯著。
[00巧]2. 1. 3 結果：
[0056] 結果如圖1所示，與正常組和激素依賴性前列腺癌患者（ADPC)相比，去勢抵抗性 前列腺癌神經內分泌化患者（CRPC)血清中神經降壓素的含量明顯升高。
[0057] 2. 2神經降壓素的血清濃度與去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化的相關性分析
[0058] 2. 2. 1分析步驟
[0059] 用Graphpad Prism做相關性的統計學分析。
[0060] 2. 2. 2 結果
[0061] 使用去勢抵抗性前列腺癌患者臨床免疫組化結果為臨床指標，通過觀察免疫組化 的嚴重程度和神經降壓素濃度的關系，進行相關性分析。結果如圖2所示，神經降壓素的血 清濃度與去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化相關性強（P<〇. 001)，即神經降壓素在血清中 的含量高于正常水平時，則診斷去勢抵抗性前列腺癌已經發生神經內分泌轉化。
[0062] 2. 3神經降壓素的血清濃度與去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型預后的相 關性分析
[0063] 2. 3. 1分析具體步驟
[0064] 用Graphpad Prism做相關性的統計學分析。
[0065] 2. 3. 2 結果
[0066] W患者無復發生存的長短判斷去勢抵抗性前列腺癌患者預后效果的指標。結果如 圖3所示，神經降壓素水平影響去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型的預后，兩者存在 強相關性（P = 0. 0002<0. 05)，即神經降壓素在血清中的含量高于正常水平時，去勢抵抗性 前列腺癌神經內分泌化亞型患者的預后差。
[0067] 實施例2針對神經降壓素受體的SiRNA的干擾效率的檢測
[0068] 1、合成 SiRNA
[0069] 在Genebank中找到神經降壓素受體1的基因序列佑ene ID:4923)、神經降壓素受 體2的基因序列佑ene 10:23620)、神經降壓素受體3的基因序列佑ene 10:6272)。由上 海吉凱基因公司設計及化學合成，2. OOD巧nmol) *2只，如下：
[0070] 針對神經降壓素受體1的SiRNA(SiRM)序列信息如下：
[0071] 正向序列；5，-ACACUAAUGAGAAACAUGGGU-3 '，
[0072] 反向序列；5' -CCAUGUUUCUCAUUAGUGUCU-3' ；
[0073] 針對神經降壓素受體2的SiRNA (siRM2)序列信息如下：
[0074] 正向序列；5 ' -UCAUUCUUGCAUUACAUUCAG-3 '，
[00巧]反向序列；5, -GAAUGUAAUGCAAGAAUGAAC-3,；
[0076] 針對神經降壓素受體3的SiRNA (siRM3)序列信息如下：
[0077] 正向序列；5 ' -UCAUUCUUGCAUUACAUUCAG-3 '，
[0078] 反向序列；5, -GAAUGUAAUGCAAGAAUGAAC-3' ；
[0079] 空的祀基因 SiRNA(SiNT)
[0080] 正義鏈；5' -UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3'，
[0081] 反義鏈；5，-UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3，。
[0082] 2、細胞培養；LNCaP細胞在含10% FBS的1640培養基中，37°C、5% C02培養箱培 養。
[0083] 3、前列腺細胞神經內分泌化細胞模型的建立
[0084] 3. 1 誘導
[0085] 將細胞按IX IO^孔接種到24孔細胞培養板中，在37°C、5% (?培養箱細胞培養 2化后，在培養基中加入終濃度為4ng/ml的神經降壓素（使用無菌水配制），誘導前列腺癌 細胞系LNCaP 3代，每代一周。
[0086] 3. 2細胞形態觀察
[0087] 結果如圖4所示，神經降壓素誘導后，細胞呈現神經內分泌細胞的形態，如細胞呈 錐形、出現多個樹狀突，表明前列腺細胞神經內分泌化細胞模型建立成功。
[0088] 4、轉染；將上述神經降壓素誘導后發生神經內分泌化的LNCaP細胞按IX IO^孔 接種到24孔細胞培養板中，在37°C、5% C02培養箱細胞培養2祉。更換無雙抗含10% FBS 的1640培養基，轉染按照脂質體轉染試劑2000 (購自于Invitrogen公司）的說明書轉染， 實驗分為陰性對照組和實驗組（干擾RNA的濃度均為20nM)，其中陰性對照組SiRNA為通用 對照SiRNA,即SiNT,與神經降壓素受體基因的序列無同源性讀驗組為2個平行組。陰性 對照組和實驗組同時分別轉染。
[0089] 5、免疫印跡（western blot)檢測神經降壓素受體蛋白表達水平：轉染細胞4她 后，用細胞裂解液（150mM氯化軸+1% NP-40(去垢劑）+0. 1% SDS(去垢劑）+2yg/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑）（使用前加入）+2 yg/ml Leup巧tin (蛋白酶抑制劑）（使用前 加入）或ImM PMSF (蛋白酶抑制劑）+1. 5mM邸TA (蛋白酶抑制劑）+ImM NaVanadate (磯酸 脂酶抑制劑））收集細胞，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白濃度的測定，各實驗組取50 y g 蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，5 %脫脂奶粉封閉，接著加入神經降壓素受體抗體和內參抗體在 4C賠育過夜，膜用TBST液洗涂3次，然后再用辣根過氧化物酶（HR巧標記的山羊抗小鼠 (中杉金橋有限公司，1:5000)室溫賠育比。用E化免疫印跡化學發光試劑賠育5min后曝 光、顯影、定影。管家蛋白目-actin或GAPDH蛋白為內參蛋白。
[0090] 6、結果
[00川如圖5所示，siRNA、siRNA2、siRNA3分別能夠顯著抑制神經降壓素受體1 (NTSRl)、 神經降壓素受體2 (NTSR2)、神經降壓素受體3 (NTSR3)的表達。
[0092] 實施例3 SiRNA對前列腺細胞神經內分泌化的影響
[0093] 1、前列腺細胞神經內分泌化細胞模型的建立步驟同實施例2。
[0094] 2、細胞轉染；步驟同實施例2。
[0095] 3、細胞形態觀察
[0096] 光鏡下觀察細胞形態，結果如圖6所示，SiRNA干擾神經降壓素受體1的表達或 siRNA3干擾神經降壓素受體3的表達，或同時干擾神經降壓素受體1和神經降壓素受體3 的表達后，與陰性對照組（SiNT)相比，前列腺癌細胞失去了椎體形狀和樹狀突，恢復了本 來的形態。
[0097] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施例對本發明作了詳盡的描述，但在本 發明基礎上，可W對之做一些修改或改進，該對本領域技術人員而言是顯而易見。因此，在 不偏離本發明精神的基礎上所作的該些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 神經降壓素在制備診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型的試劑中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述試劑是能夠檢測血清中神經降壓素 含量的試劑。
3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述試劑是ELLSA實驗中使用的神經 降壓素抗體。
4. 神經降壓素在制備判斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型預后的試劑中的應 用。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述試劑是能夠檢測血清中神經降壓素 的含量的試劑。
6. 根據權利要求4或5所述的應用，其特征在于，所述試劑是ELLSA實驗中使用的神經 降壓素抗體。
7. 檢測神經降壓素的試劑在制備診斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型試劑盒 中的應用。
8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1至3中任一項 所述的試劑。
9. 檢測神經降壓素的試劑在制備判斷去勢抵抗性前列腺癌神經內分泌化亞型預后的 試劑盒中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求4至6中任一 項所述的試劑。
【文檔編號】G01N33/68GK104237535SQ201410522712
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】牛遠杰, 尚芝群, 朱識淼, 蔣寧, 田昊, 孫李斌, 李星 申請人:天津市泌尿外科研究所