專利名稱：一種豬支原體肺炎霧化活疫苗及其制備與檢驗方法
技術領域：
本發明屬于藥物制劑技術領域，涉及ー種疫苗及其制備與檢驗方法，具體涉及ー種豬支原體肺炎霧化活疫苗及其制備與檢驗方法。
背景技術：
豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體感染引起的ー種接觸性慢性呼吸道傳染病。本病遍布全球，并且易與其它病原發生混合感染，引起更嚴重的肺部病變，產生更大的經濟損失。疫苗免疫是預防該病的主要方法。目前市場上可供選擇的疫苗主要分為進ロ滅活疫苗和國產弱毒疫苗。豬支原體肺炎滅活疫苗免疫后由于不能阻制豬肺炎支原體野毒對支氣管纖毛的定植，因此無法產生完全的保護。豬支原體肺炎活疫苗(168株)是國內唯一一個大量推廣使用的弱毒疫苗，臨床使用效果顯著，實驗室的攻毒保護試驗表明，其保護效率要高于進ロ滅活疫苗，然而該活疫苗目前所采用肺內注射免疫途徑不利于大規模推廣。若能將豬支原體肺炎活疫苗制成霧化劑型，則不僅能提高疫苗接種的方便性，而且大大節省了勞 動カ和勞動時間，達到更好推廣免疫該疫苗的目的。由于豬鼻甲骨與氣管解剖結構的特點，只有粒徑為I IOym的微粒經氣霧以適當的角度可以進入下呼吸道。較粗的顆粒大部分落在上呼吸道鼻腔黏膜上，無法對疫苗起到靶向作用。如果微粒太細(<0.5i!m)，則進入肺泡囊后又隨呼氣排出，所以必須將豬支原體肺炎霧化活疫苗的粒徑控制在I IOym內。本發明在氣溶液膠的發生方式與發生設備上對之進行了控制。氣溶膠在發生方式上總體可分為物理凝集法、化學凝集法、機械分散法和氣流分散法。對于微生物氣溶膠，具有嚴格的選擇性，一般常用氣流分散法進行。而液相氣流分散法又可細分為水力式、吹氣式、離心式、振動式和超聲波法等等。考慮到本發明既需要在單位時間內噴出較多量的疫苗氣溶膠，而且氣溶膠粒子譜范圍不能太大，我們最終選擇吹氣式霧化法和水力式霧化法作為霧化活疫苗的制備方法。另外，由于霧化過程中所產生的切削力、高壓カ等均會對微生物的活性產生影響，然而，控制氣溶膠微粒大小和疫苗活力本身又是ー種矛盾。氣溶膠生成過程中的切削力、高壓カ越大，霧化粒子越小，但疫苗株的活力也越低。因此，在制備豬支原體肺炎霧化活疫苗時，必須加入一定的保護劑，以減少霧化過程所產生的各種作用力對疫苗的損傷。除了切削力、高壓カ等作用力外，影響氣溶膠微生物活力的因素還有環境因素，如在低濕、高溫環境下，霧化疫苗中水份快速蒸發，鹽代謝失調和急劇的干燥作用、氧化作用使霧化疫苗活力大大降低。因此，為保持霧化疫苗的微生物學活性，本發明在制備霧化疫苗時，綜合考慮了霧化疫苗的發生方法、疫苗溶液的組成以及環境因素等。

發明內容
本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種豬支原體肺炎霧化活疫苗及其制備與檢驗方法，本發明將豬支原體肺炎活疫苗制成霧化劑型，則不僅能提高疫苗接種的方便性，而且大大節省了勞動カ和勞動時間，達到更好推廣免疫該疫苗的目的。其技術方案為—種豬支原體肺炎霧化活疫苗，包含有以下組分疫苗菌株、疫苗稀釋液，所述疫苗菌株為豬肺炎支原體弱毒株(168株)的凍干菌種或新鮮培養的菌液；所述疫苗稀釋液為pH值6. 8-7. 5，且終濃度為含5_10%甘油的去離子水溶液，或含0. 1_1%。丙ニ醇嵌段聚醚(F68)的去離子水溶液，或含0. I %聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的去離子水溶液，或者為上述保護劑的任意組合。進ー步優選，所述保護劑組合為終濃度為含5%甘油、0. 1%聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的去離子水溶液。一種豬支原體肺炎霧化活疫苗的制備方法，包括以下步驟 I)用疫苗稀釋液溶解凍干的疫苗菌株，或稀釋新鮮培養的菌液，配制成豬支原體肺炎活疫苗溶液，并使該疫苗溶液的PH值為6. 8-7. 5，其中所含甘油的終濃度為5-10%，或含丙ニ醇嵌段聚醚(F68)的終濃度為0. 1-1%。，或含聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的終濃度為0. I %，疫苗菌種或菌液與疫苗稀釋液的配制比例為I : I I : 100;2)將步驟I)所得的豬支原體肺炎活疫苗溶液通過吹氣式霧化法或水力式霧化法制成霧化活疫苗。所述豬支原體肺炎霧化活疫苗粒徑在1-10 U m之間，且保持一定的活性，霧化活疫苗的滴度相比活疫苗溶液的滴度應控制為降低I個滴度以內。步驟2)中所述的吹氣式霧化法所用噴霧設備應為醫用下呼吸道沉積型噴霧器，或噴霧粒度直徑可控制在1-10 U m之間的電動噴霧器。步驟2)中所述的水力式霧化法所用的噴霧設備應為噴霧粒度直徑可控制在1-10 u m之間的高壓噴霧降溫系統。一種豬支原體肺炎霧化活疫苗的檢驗方法，包括霧化疫苗氣溶膠粒徑檢測和霧化疫苗活力檢測所述的霧化疫苗氣溶膠粒徑檢測方法為通過軟墊法采集疫苗氣溶膠后經顯微鏡對視野中每個顆粒進行粒徑測量與分布統計，或者通過氣溶膠粒徑分析儀對疫苗氣溶膠的粒徑和粒度分布作檢測，所述的霧化疫苗活力檢測方法為通過霧化疫苗定量收集裝置收集疫苗氣溶膠，然后通過CCU法檢測霧化疫苗的滴度。與現有技術相比，本發明的有益效果為本發明將豬支原體肺炎活疫苗制成霧化劑型，則不僅能提高疫苗接種的方便性，而且大大節省了勞動カ和勞動時間，達到更好推廣免疫該疫苗的目的；本發明的制備方法中將豬支原體肺炎霧化活疫苗的粒徑控制在I IOym內，適應豬鼻甲骨與氣管解剖結構的特點；本發明在制備豬支原體肺炎霧化活疫苗時，加入一定的保護劑，以減少霧化過程所產生的各種作用力對疫苗的損傷。


圖I為氣溶膠粒徑分析儀檢測豬支原體肺炎霧化活疫苗粒徑；
圖2為霧化疫苗定量收集裝置結構示意圖；圖3為軟墊法測氣溶膠粒徑模式圖；圖4為軟墊法檢測豬支原體肺炎霧化活疫苗粒徑。
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施例對本發明的技術方案作進ー步詳細地說明。實施例I
取豬肺炎支原體弱毒株(168株)凍干菌種I瓶(2ml裝/瓶)，用2ml含0. I %聚こ烯基吡咯烷酮(PVP)的去離子水溶液(pH值6. 8)溶解成豬支原體肺炎活疫苗溶液，將該疫苗溶液加入到醫用下呼吸道沉積型噴霧器(德國百瑞)中，將噴霧器連接空氣壓縮泵，調節壓カ為0. 2MPa后進行噴霧，制備成豬支原體肺炎霧化活疫苗。將噴霧器噴嘴通入ー密閉的氣霧柜，另外將TSI3321型氣溶膠粒徑分析儀的進樣ロ通過管道與氣霧柜相連。霧化疫苗發生5分鐘后，打開TSI3321型氣溶膠粒徑分析儀的電源，測得氣溶膠疫苗總粒子空氣學動力中位直徑為4.8i!m，如圖I所示。參照圖2，將連接氣源的噴霧器噴嘴通入一密閉的無菌霧化箱，在無菌霧化箱的另ー側順序連接螺旋形玻璃氣液轉換器、液相疫苗收集管、可調式負壓抽氣系統。通過可調式負壓抽氣系統產生的負壓，將無菌霧化箱中的霧化疫苗抽入氣液轉換器，并在其中凝聚液化，液態疫苗隨著負壓流入液相疫苗收集管，通過CXU法檢測霧化疫苗的滴度為lX107_°(XU/ml，較噴霧前下降0. 5個滴度(表I)。表I. CXU法檢測含0. I % PVP的豬支原體肺炎霧化活疫苗滴度
、擔鉬_ _各稀釋享變色天數Si
_ IO-1] IO-2 Fio-3 ijo-4 Ijo-5T io.6 [10-71 jo-8110-9] 10-10 _ (ccu/mi)
4d 6d8d9dlidlid14d16d—一
噴霧前 4d 6d8d9dlid12d14d———
4d 6d7d9dlidlid14d15d—— X
4d 6d8d9dlidlid14d—一一
4d 6d8d9dlidlid13d—一一
5d 7d 8d IOd 12d 13d 15d — — — , in7n
噴霧后----------IxlO70
4d 6d 8d 9d lid lid 14d ———
_ 4d 6d 8d IOd lid 13d 14d —— —實施例2取豬肺炎支原體弱毒株(168株)凍干菌種10瓶(2ml裝/瓶)，用2000ml含0. 5%0丙ニ醇嵌段聚醚(F68)的去離子水溶液(pH值7. 2)溶解成豬支原體肺炎活疫苗溶液，將該疫苗溶液加入到電動噴霧器(1035BP，美國哈遜)中進行噴霧，流量設為300g/min，制備成豬支原體肺炎霧化活疫苗。將噴霧器噴嘴通入ー密閉的氣霧柜，另外將TSI3321型氣溶膠粒徑分析儀的進樣ロ通過管道與氣霧柜相連。霧化疫苗發生5秒鐘后，打開TSI3321型氣溶膠粒徑分析儀的電源，檢測氣溶膠疫苗總粒子空氣學動力直徑。再將自制的霧化疫苗定量收集裝置連接氣霧柜收集疫苗氣溶膠，然后通過CCU法檢測霧化疫苗的滴度為lxl04 75CCU/ml，較噴霧前下降0. 75滴度(表2)。表2. CXU法檢測含0. 5%o F68的豬支原體肺炎霧化活疫苗滴度
權利要求
1.一種豬支原體肺炎霧化活疫苗，其特征在于，包含有以下組分疫苗菌株、疫苗稀釋液，所述疫苗菌株為豬肺炎支原體弱毒株(168株)的凍干菌種或新鮮培養的菌液；所述疫苗稀釋液為PH值6. 8-7. 5，且終濃度為含5-10%甘油的去離子水溶液，或含0. 1_1%。丙二醇嵌段聚醚(F68)的去離子水溶液，或含0. I %聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的去離子水溶液，或者為上述保護劑的任意組合。
2.根據權利要求I所述的豬支原體肺炎霧化活疫苗，其特征在于，所述保護劑組合為終濃度為含5%甘油、0. I %聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的去離子水溶液。
3.—種權利要求I所述的豬支原體肺炎霧化活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)用疫苗稀釋液溶解凍干的疫苗菌株，或稀釋新鮮培養的菌液，配制成豬支原體肺炎活疫苗溶液，并使該疫苗溶液的PH值為6. 8-7. 5，其中所含甘油的終濃度為5-10%，或含丙二醇嵌段聚醚(F68)的終濃度為0. 1-1%。，或含聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的終濃度為0.I %，疫苗菌種或菌液與疫苗稀釋液的配制比例為I : I I : 100; 2)將步驟I)所得的豬支原體肺炎活疫苗溶液通過吹氣式霧化法或水力式霧化法制成霧化活疫苗。
4.根據權利要求3所述的豬支原體肺炎霧化活疫苗的制備方法，其特征在于，所述豬支原體肺炎霧化活疫苗粒徑在1-10 U m之間，且保持一定的活性，霧化活疫苗的滴度相比活疫苗溶液的滴度應控制為降低I個滴度以內。
5.根據權利要求3所述的豬支原體肺炎霧化活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述的吹氣式霧化法所用噴霧設備應為醫用下呼吸道沉積型噴霧器，或噴霧粒度直徑可控制在I-IOiim之間的電動噴霧器。
6.根據權利要求3所述的豬支原體肺炎霧化活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述的水力式霧化法所用的噴霧設備應為噴霧粒度直徑可控制在1-10 之間的高壓噴霧降溫系統。
7.—種權利要求I所述豬支原體肺炎霧化活疫苗的檢驗方法，其特征在于，包括霧化疫苗氣溶膠粒徑檢測和霧化疫苗活力檢測所述的霧化疫苗氣溶膠粒徑檢測方法為通過軟墊法采集疫苗氣溶膠后經顯微鏡對視野中每個顆粒進行粒徑測量與分布統計，或者通過氣溶膠粒徑分析儀對疫苗氣溶膠的粒徑和粒度分布作檢測，所述的霧化疫苗活力檢測方法為通過霧化疫苗定量收集裝置收集疫苗氣溶膠，然后通過CCU法檢測霧化疫苗的滴度。
全文摘要
本發明公開了一種豬支原體肺炎霧化活疫苗，包含有以下組分疫苗菌株、疫苗稀釋液，所述疫苗菌株為豬肺炎支原體弱毒株(168株)的凍干菌種或新鮮培養的菌液；所述疫苗稀釋液為pH值6.8-7.5，且終濃度為含5-10％甘油的去離子水溶液，或含0.1-1‰丙二醇嵌段聚醚(F68)的去離子水溶液，或含0.1％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的去離子水溶液，或者為上述保護劑的任意組合，同時也公開了該疫苗的制備和檢驗方法，將豬支原體肺炎活疫苗制成霧化劑型，則不僅能提高疫苗接種的方便性，而且大大節省了勞動力和勞動時間，達到更好推廣免疫該疫苗的目的。適用于藥物制劑技術領域。
文檔編號G01N15/02GK102764431SQ201210275639
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者馮志新, 劉茂軍, 華利忠, 熊祺琰, 甘源, 邵國青 申請人:江蘇省農業科學院