專利名稱：用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法。
背景技術：
在免疫吸附反應過程中的首要條件是，將目的抗體固定到反應載體上。傳統的方法是抗體通過物理吸附的方法固定到載體上，即抗體通過物理力被動地吸附于疏水性固相載體的表面，然后使用惰性蛋白將酶聯免疫反應載體的其他吸附位點封閉。由于物理性吸附的過程較簡單，隨機性強，與載體結合位點多樣化；且抗體被封閉在惰性蛋白的下方，使檢測過程中抗原-抗體結合反應存在一定的空間位阻，影響免疫檢測試劑的靈敏度。并且抗體是不均一分布，本與抗原結合的位點部位卻與固相載體結合，這部分抗體就失去其功能，從而浪費抗體，同時占有載體的空間而使靈明度降低。

發明內容
本發明的目的為了克服上述現有技術存在的問題，而提供一種簡單有效而且實用的免疫分析反應過程中用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法，有效地提高酶聯免疫吸附試驗的敏感性、特異性。異硫氰酸熒光素(FITC)是一種具有抗原性的銀光素分子，極易與抗體結合形成穩定的結合物，并且不影響抗體結合抗原的活性。一個抗體蛋白可結合2 8個分子的FITC，FITC與抗體蛋白反應式
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S本發明的技術方案為用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法，其特征在于按以下步驟進行在固相載體上預先包被抗FITC的抗體，在4-6°C反應8-12小時；然后封閉固相載體上未反應位點，在34-37°C反應1-2小時；再加入FITC標記的抗體，在34-37°C反應2小時或4-6V反應8-12小時，完成對載體的包被過程。所述待包被蛋白為抗體或抗原，所述的抗原為小分子抗原，小分子抗原難于固定在固相載體上，如果利用本發明的方法FITC-抗FITC系統，同樣可以間接地、穩定地固定到載體表面。在免疫吸附反應中常常使用的固相載體為聚苯乙烯、聚氯乙烯、PVDF膜、纖維素、凝膠或免疫磁珠。因而此方法具有廣泛應用的優點，不拘泥材料的限制。本發明的抗體均勻地涂布在固定在載體上，反應位點完全暴露出來，形成平滑的包被層。
用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法具體按以下步驟進行I),選擇多孔固相載體一塊；2)，預包被用摩爾濃度為O. 05mol/L、pH=9. 5碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液為包被液將兔抗FITC抗體稀釋成1.0 yg/mL，每孔加入100 μ . L，4°C反應8 — 12小時；3)，封閉傾去包被液，然后每孔加入以質量濃度為1%牛血清白蛋白BSA溶液作為封閉液，250 μ L/孔，37°C反應I小時；4)，包被目的抗體用摩爾濃度為O. 01mol/L、pH=7. 2的三羥甲基氨基甲烷(Tris堿)-醋酸(TBS)洗滌液稀釋FITC標記的目的抗體，濃度為O. 05ug/mL,每孔加入100 μ . L，4°C反應10小時或者37°C反應2小時；5)，洗板以摩爾濃度為O.Olmol/L、pH=7. 2的Tris堿-醋酸(TBS)洗滌液洗板 2-5次，完成對固相載體的包被過程。本發明所依據的原理是FITC-抗FITC放大系統。抗FITC抗體通過通過物理吸附的方法固定到反應載體上，然后使用惰性蛋白將反應載體的其他吸附位點封閉，此過程與傳統的方法相同，之后再加入FITC標記的抗體。一個待固定抗體可以結合2 — 8個FITC分子，只要任意一個FITC分子間接地吸附到載體上，抗體就可以固定在載體上，增加了吸附效率。并且，FITC和抗體結合，通過抗體上的賴氨酸的r氨基，使抗體結合抗原的位點完全暴露出來，平滑的鋪在載體上，完全消除了空間位阻效應。經試驗證實，采用本方法，可以減少預包被抗體10-15倍，明顯降低了生產成本。本發明先將抗FITC抗體通過物理吸附的方式固定到酶鏈免疫反應板上，然后使用惰性蛋白將反應載體的其他吸附位點封閉，再將FITC標記的目的抗體與FITC結合，間接的固定到反應載體上，以減小目的抗體與抗原結合反應空間位阻，抗體的免疫位點整齊的排列在載體表面，提高免疫檢測試劑的靈敏度，同時減少目的抗體的固相化濃度，極大的降低生產成本。


圖Ia為本發明的方法固定抗體的示意圖；圖Ib為傳統方法固定抗體的示意Y +4兔抗Fiic Yafitc標記的羊It人reg-4 · ^fiic釤子圖I a 中
權利要求
1.用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法，其特征在于按以下步驟進行在固相載體上預先包被抗FITC的抗體,在4-6°C反應8-12小時；然后封閉固相載體上未反應位點，在34-37°C反應1-2小時；再加入FITC標記的抗體，在34-37°C反應1_2小時或4-6V反應8-12小時，完成對固相載體的包被過程。
2.根據權利要求書I所述的方法，其特征在于所述的固相載體材料為聚苯乙烯、聚氯乙烯、PVDF膜、纖維素、凝膠或免疫磁珠。
3.根據權利要求書I或2所述的方法，其特征在于按以下步驟進行1)，選擇多孔固相載體一塊； 2)，預包被用摩爾濃度為O.05mol/L、pH=9. 5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液為包被液將兔抗FITC抗體稀釋成I. O μ g/mL,每孔加入100 μ . L，4_6°C反應8 — 12小時； 3)，封閉傾去包被液，然后每孔加入以質量濃度為1%牛血清白蛋白BSA溶液作為封閉液，250 μ L/孔，34-37°C反應I小時; 4)，包被目的抗體用摩爾濃度為O.Olmol/L、pH=7.2的三羥甲基氨基甲烷-醋酸洗滌液稀釋FITC標記的目的抗體，濃度為O. 05ug/mL,每孔加入100 μ L，4-6V反應10小時或者34-37°C反應2小時； 5)，洗板以摩爾濃度為0.01mol/L、pH=7.2的三羥甲基氨基甲烷-醋酸洗滌液洗板2-5次，完成對固相載體的包被過程。
全文摘要
本發明涉及一種用于免疫吸附反應過程中抗體在固相載體上固定的方法，其特征在于按以下步驟進行在固相載體上預先包被抗FITC的抗體，在4-6℃反應8-12小時；然后封閉固相載體上未反應位點，在34-37℃反應1-2小時；再加入FITC標記的抗體，在34-37℃反應1-2小時或4-6℃反應8-12小時，完成對固相載體的包被過程，本發明解決了現有包被抗體濃度高，靈明度低，特異性差的問題。通過在固相載體上預先形成一層包被層，再來固定抗體。本發明方法具有方法簡單，成本低，適用性強，范圍廣等優點。
文檔編號G01N33/543GK102914645SQ20121045064
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月12日 優先權日2012年11月12日
發明者齊兵玉, 李學斌, 朱峰勝 申請人:武漢伊艾博科技有限公司