專利名稱：牛肺炎支原體的診斷試劑及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物診斷醫學，特別涉及牛肺炎支原體的診斷技術。
背景技術：
牛肺炎支原體(Mycoplasma bovis, MB)屬于原核生物界,厚壁菌門，柔膜體綱,支原體目，支原體科，支原體屬，是目前發現最小和最簡單的能自主復制的原核生物。60年代首次有報道稱牛肺炎支原體引起牛發生肺炎和乳腺炎，在這之后人們發現MB還可導致牛發生關節炎、角膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產等多種疾病。國外報道每年由牛呼吸道疾病引起的經濟損失其中至少四分之一是由牛肺炎支原體引起，特別是在牛運輸環節，全群發病率高達90%以上，持續時間長達三個月以上，嚴重影響牛的生長發育。目前，牛肺炎支原體疫苗并未得到推廣的情況下，早診斷早隔離是控制牛肺炎支原體群體感染的有效措施。因此，對牛肺炎支原體有效的診斷方法將直接影響到養牛業的經濟效益。常見的牛肺炎支原體的臨床檢測方法:生物學檢測、免疫學檢測、以及分子生物學檢測。牛肺炎支原體在機體內兼性厭氧、對營養要求極其嚴格，培養時須從體外攝取如膽固醇、脂肪酸、核糖前體、維生素等大分子物質，若病料保存不當則實驗室常規分離鑒定十分困難，故實驗室生物學檢測的方法臨床并不適用。分子生物學檢測操作復雜繁瑣，對儀器設備、實驗室條件、以及實驗人員的技術要求高，檢測成本亦相應增加，也難以在基層和養殖場大規模開展。所以，免疫學檢測抗牛肺炎支原體抗體是目前診斷牛肺炎支原體感染的主要措施。免疫學方法檢測抗體最常見的檢測模式是間接酶聯免疫分析(ELISA)。而決定間接ELISA是否有效的關鍵在于抗原的選擇。間接ELISA檢測病原體抗體所用的抗原按照其來源和性質可分為三類:全毒、重組表達蛋白、合成肽，合成肽的制備成本較高，所以不適合大規模生產應用，因此間接ELISA檢測抗體所用的抗原主要是全毒和基因重組表達的病原體蛋白。但以全毒作為包被抗原同時也具有培養條件要求高、有散毒隱患、批間差異大、具有一定的非特異性反應的缺點，尤其是對于牛肺炎支原體，難以控制的體外培養條件限制了全毒作為捕獲抗原的應用。重組表達蛋白作為捕獲抗原的優點在于目的蛋白的反應特異性高，且一旦技術路線成熟，可大量穩定的制備，成本低，適合工業化生產的應用。目前已經商品化的牛肺炎支原體抗體檢測試劑盒或已經報道的牛肺炎支原體抗體檢測方法均為利用基因重組技術制
備的病原體蛋白，主要分為兩類-膜黏附蛋白(Variable surface Lipoprotein,VSP)和
月吳蛋白。傳統的重組表達蛋白的技術路線都是針對某一種蛋白，其往往選擇經實驗驗證免疫原性強、抗體應答持續時間長、且不同亞型之間相對保守的蛋白作為標靶。但即便如此，理論上仍舊只能捕獲和檢測針對一種病毒蛋白的抗體。所以采用不同的蛋白作為標靶，檢測結果就有可能不 一致，包括陽性程度(即抗體滴度)、甚至是漏檢(假陰性)。對于牛肺炎支原體而言，一個更為突出的問題是由于牛肺炎支原體的基礎研究相對滯后，目前尚未能明確該病原體感染后誘導機體產生抗體的優勢和保守抗原一即迅速誘導產生抗體而且抗體產生的持續時間長，感染過程中抗原也不容易發生變異。例如，目前已有報道的VSP雖然具有很強的免疫原性，但卻容易出現變異而影響檢測的準確性。所以，采用傳統的技術路線制備某一種特定的病原體蛋白作為捕獲抗原，其檢測結果就很有可能不能準確反映病原體真實的感染情況。

發明內容
有鑒于此，本發明提供一種重組表達蛋白，其為多表位抗原，其能特異性捕獲牛肺炎支原體抗體。為實現上述目的，本發明的技術方案為:多表位融合抗原，所述多表位融合抗原的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:1所不,或所述多表位融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所不。本發明所設計的多表位融合抗原，基于已有的牛肺炎支原體全基因組研究為基礎，進行了充分的生物信息學分析，尋找到了一種可用于檢測牛肺炎支原體抗體的牛肺炎支原體假定膜蛋白P33，截取其特異且保守部位的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。SEQID NO:1所示氨基酸的進一步縮寫如下:“EAKSDNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNK TEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKINEN TDEKNSSETMNNKQKQDKSSIESKMKEKTEKQDSKTNSEKQDSETDDSSNEL TIPSESTPKDMPTEN”在此基礎上，結合已探明的牛肺炎支原體膜蛋白P30，設計了一種融合了不同牛肺炎支原體蛋白B細胞表位的抗原——即多表位融合抗原的重組蛋白，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。SEQ ID NO:2所示氨基酸的進一步縮寫如下:“EAKSDNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKA DNKTEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKIN ENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIESKMKEKTEKQDSKTNSEKQDSETDDSSN ELTIPSESTPKDMPTENGPGPGNDKKEEKKKVEEPAKQAEGAGTCDKTTSASG TANSNGASSNSTNAQKTDEKEIKETSDSPKKDGEKVSDKHKVAGPGPGKDIK DEDLIPPKTGNNKQVFFDTRDOTTKLSGKFKGKLPWGPGPGPIHKNRKGKIK ASGFVNVEKE⑶KLKIKFRFFKYNKGASP”。其中，如SEQ ID NO:1所示的肽段A是如SEQ ID NO:2所示的肽段B的截短片段。經抗原特異性分析證實，如SEQ ID NO:1所示的肽段A為牛肺炎支原體抗體的特異性抗原，分析結果詳見圖1。多表位融合抗原首先建立在對牛肺炎支原體全集因組序列進行充分分析的基礎上，針對P33和P30基因進行與其他支原體特異性的驗證；對牛肺炎支原體P33和P30進行基因優化和重組表達，并驗證兩個重組蛋白的免疫原性。其次根據P33和P30氨基酸序列分析結果，建立多表位融合抗原蛋白的氨基酸一級結構。

本發明的目的之二在于提供兩種種多表位融合抗原蛋白的應用，該應用為診斷牛肺炎支原體技術提供了新思路。同時，根據該應用，制備了牛肺炎支原體診斷試劑，其具有較高的特異性和敏感性。為實現上述目的，本發明的技術方案為:
所述的多表位融合抗原在制備牛肺炎支原體診斷試劑中的應用。進一步，牛肺炎支原體診斷試劑，所述牛肺炎支原體診斷試劑為牛肺炎支原體抗體的特異性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2任一所示。所述的多表位融合抗原和辣根過氧化物酶標記羊抗牛的IgG聯合在檢測牛肺炎支原體抗體中的應用。該聯合運用被證實是最佳的抗體配對。牛肺炎支原體診斷試劑是通過如下思路制備的:確定多表位融合抗原蛋白的氨基酸序列基礎上，反向將其翻譯成核苷酸序列，人工合成所需基因片段并測序驗證，克隆后通過雙酶切與表達載體pET-28a連接，轉染至BL21 (DE3) codon plus,通過卡那抗性篩選、發酵、IPTG誘導表達，獲得目的抗原。該抗原為胞內表達，超聲破菌后收集菌液，依次通過鎳金屬螯合層析、Q-HP層析、重復鎳金屬螯合層析得到電泳純的抗原。以純化的抗原作為捕獲抗原進行包被酶標板，檢測牛肺炎支原體抗體陽性樣本，同時設置不包被該抗原的對照，以此驗證該抗原蛋白的敏感性和特異性。更多信息參見分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)。本發明的目的之三在于提供一種診斷試劑盒，其能準確的檢測牛肺炎支原體抗體。含有所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，所述試劑盒為ELISA試劑盒，包括包被有包被抗原的固相載體，酶標二抗和顯色底物，所述包被抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示。該試劑盒是基于間接ELISA法的原理設計的。其中，所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒中的所述酶標二抗為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或半乳糖苷酶標記的標記的抗牛IgG。其中，所述的 牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒中所述酶標二抗優選為辣根過氧化物酶標記羊抗牛的IgG。本發明的目的之四在于提供一種牛肺炎支原體抗體的檢測方法，該方法為判斷涉及畜牧牛來源的食品的安全提供了檢測保障技術。運用所述的試劑盒檢測牛肺炎支原體抗體的方法，具體包括以下步驟:A固相載體的包被將所述包被抗原用包被抗原稀釋液稀釋后，包被于固定載體上，在固相載體上添加待測樣品孵育，再加入所述酶標二抗孵育，加入顯色底物反應充分后，用所述終止液終止反應;B讀取數據用儀器分別讀取待測樣品組和標準樣品組的數值，通過與已知含量的標準樣品或陰性對照品比較，求得待測樣品的牛肺炎支原體抗體含量或判定待測樣品是否為陽性。對于結果是否屬于正常或非正常的判定標準，可以采用一切可實現的定性或定量方法。優選的所述的方法中，所述步驟A中，所述包被抗原純度以質量計算為95%時，所述包被抗原被稀釋成濃度為1-10 μ g/ml，酶標二抗為稀釋濃度以體積計為1: 2000-3000的辣根過氧化物酶標記羊抗牛的IgG，所述顯色底物為辣根過氧化物酶的顯色底物。HRP標記的羊抗牛IgG干粉購自美國KPL公司(貨號14-12-06)，按照附帶的說明書所述的步驟重懸成貯存液后，以沖洗緩沖液稀釋2000-3000倍。在上述稀釋配比下，檢測結果最佳。例如，待測樣品為牛奶，用酶標儀在450nm波長下讀取待測樣品數據，在實驗有效的前提下，IRPC ^ 20為陽性樣本，反之為陰性樣本。另外，待測樣品可以為血清、尿液等體液。本發明的有益效果:1)同生物學檢測、以及分子生物學檢測相比較，本方法操作簡便，無需依靠復雜的儀器設備，對實驗室條件、以及實驗人員的技術要求不高，檢測成本相對較低，適合于基層和養殖場大規模開展。2)在抗原的種類選擇方面，同合成肽相比,本多表位融合抗原制作成本低，適合大規模應用；同全毒相比，在保證靈敏度的前提下特異性高，批間差異小，也不像全度一樣需要要求較高的培養條件。3)本多表位融合抗原適合作為血清學的檢測重組抗原。4)采用多表位作為標靶，其檢測結果一致性高。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。圖1為SEQ ID NO:1氨基酸序列抗原特異性分析圖。圖2為牛肺炎支原體P33蛋白氨基酸序列抗原特異性分析圖。圖3為牛肺炎支原體P30蛋白氨基酸序列抗原特異性分析圖。圖4 為 BamHI/Not I 酶切質粒 pMD18_T_P33。圖5 為 BamHI/Xho I 酶切質粒 pMD18-T_P30。圖6為P33蛋白在BL21 (DE3)菌中28°C表達SDS-PAGE電泳圖；其中，M =ProteinRuler II ；Lane1:未加入 IPTG ；Lane2:加入 IPTG 誘導 5h。圖7為P30蛋白在BL21 (DE3)菌中28°C表達SDS-PAGE電泳圖；其中，M =ProteinRuler II ；Lane1:加入 IPTG 誘導 5h ；Lane2:未加入 IPTG0圖 8 為 MbP33 蛋白 Western-Blotting 圖；其中 M:EasySee Western Marker ；Lanel:未加入 IPTG BL21 (DE3) pET_28a_P33 菌體蛋；Lane2:加入 IPTG 誘導 5h 后的BL21(DE3)菌體蛋白。圖 9 為 MbP30 蛋白 Western-Blotting 圖，M:EasySee Western Markek ； Lane I:pET-28a-P30 融合蛋白質(27kDa+20kDa) ；Lane2:未加 IPTG 誘導的 TransSetta 菌蛋白。圖10為多表位融合蛋白P39經N1-Sephorse.6F.F純化后SDS-PAGE電泳結果。圖11為多表位融合蛋白P39經Q-HP陰離子層析圖譜。圖12為多表位融合蛋白P39經Q-HP陰離子層析SDS-PAGE電泳結果。圖13為多表位融合蛋白P39經凝膠層析結果。圖14為多表位融合蛋白P39經鎳金屬螯合層析結果。圖15為終純化后PAGE電泳結果。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。氨基酸的縮寫如下:
甘氨酸gly G ;絲氨酸Ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸thr T ;繳氨酸val V ;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸tyr Y;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨酸pro P ;天冬氨酸asp D ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸trp W ;賴氨酸Iys K ;半胱氨酸cysC ;精氨酸arg R牛肺炎支原體73個膜蛋白和36個分泌蛋白中，其中，致病相關蛋白P33和特異性膜蛋白P30，其除了某些稀有密碼子，兩段基因還含有編碼色氨酸的TGA密碼子，TGA在大腸桿菌表達系統中是終止子，本設計將兩個蛋白的基因組序列進行重新優化，再利用大腸桿菌表達系統對兩個蛋白片段基因進行了原核表達。利用western-blotting確定了兩個蛋白的抗原免疫特性，將兩段蛋白基因糅合為一個能容易大量制備、質量控制可靠、無散毒風險的重組蛋白，該重組蛋白能夠捕獲針對MB膜蛋白和致病蛋白抗原的抗體，以檢測出感染早期以及應答持續時間長的抗體，從而避免漏檢，提高血清抗體和牛奶檢測的準確性。本專利中所涉及的氨基酸序列，均是以從氮端到碳端的順序書寫。實施例1多表位融合抗原一牛肺炎支原體致病相關蛋白P33和特異性膜蛋白P30基因載體的構建lpMD18-T-P33 和 pMDl8_T-P30 構建P33基因片段全長903bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3，其中有含有5個編碼色氨酸的TGA密碼子，P33的B細胞表位分析見圖2 ；SEQ ID N0.3:“ggatccatattattgacaacactatcgccaattatctcattgccatttttatctgctagttg catcaccgaagcaaaatcagat aacaaaatggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaa aaaattcttctgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagattcaaagatggaa gaaaaagcagataacaaaacggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttc tgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagattcaaagatggaagaaaaagcag ataacaaaacggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttctgaaacaatg aataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagaatcgaaaatgaaagaaaaaacagaaaagcaaga ttcaaaaactaactcagaaaaacaagattcagaaactgatgacagtagtaatgaattaacaataccta gtgaaagcacaccaaaagatatgccaacagaaaattctgaaataaacgactatttagacaaagttaag gaatacggaaaagaagcatcagaattttatgaattactttctaaattatttaaaacaaagtataaaga taaaataattcaaaaaattggtaagtttgagaaaataatcaaagaattttctaaattatatgagggaa caaagaacaacttagaccaaattattgaaggatttaaagaacctgattttaagaaagcattattagaa cttttgaatagttacaaagaatctagagaagaaataaaaaatgcaattaaagaattaaaagaaattgaaaatgaaagtagattttaactcgag，，。P30基因片段全長738bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中有含有I個編碼色氨酸的TGA密碼子，P30的B細胞表位分析見圖3 ；SEQ ID N0.4:“ggatccatgtttaagaggaatccaaaatttatgaaacacaaactattattaagtttaggaactgtattaactgcta ctttttcttttcctttaattgctgctaaatgtgatggcaatgacaagaaggaagaaaagaaaaaagttgaagaacctgcaaa acaagctgaaggagctggaacaggtgataaaacaacctctgcaagtggaactgctaattctaatggcgcaagttctaat agtactaatgcacaaaaaacagatgaaaaagaaataaaagaaacttccgattcacctaaaaaagatggagaaaaggttt cagataaacataaagtagcttacaaggatattgattttgatttttctaagattaaaatcgtaattagtaaaaaagacatcaag gatgaagacttaattccgcctaaaacaggcaataataagcaagttttctttgatactcgtgatggagatacaaagttaagc ggaaagttcaagggaaaattaccttgaaaaggtgttgaaattggaactgttactggtctaccagacggatattcaattgct agtgttgagaatccaatccacaaaaacagaaaaggcaaaattaaagctagtggatttgtcaatgttgaaaaagaaggag acaaactaaaaattaagtttagattctttaagtacaacaaaggagcaagcccaacagtttcaacaaaggtttacgaagca attatttcttagctcgag，，。本發明中的核苷酸序列均按照從5’端到3’端的順序進行書寫。重組質粒及表達將P33和P30的稀有密碼子進行優化，人工合成兩段基因組序列分別連入PMD18-T載體，形成pMD18-T-P33和pMD18-T_P30。P33和P30密碼子優化后的序列，為 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6。SEQ ID N0.5:tagaactcggtacgcgcggatcttccagagattggatccatcctgctgaccaccctgtctccgatcatctctctgcc gttcctgtctgcttcttgcatcaccgaagctaaatctgacaacaaaatggaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccga cgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgactctaaaatggaagaaaaag ctgacaacaaaaccgaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaaca aacagaaacaggacaaatcttctatcgactctaaaatggaagaaaaagctgacaacaaaaccgaaaaagacatcaaaat caacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgaatcta aaatgaaagaaaaaaccgaaaaacaggactctaaaaccaactctgaaaaacaggactctgaaaccgacgactcttctaa cgaactgaccatcccgtctgaatctaccccgaaagacatgccgaccgaaaactctgaaatcaacgactacctggacaaa gttaaagaatacggtaaagaagcttctgaattctacgaactgctgtctaaactgttcaaaaccaaatacaaagacaaaatca tccagaaaatcggtaaattcgaaaaaatcatcaaagaattctctaaactgtacgaaggtaccaaaaacaacctggaccag atcatcgaaggtttcaaagaaccggacttcaaaaaagctctgctggaactgctgaactcttacaaagaatctcgtgaagaa atcaaaaacgctatcaaagaactgaaagaaatcgaaaacgaatctcgtttctaactcgagaatcgtcgaacggcaggcgt gcaaacttSEQ ID N0.6: tagaactcggtacgcgcggatcttccagagattggatccatgttcaaacgtaacccgaaattcatgaaacacaaa ctgctgctgtctctgggtaccgttctgaccgctaccttctctttcccgctgatcgctgctaaatgcgacggtaacgacaaaaa agaagaaaagaaaaaagttgaagaaccggctaaacaggctgaaggtgctggtaccggtgacaaaaccacctctgcttct ggtaccgctaactctaacggtgcttcttctaactctaccaacgctcagaaaaccgacgaaaaagaaatcaaagaaacctct gactctccgaaaaaagacggtgaaaaagtttctgacaaacacaaagttgcttacaaagacatcgacttcgacttctctaaa atcaaaatcgttatctctaaaaaagacatcaaagacgaagacctgatcccgccgaaaaccggtaacaacaaacaggtttt cttcgacacccgtgacggtgacaccaaactgtctggtaaattcaaaggtaaactgccgtggaaaggtgttgaaatcggta ccgttaccggtctgccggacggttactctatcgcttctgttgaaaacccgatccacaaaaaccgtaaaggtaaaatcaaag cttctggtttcgttaacgttgaaaaagaaggtgacaaactgaaaatcaaattccgtttcttcaaatacaacaaaggtgcttctc cgaccgtttctaccaaagtttacgaagctatcatctcttaactcgagaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaactt2P33和P30基因蛋白的原核表達利用限制性內切酶BamH I和Xho I酶切pMD18_T_P33獲得目的片段(見圖4)，利用限制性內切酶BamH I和Xho I酶切pMD18-T_P33獲得目的片段pMD18-T_P30獲得目的片段(見圖5)，分別連接pET-28a質粒轉化進Transl-Tl感受態細胞；挑陽性單克隆對其進行LB培養基過夜培養挑菌提取陽性質粒；取I μ I質粒轉化Transetta (DE3)感受態細胞。挑若干個菌落至5ml LB (Kan+)培養基，培養至OD600 = 0.5 1，加入5 μ 10.5Μ IPTG，37°C誘導5h ;收集菌體,加入200μ I PBS垂懸,取50垂懸液加入10 μ 16 X protein loadingBuffer混勻，煮5minl4600rpm離心5min ;制備質量體積分數為12.5%的SDS PAGE膠，點樣品(上清5 μ I)跑電泳檢測，檢測結果見圖6、圖7。3Ρ33 和 Ρ30 蛋白的 western-blotting選出表達P33和P30的蛋白質樣品，用12.5% SDS-PAGE膠進行分離。轉膜:200mA轉2小時。封閉I小時。Ant1-mouse His標簽一抗(按體積比1: 10000稀釋后)孵育I小時。TBST洗3次。Ant1-mouse 二抗(按體積比為1: 10000稀釋后)孵育lh。TBST洗I 次，TBS 洗 3 次。EasySee Western Blot kit 孵育 lmin,壓片，顯色見圖 8、圖 9。二、多表位融合蛋白P39的構建1.根據P33和P30蛋白免疫分析最終確定的多表位融合抗原蛋白P39序列為SEQID N0.2。確定多表位融合抗原蛋白的氨基酸序列基礎上，反向將其翻譯成核苷酸序列，人工合成所需基因片段，片段克隆后通過雙酶切與表達載體pET-28a連接，轉染至BL21 (DE3)codonplus,通過卡那抗性篩選、發酵、IPTG誘導表達,獲得目的抗原。重組菌種在自誘導培養基中37°C發酵并誘導表達18h后。2.重組牛肺炎支原體蛋白P39的純化超產破菌過濾后的上清用鎳金屬螯合層析柱N1-Sephorse.6F.F上柱，HisBinding buffer (20mmol/L sodium phosphate, 0.5M NaCl, PH7.4)平衡后用 His Elutionbuffer (20mmol/L sodium phosphate,0.5M NaCl，0.5M 咪唑 PH7.4) 15% B、20% B、30% B梯度及線性梯度洗脫，根據SDS-PAGE電泳結果收集目的蛋白洗脫峰，結果見圖10。收集含目的蛋白的洗脫峰，20mM Tris-HCl buffer (pH8.0)透析過夜,進一步做陰離子純化，純化結果(見圖11、圖12)結果顯示:牛肺炎支原體融合蛋白經Q-HP陰離子層析后，其純度到達95% (見圖13)，分子量約49KD。4°C冰箱放置兩天后意外發現融合蛋白標簽自動脫離，其脫離片段分子量大小與目的蛋白片段大小之和正好與融合蛋白大小相符，為39kDa，凝膠層析分離(見圖14)，再用鎳金屬螯合層析，其結果為標簽蛋白與未脫離完全的融合蛋白正好被鎳金屬螯合，目的蛋白穿透鎳金屬螯合層析，結果見(圖15)。3.重組蛋白P39的定量用Lowry法對純化的重組蛋白P39進行蛋白定量測定,獲得其蛋白量為0.4mg/ml。實施例2多表位融合抗原P39制備用于檢測牛肺炎支原體抗體的試劑盒一間接ELISA檢測試劑盒的組成1抗原包被板:1)包被:多表位融合抗原以50mM的碳酸鹽緩沖液(pH9.3)稀釋至5 μ g/mL,每孔加入100yL，4°C孵育過夜。 碳酸鹽緩沖液(5 X，pH9.3) IL組分用量及終濃度Na2C03 (MW105.99)分 7.949g (75mM)析純NaHC03 (MW84.01)分析 14.702g(175mM)
純超純水溶解，定容至1L，過濾除菌，2_8°C保存。使用前以超純水稀釋5倍。2)封閉:1%酪蛋白，300yL/孔，37°C孵育2h，密封2_8°C保存。2樣本稀釋液:0.5%酪蛋白，以PBS(1 X，pH7.4)配制。PBS的配制方法見《分子克隆實驗指南》(第3版)下冊第1570頁。3陽性對照:原液來自于牛肺炎支原體攻毒樣本,經biovet和bio-X兩個公司生產的牛肺炎支原體抗體檢測試劑盒檢測確認牛肺炎支原體抗體陽性，檢測結果為“+++”。原液以樣本稀釋液(見上)稀釋至檢測OD在0.6以上。4陰性對照:原液來自于新生健康牛 ，經上述兩種商品化抗體檢測產品檢測確認為牛肺炎志遠體抗體陰性。5沖洗緩沖液:PBS(見上)加入Tween-20至終濃度為0.05% -0.1% (體積百分比)，例如在 IL PBS 中加入 Tween-200.5mL_lmL。6酶標抗體工作液:HRP標記的羊抗牛IgG干粉購自美國KPL公司(貨號14-12-06)，按照附帶的說明書所述的步驟重懸成貯存液后，以沖洗緩沖液稀釋2000-3000倍。7終止液:2M H2SO4或者是I % SDS0如果用2M H2SO4終止顯色，酶標儀以波長420-450nm檢測OD值；如果用I % SDS終止顯色，酶標儀以波長620_650nm檢測OD值。二間接ELISA檢測步驟試劑盒采用酶聯免疫吸附測定法檢測牛血清或血漿樣本中的牛肺炎支原體抗體(IgG)。其基本原理是將重組多表位融合抗原包被在酶標板內的固相表面；檢測時將待測樣本加入酶標板孵育，樣本中針對牛肺炎支原體的特異性抗體與包被在固相表面的抗原特異結合，再通過沖洗步驟去除未結合在固相表面的其他成分；之后，加入酶標抗體(辣根過氧化物酶偶聯的抗-牛IgG抗體)進行孵育，使之與已經吸附在固相表面上的牛抗體相結合，再通過沖洗步驟去除未結合在固相表面的酶標抗體并加入辣根過氧化物酶的底物，底物在辣根過氧化物酶的催化下產生顯色反應。顯色程度與待測樣本中抗牛肺炎支原體抗體的量成正比。具體操作步驟如下:所有試劑在使用前必須放置于室溫(18°C -25°C )平衡溫度，并且輕柔搖勻。操作部同樣品時必須更換槍頭。I抗原包被板、樣本稀釋液、陽性對照、陰性對照、緩沖液(IOX)平衡至室溫:將雙抗包被板、樣本稀釋液、陽性對照、陰性對照、緩沖液(IOX)從試劑盒中取出，于室溫放置30min。沖洗緩沖液(IOX)如出現沉淀，可將其置于37°C并不斷振搖至溶解后再使用。2準備待測樣本:待測樣本(牛血清、血漿或牛奶)以樣本稀釋液稀釋40倍，以體積稀釋倍數計算。陰性對照和陽性對照不作稀釋。3將稀釋好的待測樣品加入至檢測管中，IOOul/管。加樣完畢后封膜封板，室溫孵化30min。吸取樣本，以沖洗液沖洗，300ul/管，重復5次。4加入酶標抗體工作液，IOOul/管。加樣完畢后封膜封板，室溫孵化30min。吸除酶標抗體工作液，以沖洗液沖洗，300ul/管，重復5次。5加入底物液，IOOul/管，室溫孵化lOmin。6加入終止液，50ul/管。
7將酶標儀的檢波長設定在450nm，檢測各種樣本的吸光度，及A (450)值，計算及
結果判定。三間接ELISA試劑盒結果判定每次實驗設置兩個陰性對照(NC1、NC2)和兩個陽性對照(PC1、PC2)。實驗結束后首先計算兩個陰性對照的A(450)均值(NC)和兩個陽性對照的A(450)均值(PC)，然后計算待測樣本的IRPC值，初步確定本試驗ELISA檢測結果的判定方法:DELISA檢測過程為用波長450nm檢測，計算兩個陰性對照A (450)的平均值:NC=(A (450)ncl+A(450)nc2)/2o2)計算兩個陽性對照 A(450)的平均值:PC = (A(450)pcl+A(450)pc2)/2。3)計算待測樣本的IRPC值:IRPC = (S-NC) / (PC-NC) *100其中S為待測 樣本的A(450)檢測值。陽性對照A(450)均值大于0.5 (即PC >
0.5)，陽性對照A(450)均值與陰性對照A(450)均值的比值大于4 (即PC/NC > 4)，判定實驗有效，反之實驗無效，需重復。在實驗有效的前提下，待測樣本的IRPC > 20為陽性樣本，反之為陰性樣本。四試劑盒田間試驗結果利用試劑盒對豐都某養殖場采集的臨床樣本進行的田間試驗，該結果與國外Biovet公司同類產品的比較，我們研制的產品臨床靈敏度達到90.98%，臨床特異性達到87.59%，實驗數據結果見下表:
B"nttAi+
陽性陰性
所述檢測牛陽性12117J38
肺炎支原體
抗體的試劑12120132
舎
τπ合計133137270最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.多表位融合抗原，其特征在于:所述多表位融合抗原的氨基酸序列含有如SEQIDNO:1所示,或所述多表位融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.權利要求1所述的多表位融合抗原在制備牛肺炎支原體診斷試劑中的應用。
3.牛肺炎支原體診斷試劑，其特征在于:所述牛肺炎支原體診斷試劑為牛肺炎支原體抗體的特異性抗原，所述特異性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2任一所示。
4.含有權利要求3所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，所述試劑盒為ELISA試劑盒，包括包被有包被抗原的固相載體，酶標二抗和顯色底物，其特征在于:所述包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
5.根據權利要求4所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，其特征在于:所述酶標二抗為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β -半乳糖苷酶標記的標記的抗牛IgG0
6.根據權利要求4所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，其特征在于:所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗牛的IgG。
7.權利要求1所述的多表位融合抗原和辣根過氧化物酶標記羊抗牛的IgG聯合在檢測牛肺炎支原體抗體中的應用。
8.運用權利要求4所述的試劑盒檢測牛肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: A固相載體的包被 將所述包被抗原用包被抗原稀釋液稀釋后，包被于固定載體上，在固相載體上添加待測樣品孵育，再加入所述酶標二抗孵育，加入顯色底物反應充分后，用所述終止液終止反應； B讀取數據 用儀器分別讀取待測樣品組和標準樣品組的數值，通過與已知含量的標準樣品或陰性對照品比較，求得待測樣品的牛肺炎支原體抗體含量，或判定待測樣品是否為陽性。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述步驟A中，所述包被抗原純度為95%時，所述包被抗原被稀釋成濃度為1-10 μ g/ml，酶標二抗為稀釋濃度以體積計為I: 2000-3000的 辣根過氧化物酶標記羊抗牛的IgG，所述顯色底物為辣根過氧化物酶的顯色底物。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:待測樣品為牛奶，用酶標儀在450nm波長下讀取待測樣品數據，在實驗有效的前提下，IRPC ^ 20為陽性樣本，反之為陰性樣本。
全文摘要
本發明涉及動物診斷醫學，特別涉及牛肺炎支原體的診斷技術，具體為多表位融合抗原，含有如SEQ ID NO1所示，或氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；其在制備牛肺炎支原體診斷試劑中的應用；該診斷試劑可作為間接ELISA試劑盒的固相載體包被抗原，與之特異性抗體結合后，并加入辣根過氧化物酶偶聯的抗-牛IgG抗體進行孵育，產生顯色反應，顯色程度與待測樣本中抗牛肺炎支原體抗體的量成正比；本方法操作簡便，無需依靠復雜的儀器設備，對實驗室條件、以及實驗人員的技術要求不高，檢測成本相對較低，適合于基層和養殖場大規模開展；本多表位融合抗原制作成本低，適合大規模應用；靈敏度和特異性高，批間差異小，采用多表位作為標靶，其檢測結果一致性高。
文檔編號G01N33/569GK103172752SQ20131007153
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者熊仲良, 曾政, 賀德華, 嚴俊, 藺露, 謝建華, 凌洪權, 歐武海, 丁平 申請人:重慶市動物疫病預防控制中心, 重慶業為基生物科技有限公司