一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內設有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標板的隔層；所述盒體內設有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內放置有：裝有分析液的試劑瓶；裝有清洗液的試劑瓶；裝有增強液的試劑瓶；裝有β-hCG校準品的試劑瓶；裝有標記的抗α-TSH單克隆抗體的試劑瓶。此外，本發明還公開了該試劑盒的制備方法及其在檢測β-hCG含量中的應用。本發明試劑盒的靈敏度高、檢測范圍廣、穩定性好。本發明可利用全自動時間分辨熒光免疫分析儀進行全自動操作，操作簡單省時，靈敏度高，可達到0.01mIU/ml；準確性好、且無輻射污染。
【專利說明】—種檢測β -hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及體外免疫診斷試劑領域，尤其涉及一種檢測尿液中β-hCG的時間分辨免疫熒光試劑盒及其制備方法和應用，實現對尿液中β -hCG含量的定量檢測。
【背景技術】
[0002]人絨毛膜促性腺激素(hCG)，是由胎盤絨毛膜的合體滋養層產生的一種糖蛋白，β亞單位是特異性抗原，其結構與其它垂體前葉激素不同。
[0003]質量是一家生產型企業的立足之本。許多做hCG測試筆的體外診斷公司，需要利用含一定濃度β -hCG標準品進行測試筆功能性檢測，從而確認此批測試筆是否達到標準，能否出售，這是一個關鍵質量控制點。標準品若不合格，有可能對測試筆的性能進行誤判，對企業產生不利的影響。因此有必要發展一種靈敏度高、檢測范圍廣、穩定性好的定量檢測試劑盒，用于監測含一定濃度的β -hCG標準品的性能。
[0004]目前市售的試劑盒大多以酶聯免疫為主，以血清為標本進行定量檢測β-hCG含量，靈敏度一般，檢測范圍偏窄，取樣操作復雜、不方便。尿液中β-hCG含量的測定已經是體外快速檢測產品的一項重要指標，通過尿液中β-hCG含量的多少，可直接判斷出是否懷孕以及懷孕的周數，取樣簡單、便捷。作為早早孕體外快速檢測產品的質控標準品，也是用尿液來配制或者標定的；容易引起疏忽的是:不管是正常男性或婦女的尿液中，本身就存在一定含量(極低水平)的β-hCG抗原。因此定量測定尿液中β-hCG的含量，可為標準品的準確性提供一種定量的保證，也可輔助早期判斷妊娠、流產、宮外孕等。
[0005]時間分辨免疫突光分析法(Time-resolvedfluoroimmunoassay, TRFIA),是利用具有獨特熒光特性的鑭系元素作為標記示蹤物，代替酶、同位素等，成為發光免疫分析中的一種重要方法，具有靈敏度高、示蹤物穩定、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染等許多優點。
[0006]目前，對于采用時間分辨免疫熒光分析法檢測尿液中β-hCG含量尚未見報道。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題之一是提供一種檢測尿液中β -hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其靈敏度高、檢測范圍廣、穩定性好，取樣方便，快速。
[0008]本發明要解決的技術問題之二是提供該試劑盒的制備方法。
[0009]本發明要解決的技術問題之三是提供該試劑盒在檢測β -hCG含量中的應用。
[0010]為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:
[0011]在本發明的一方面，提供一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內設有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標板的隔層；所述盒體內設有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內放置有:
[0012]裝有分析液的試劑瓶；
[0013]裝有清洗液的試劑瓶；
[0014]裝有增強液的試劑瓶；
[0015]裝有β -hCG校準品的試劑瓶；其中，β -hCG校準品的濃度已知，用于建立標準曲線.-^4 ，
[0016]裝有標記的抗a -TSH單克隆抗體的試劑瓶。
[0017]作為本發明優選的技術方案，所述容器孔內還放置有:裝有包被液的試劑瓶、裝有封閉保護液的試劑瓶、以及裝有洗脫液的試劑瓶。
[0018]作為本發明優選的技術方案，所述酶標板為帶保護膜的96孔酶標板。
[0019]作為本發明優選的技術方案，所述抗β _hCG單克隆抗體的濃度為l-ΙΟμ g/ml。
[0020]所述標記的抗a -TSH單克隆抗體的標記物可以采用本領域常用的標記物，例如鑭系元素。作為本發明優選的技術方案，所述標記的抗a-TSH單克隆抗體的標記物優選是三價銪離子。
[0021]作為本發明優選的技術方案，所述標記的抗a-TSH單克隆抗體中抗體與標記物的標記重量比例是(6-10):1。
[0022]作為本發明優選的技術方案，所述β-hCG校準品為尿液配制的β-hCG標準品。
[0023]在本發明的另一方面，還提供了一種上述試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0024](I)抗β -hCG單克隆抗體包被酶標板的制備:
[0025]將抗β -hCG單克隆抗體在包被液中透析，再加入到酶標板上，于2_8°C包被48小時以上；用清洗液清洗酶標板后，加入封閉保護液，室溫封閉20小時以上；甩干封閉保護液干燥密封，置于2-8°C冰箱備用；
[0026](2)三價銪標記的抗a -TSH單克隆抗體的制備:
[0027]將抗C1-TSH單克隆抗體，用標記液進行透析，取透析好的抗a-TSH單克隆抗體，用標記液稀釋；將抗體加入到凍干的銪標記液中緩慢搖勻后置于2-8°C冰箱中過夜；用純化柱純化2-8°C過夜的標記液，收集標記物，加入0.1 % BSA置于_80± 10°C冷凍保存備用；
[0028](3) β -hCG校準品的制備:
[0029]用3-1^6干粉和陰性尿液配制濃度為0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β -hCG校準尿液，置于_80± 10°C冷凍保存備用；
[0030]所述清洗液、分析液和增強液為市售商品。
[0031]作為本發明優選的技術方案，步驟(2)中，所述將抗體加入到凍干的銪標記液中，其中抗體與銪標記液的重量比例為(6-10):1。
[0032]作為本發明優選的技術方案，步驟(2)中，所述用純化柱純化2_8°C過夜的標記液，收集標記物具體為:取純化柱，用洗脫液洗脫平衡至少2小時，將2-8°C過夜的標記液全部轉入柱子的頂端，重力自然洗脫，以0.25ml/管為單位進行收集。
[0033]在本發明的另一方面，還提供該試劑盒在檢測β-hCG含量中的應用，該檢測方法包括如下步驟:
[0034](I)將β -hCG校準品和待檢樣品依次加入到抗β -hCG單克隆抗體包被的酶標板上，再加入分析液，震蕩孵育；
[0035](2)將清洗液用去離子水進行稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標板并甩干；
[0036](3)將純化好的三價銪標記的抗a-TSH單克隆抗體，用分析液稀釋，加入酶標板中，震湯鮮育；
[0037](4)用清洗液清洗酶標板并甩干；
[0038](5)加入增強液，使用全自動時間分辨熒光免疫分析儀檢測熒光信號；
[0039](6)根據熒光數值建立標準曲線，將待檢樣品的熒光信號代入到標準曲線中，求得待檢樣品的濃度。
[0040]上述術語說明如下:
[0041]本發明所述的“分析液”:Assay Buffer,市售商品，采購自Perkin Elmer,貨號:4002-0010。在檢測時使用的緩沖液。
[0042]本發明所述的“清洗液”:Wash Solut1n,市售商品,采購自Perkin Elmer,貨號:B117-100。用于酶標板清洗的溶液。
[0043]本發明所述的“增強液” !Enhancement Solut1n,市售商品，采購自PerkinElmer，貨號:Β118_100。可使標記物從反應復合物上解離下來的溶液。
[0044]本發明所述的“包被液”:可自行配制，用于將抗體包被在酶標板上的溶液。
[0045]本發明所述的“標記液”:可自行配制，用于將抗原與標記物結合到一起的溶液。
[0046]本發明所述的“封閉保護液”:可自行配制，用于將包被在酶標板上的抗體封閉保護在酶標板上的溶液。
[0047]本發明所述的“洗脫液”:可自行配制，用于洗脫平衡ro1柱子的溶液。
[0048]和現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0049]I使用本發明能夠準確定量檢測QC標準品中β -hCG含量，即確認標準品性能，為準確檢測hCG測試筆提供保障，增加了企業對hCG測試筆的質量控制，避免了因標準品問題引起的產品質量調查、返工、客戶投訴等，節約了企業的人力、物力和時間成本，具有良好的經濟效益。
[0050]2使用本發明也能夠用于定量檢測尿液中β-hCG的含量，對于早期判斷妊娠、流產、宮外孕等起到一定幫助，定量檢測尿液中β-hCG的含量相比檢測血液中的β-hCG的含量，其取樣更簡便，操作性更強。
[0051]3與現有技術相比，本發明可利用AutoDELFIA1235(全自動時間分辨熒光免疫分析儀)進行全自動操作，操作簡單省時，加樣量小(50ul/份)；靈敏度高，可達到0.0lmIU/ml ;準確性好，標準曲線R2值接近1，線性穩定，由標準曲線擬合出的回歸方程準確，便于樣品濃度計算；無輻射污染；檢測樣品量大，一次可最多檢測953份樣品。
[0052]4.本發明檢測范圍廣，可檢測β-hCG含量范圍為O?3500IU/ml。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0053]圖1是時間免疫熒光試劑盒的原理示意圖；
[0054]圖2是本發明一種檢測β -hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒的結構示意圖；
[0055]圖3是本發明的試劑瓶的結構示意圖；
[0056]圖4是本發明的酶標板的結構示意圖；
[0057]圖5是本發明實施例1中的洗脫曲線示意圖；
[0058]圖6是本發明實施例2中熒光數值建立標準曲線示意圖。
[0059]圖中附圖標記說明:
[0060]I是裝有分析液的試劑瓶，2是裝有清洗液的試劑瓶，3是裝有增強液的試劑瓶，4是裝有包被液的試劑瓶，5是裝有封閉保護液的試劑瓶，6是裝有洗脫液的試劑瓶，7是裝有β-hCG校準品的試劑瓶，8是裝有標記的抗a-TSH單克隆抗體的試劑瓶，9是酶標板，11是包被在酶標板上的抗β-hCG單克隆抗體，12是待測樣品中的β-hCG抗原，13是三價銪離子(Eu3+)標記的抗a-TSH單克隆抗體，14是雙抗體夾心法免疫復合物，15是含銪的熒光物質，21是5ml試劑瓶，22是30ml試劑瓶，91是加樣孔，92是保護膜。
【具體實施方式】
[0061]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
[0062]如圖1所示,本發明的原理是雙抗體夾心法,具體包括如下步驟:將抗β -hCG單克隆抗體包被到96孔酶標板上,形成包被在酶標板上的抗β -hCG單克隆抗體11,標記物是三價銪離子(Eu3+)標記的抗α-TSH單克隆抗體3，待測樣品中的β-hCG抗原12先與包被在酶標板上的抗β -hCG單克隆抗體I反應(震蕩、洗板)，然后與Eu3+標記的抗a -TSH單克隆抗體13反應(震蕩、洗板)，形成雙抗體夾心法免疫復合物14，加入增強液震蕩反應，加入含銪的熒光物質15在熒光檢測設備如AutoDELFIA1235上讀熒光信號，進行TRFIA檢測從而確定標準品中β -hCG的濃度。
[0063]如圖2所示，本發明的一種檢測β -hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內設有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標板9的隔層；所述盒體內設有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內放置有:裝有分析液的試劑瓶I ;裝有清洗液的試劑瓶2 ;裝有增強液的試劑瓶3 ;裝有包被液的試劑瓶4 ;裝有封閉保護液的試劑瓶5 ;裝有洗脫液的試劑瓶6 ;裝有β-hCG校準品的試劑瓶7 ;裝有標記的抗a-TSH單克隆抗體的試劑瓶8。
[0064]如圖3所示，試劑瓶采用5ml試劑瓶21或30ml試劑瓶22。5ml試劑瓶21是塑料廣口瓶(采用聚丙烯材質)。30ml試劑瓶22是塑料離心管(采用聚丙烯材質)。
[0065]如圖4所示，酶標板9為帶保護膜92的96孔酶標板，有96個加樣孔91。
[0066]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按重量計。
[0067]實施例1試劑盒的制備
[0068]上述試劑盒的制備方法如下:
[0069]1.200mmol/L pH = 6.8±0.1 包被液的配制
[0070]將35.08g Na2HPO4.12Η20、5.91g NaH2PO4.2H20 和 9g NaCl 加入到 600ml 去離子水中，用IN HCl和IN NaOH調整PH值至6.8 ±0.1，定容到1L。
[0071]2.50mmol/L pH = 6.8封閉保護液的配制
[0072]將8.77g Na2HPO4.Iffi2O 和 3.98g NaH2PO4.2H20 加入到 600ml 去離子水中，再依次加入Ig BSA(牛血清白蛋白)，60g Trehalose (海藻糖)和Ig Diazolidinyl Urea(雙咪唑烷基脲)，待完全溶解后調整PH值至6.8±0.1，定容到1L。
[0073]3.100mmol/L pH = 9.3Eu3+標記液的配制
[0074]將2.12g Na2CO3 和 6.72g NaHCO3 加入到 600ml 去離子水中，用 IN HCl 和 IN NaOH調整PH值至9.3±0.1，定容到IL0
[0075]4.50mmol/L pH = 7.8±0.1 洗脫液的配制
[0076]將6.057g Tris，9g NaCl 和 345ml 0.1N HCl 加入 600ml 去離子水中，用 IN HCl和IN NaOH調整PH值至7.8±0.1，定容到IL0
[0077]5.抗β -hCG單克隆抗體包被酶標板的制備
[0078]5.1從冰箱中取出抗β -hCG單克隆抗體(采購自AlereSanDiego，貨號:3468，作為包被抗體使用)，用200mmol/L pH = 6.8±0.1的包被液進行透析，將透析好的抗β _hCG單克隆抗體在紫外分光光度計下測定濃度，然后用此包被液將抗體稀釋到8μ g/ml，混勻備用。
[0079]5.2取出96孔酶標板，恢復至室溫，每孔加入150 μ I用包被液稀釋好的8 μ g/ml抗β -hCG單克隆抗體，將96孔酶標板置于2-8°C包被48小時以上。
[0080]5.3取出96孔酶標板，將液體甩干，用1:25清洗液清洗3次，甩干，仔細檢查孔中不能存有液體。每孔加入200 μ I 50mmol/L pH = 6.8±0.1的封閉保護液，于室溫封閉20小時以上。
[0081]5.4取出96孔酶標板，將封閉保護液甩干，放入自封袋中并同時放入適量的干燥劑，2-8 °C冰箱干燥備用。
[0082]6.抗a-TSH單克隆抗體的三價銪(Eu3+)標記
[0083]6.1將抗a -TSH單克隆抗體(采購自AlereSanDiego，貨號:3299，作為標記抗體使用)，用100mmol/L pH = 9.3±0.1的標記液進行透析。
[0084]6.2取透析好的抗a -TSH單克隆抗體,用標記液稀釋至1.2mg/ml。
[0085]6.3按照抗體與銪標(6-10):1的結合比例，將1.2mg/ml抗a -TSH單克隆抗體加入到凍干的Eu-Labelling Reagent (銪標記液)中，緩慢搖勻，置于2_8°C冰箱中過夜,待用。
[0086]6.3 取 PD-10(S印hadex G-50M 填料)純化柱，用 50 m mol/L PH = 7.8±0.I 的洗脫液洗脫平衡至少2小時。
[0087]6.4將2_8°C過夜的標記液(含抗a -TSH單克隆抗體)全部轉入柱子的頂端，重力自然洗脫，以0.25ml/管為單位進行收集。收集好后，每管取10 μ L依次加入到96孔酶標板中，用AutoDELFIA 1235 (全自動時間分辨熒光免疫分析儀)進行熒光讀數，將所得數據利用Excel (或其它軟件)進行描繪曲線。
[0088]6.5按照圖5的洗脫曲線，收集兩個箭頭中間的部分用于檢測，把兩個箭頭中間的部分合并后，根據體積估算，加入總體積0.1 %的BSA，_80± 10°C冷凍保存備用。
[0089]7.β-hCG校準品(濃度已知，用于建立標準曲線)
[0090]用β-hCG干粉(來源于世界衛生組織WHO)和陰性尿液配制濃度為0、15、25、37.5,50,75和100mIU/ml的β -hCG校準尿液，_80± 10°C冷凍保存備用。
[0091]8.分析液(市售商品)Assay Buffer,采購自 Perkin Elmer,貨號:4002_0010。
[0092]9.清洗液(市售商品)Wash Solut1n,采購自 Perkin Elmer,貨號:Β117_100。
[0093]10.增強液(市售商品)Enhancement Solut1n,米購自 Perkin Elmer,貨號:B118-100。
[0094]實施例2試劑盒的應用
[0095]本發明還提供了試劑盒的應用方法:
[0096]1.將濃度為0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β -hCG校準品和待檢樣品依次加入到抗β -hCG單克隆抗體包被的酶標板上，每個校準品和待檢樣品重復三孔，每孔加樣50 μ 1，再加入150 μ I分析液，震蕩孵育30分鐘。
[0097]2.將清洗液用去離子水進行25倍稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標板3次并甩干。
[0098]3.將純化好的三價銪標記的抗a -TSH單克隆抗體，用分析液1:100稀釋，200 μ I/孔加入酶標板中，震蕩孵育30分鐘。
[0099]4.用1:25清洗液清洗酶標板6次并甩干。
[0100]5.每孔加入300 μ I增強液，使用AutoDELFIA 1235檢測熒光信號。
[0101]6.使用EXCEL或其他軟件，根據熒光數值建立標準曲線(見圖6)，將待檢樣品的熒光信號代入到標準曲線中，可求得待檢樣品的濃度，即檢測出β -hCG的含量。
【權利要求】
1.一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，其特征在于，所述盒體內設有放置包被抗β-hCG單克隆抗體的酶標板的隔層；所述盒體內設有放置試劑瓶的容器孔，所述容器孔內放置有: 裝有分析液的試劑瓶； 裝有清洗液的試劑瓶； 裝有增強液的試劑瓶； 裝有β -hCG校準品的試劑瓶； 裝有標記的抗a-TSH單克隆抗體的試劑瓶。
2.如權利要求1所述的一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述容器孔內還放置有:裝有包被液的試劑瓶、裝有封閉保護液的試劑瓶、以及裝有洗脫液的試劑瓶。
3.如權利要求1所述的一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述酶標板為帶保護膜的96孔酶標板。
4.根據權利要求1所述的一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述抗β-hCG單克隆抗體的濃度為l-10yg/ml。
5.根據權利要求1所述的一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述標記的抗a -TSH單克隆抗體的標記物是三價銪離子。
6.根據權利要求1或5所述的一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述標記的抗a-TSH單克隆抗體中抗體與標記物的標記重量比例是(6-10):1。
7.根據權利要求1所述的一種檢測β-hCG含量的時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述β-hCG校準品為尿液配制的β-hCG標準品。
8.一種根據權利要求5所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)抗β-hCG單克隆抗體包被酶標板的制備: 將抗β-hCG單克隆抗體在包被液中透析，再加入到酶標板上，于2-8°C包被48小時以上；用清洗液清洗酶標板后，加入封閉保護液，室溫封閉20小時以上；甩干封閉保護液干燥密封，置于2-8°C冰箱備用； (2)三價銪標記的抗a-TSH單克隆抗體的制備: 將抗a-TSH單克隆抗體，用標記液進行透析，取透析好的抗a-TSH單克隆抗體，用標記液稀釋；將抗體加入到凍干的銪標記液中緩慢搖勻后置于2_8°C冰箱中過夜；用純化柱純化2-8°C過夜的標記液，收集標記物，加入0.1 % BSA置于_80± 10°C冷凍保存備用； (3)β-hCG校準品的制備: 用@-1^6干粉和陰性尿液配制濃度為0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校準尿液，置于_80±10°C冷凍保存備用； 所述清洗液、分析液和增強液為市售商品。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述將抗體加入到凍干的銪標記液中，其中抗體與銪標記液的重量比例為(6-10):1。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述用純化柱純化2_8°C過夜的標記液，收集標記物具體為:取純化柱，用洗脫液洗脫平衡至少2小時，將2_8°C過夜的標記液全部轉入柱子的頂端，重力自然洗脫，以0.25ml/管為單位進行收集。
11.一種根據權利要求1所述的試劑盒在檢測β-hCG含量中的應用，其特征在于，該檢測方法包括如下步驟: (1)將β-hCG校準品和待檢樣品依次加入到抗β -hCG單克隆抗體包被的酶標板上，再加入分析液，震蕩孵育； (2)將清洗液用去離子水進行稀釋，然后用已稀釋的清洗液清洗酶標板并甩干； (3)將純化好的三價銪標記的抗a-TSH單克隆抗體，用分析液稀釋，加入酶標板中，震蕩孵育； (4)用清洗液清洗酶標板并甩干； (5)加入增強液，使用全自動時間分辨熒光免疫分析儀檢測熒光信號； (6)根據熒光數值建立標準曲線，將待檢樣品的熒光信號代入到標準曲線中，求得待檢樣品的濃度。
【文檔編號】G01N33/531GK104181310SQ201410368022
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年7月30日
【發明者】趙金博, 張展英, 周蓓昕 申請人:美艾利爾（上海）診斷產品有限公司