利用陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液測定多巴胺方法
【專利摘要】一種利用陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液測定多巴胺的方法，屬于熒光分析檢測【技術領域】。本發明測定方法的技術特征是：將陽離子型二苯丙氨酸溶解于六氟異丙醇溶劑，然后加入甲苯使之凝膠化，干燥后分散于Tris-HCl緩沖溶液，使陽離子型二苯丙氨酸自組裝成納米球并得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液；陽離子型二苯丙氨酸與多巴胺之間可發生熒光共振能量轉移，將多巴胺加入陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液中可使膠體溶液的熒光強度降低，利用多巴胺濃度與膠體溶液熒光強度變化值之間的定量關系，可以實現對多巴胺的定量檢測。本發明測定方法無需熒光標記物，環境友好，操作簡單，此外還具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強，重現性好等優點。
【專利說明】利用陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液測定多巴胺方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液測定多巴胺的方法，屬于熒光分析檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002]多巴胺是神經系統中重要的兒茶酚胺神經遞質之一，多巴胺濃度水平不正常可導致帕金森病、精神分裂癥等，同時多巴胺濃度也反映了體系內酪氨酸的生物降解水平。因此多巴胺的檢測具有重要的臨床意義。多巴胺的檢測方法有電化學法、電致化學發光法、比色法、熒光法等，其中熒光法檢測限低且具有良好的選擇性而備受關注。但已報道的熒光檢測體系多使用到量子點、石墨烯、碳納米管、Au納米顆粒等，這些材料往往生物相容性較差甚至具有較大的毒性。
[0003]二苯丙氨酸及其衍生物(陽離子型二苯丙氨酸等)具有容易自組裝、生物相容性好、表面官能團豐富且容易進行化學修飾等特點，近年來二苯丙氨酸及其衍生物的自組裝結構引起了人們的極大興趣和關注，在分析領域也展現了廣闊的應用前景。如Jae HongKim等人將二苯丙氨酸和鑭系元素復合物結合，二苯丙氨酸和光敏劑產生協同效應，增強了鑭系元素本身的發光強度，同時也提高了檢測神經毒素的選擇性(Jae Hong Kim，JungkiRyu, Chan Beum Park, Small, 2011, 7: 718-722)。
[0004]二苯丙氨酸及其衍生物的發射光譜與多巴胺的吸收光譜有重疊，兩者間可以發生熒光共振能量轉移。所謂熒光共振能量轉移是指發生在供體和受體之間長距離偶極-偶極相互作用的非輻射能量轉移，導致供體的熒光強度降低，受體熒光增強或不發出熒光。熒光共振能量轉移具有距離依賴性，熒光共振能量轉移的效率與分子間距離的六次方成反比，因此基于熒光共振能量轉移原理的熒光分析方法通常具有較高的靈敏度和選擇性。但基于熒光共振能量轉移原理，利用二苯丙氨酸或其衍生物直接對底物進行熒光分析檢測的工作未見報道。


【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種利用陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液測定多巴胺的方法，其特征在于，先使陽離子型二苯丙氨酸凝膠化并干燥，然后將其分散于Tris-HCl緩沖溶液中自組裝成納米球，得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液，根據加入多巴胺前后膠體溶液熒光強度的變化來實現對多巴胺的定量檢測。具體操作步驟如下。
[0006](I)陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液的制備:將陽離子型二苯丙氨酸粉末溶解于六氟異丙醇溶劑中，超聲分散1(Γ20分鐘，獲得濃度為9(T110 mg/mL的陽離子型二苯丙氨酸溶液，按照陽離子型二苯丙氨酸溶液與甲苯體積比為l:3(Tl:40的比例關系將二者混合，超聲處理直到全部凝膠化；將此凝膠在室溫條件真空干燥8?12小時，得到干凝膠，將干凝膠分散于Tris-HCl緩沖溶液并超聲分散1(Γ20分鐘，得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液，其中陽離子型二苯丙氨酸的濃度為0.2?0.3 mg/mL。
[0007](2)利用陽離子型二苯丙氨酸與多巴胺之間可發生熒光共振能量轉移的原理進行多巴胺檢測，即作為供體的陽離子型二苯丙氨酸與受體多巴胺之間發生非輻射能量轉移，使陽離子型二苯丙氨酸的熒光強度降低，具體而言，在258 nm的激發光激發下，陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液產生熒光，加入多巴胺后膠體溶液的熒光強度降低，且膠體溶液熒光強度的變化值與膠體溶液中多巴胺的濃度在一定范圍內呈線性關系，由此可繪制出膠體溶液熒光強度變化值與多巴胺濃度之間的標準工作曲線；利用該標準工作曲線可以實現對待測體系中多巴胺的定量檢測。其中測試熒光強度時選取的發射波長測試范圍為275?290 nm，優選282 nm ;在測試開始，即激發光開始照射后的15?30分鐘的時間內記錄熒光強度。
[0008]本發明方法的特點與優勢在于:本發明提供了一種以陽離子型二苯丙氨酸為供體，多巴胺為受體，利用熒光共振能量轉移直接檢測多巴胺的方法(其工作原理如圖1所示)；與文獻報道的多巴胺熒光檢測方法相比，具有無需標記物、靈敏度高、檢測范圍較寬、抗干擾能力強、重現性良好等優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是本發明檢測多巴胺的原理示意圖。
[0010]圖2為本發明實施例1中陽離子型二苯丙氨酸納米球的透射電鏡照片。
[0011]圖3為本發明實施例1中陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液中多巴胺的濃度與熒光強度變化值的關系圖。橫坐標為以10為底的多巴胺的濃度的對數，即Log[多巴胺濃度/ (納摩爾/升)];縱坐標為加入多巴胺前后熒光強度的變化值，簡寫為熒光強度的變化值，單位為:絕對單位(a.u.)。
[0012]圖4為本發明實施例1中加入各干擾物后熒光強度變化量的示例圖。其中DA是多巴胺，加入的干擾物有抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)、腎上腺素(AD)、去甲腎上腺素(NAD)、鄰苯二酚(Catl)、尿素(Urea)、還原型谷胱甘肽(GSH)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、乳酸(LA)、葡萄糖(Glc)、鹿糖(Sac)、丙酮(Ace)、Na+、K+、Cu2+、Zn2+。橫坐標為加入多巴胺或干擾物前膠體溶液的熒光強度與加入多巴胺或干擾物后膠體溶液的熒光強度比值，簡寫為熒光強度比值。

【具體實施方式】
[0013]實施例1:陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液的制備:將10 mg陽離子型二苯丙氨酸溶解于100 μ L六氟異丙醇溶劑中，超聲分散10分鐘使其全部溶解,獲得濃度為100mg/mL的陽離子型二苯丙氨酸溶液；快速移取上述配好的溶液10 μ L加入到I mL離心管中，往該離心管加入300 μ L甲苯溶劑，超聲直到全部凝膠化；將此凝膠在室溫條件真空干燥12小時，得到干凝膠，分散于4 mL的Tris-HCl緩沖溶液中(pH為6.5)，并超聲15分鐘，得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液，其中陽離子型二苯丙氨酸的濃度為0.25 mg/mL。陽離子型二苯丙氨酸納米球的透射電鏡照片如圖2所示。
[0014]在258 nm的激發光激發下，陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液產生熒光，加入多巴胺后膠體溶液的熒光強度降低，且膠體溶液熒光強度的變化值與膠體溶液中多巴胺的濃度在一定范圍內呈線性關系，由此可繪制出膠體溶液熒光強度變化值與多巴胺濃度之間的標準工作曲線如圖3所示；利用該標準工作曲線可以實現對待測體系中多巴胺的定量檢測。該熒光傳感器的線性范圍為0.05?30 μπιοΙ/L和3(Γ300 μ mol/L，加入多巴胺或干擾物前膠體溶液的熒光強度與加入多巴胺或干擾物后膠體溶液的熒光強度比值如圖4所示，其中加入濃度為10 μ mol/L的干擾物抗壞血酸時熒光強度比值為1.009。
[0015]實施例2:陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液的制備:將11 mg陽離子型二苯丙氨酸溶解于100 μ L六氟異丙醇溶劑中，超聲分散20分鐘使其全部溶解，獲得濃度為110mg/mL的陽離子型二苯丙氨酸溶液；快速移取上述配好的溶液10 μ L加入到I mL離心管中，往該離心管加入400 μ L甲苯溶劑，超聲直到全部凝膠化；將此凝膠在室溫條件真空干燥10小時，得到干凝膠，分散于4.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液中(pH為7.0)，并超聲20分鐘，得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液，其中陽離子型二苯丙氨酸的濃度為0.24mg/mL。
[0016]在258 nm的激發光激發下，陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液產生熒光，加入多巴胺后膠體溶液的熒光強度降低，且膠體溶液熒光強度的變化值與膠體溶液中多巴胺的濃度在一定范圍內呈線性關系，由此可繪制出膠體溶液熒光強度變化值與多巴胺濃度之間的標準工作曲線；利用該標準工作曲線可以實現對待測體系中多巴胺的定量檢測。該測試體系加入濃度為10 μ mol/L干擾物抗壞血酸時熒光強度比值為1.057。
【權利要求】
1.一種利用陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液測定多巴胺的方法，其特征在于，先使陽離子型二苯丙氨酸凝膠化并干燥，然后將其分散于TriS-HCl緩沖溶液中自組裝成納米球，得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液，根據加入多巴胺前后膠體溶液熒光強度的變化來實現對多巴胺的定量檢測，具體操作步驟如下: (1)陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液的制備:將陽離子型二苯丙氨酸粉末溶解于六氟異丙醇溶劑中，超聲分散10?20分鐘,獲得濃度為90?110 mg/mL的陽離子型二苯丙氨酸溶液，按照陽離子型二苯丙氨酸溶液與甲苯體積比為1:30?1:40的比例關系將二者混合，超聲處理直到全部凝膠化；將此凝膠在室溫條件真空干燥8?12小時，得到干凝膠，將干凝膠分散于Tris-HCl緩沖溶液并超聲分散10?20分鐘，得到陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液，其中陽離子型二苯丙氨酸的濃度為0.2?0.3 mg/mL ； (2)在258nm的激發光激發下，陽離子型二苯丙氨酸納米球膠體溶液產生熒光，加入多巴胺后膠體溶液的熒光強度降低，且膠體溶液熒光強度的變化值與膠體溶液中多巴胺的濃度在一定范圍內呈線性關系，由此可繪制出膠體溶液熒光強度變化值與多巴胺濃度之間的標準工作曲線；利用該標準工作曲線可以實現對待測體系中多巴胺的定量檢測。
2.根據權利要求1所述測定多巴胺的方法，其特征在于，利用陽離子型二苯丙氨酸與多巴胺之間可發生熒光共振能量轉移的原理進行多巴胺檢測，即作為供體的陽離子型二苯丙氨酸與受體多巴胺之間發生非輻射能量轉移，使陽離子型二苯丙氨酸的熒光強度降低。
3.根據權利要求1所述測定多巴胺的方法，其特征在于，在步驟(2)中，測試熒光強度時選取的發射波長測試范圍為275?290 nm，優選282 nm ;在測試開始，即激發光開始照射后的15?30分鐘的時間內記錄熒光強度。
【文檔編號】G01N21/64GK104165870SQ201310186294
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月20日 優先權日:2013年5月20日
【發明者】楊文勝, 張雪琪 申請人:北京化工大學