專利名稱：一種用于hplc測定絲瓜種子內源激素含量的樣品前處理方法
技術領域：
本發明屬于分析化學領域，更具體涉及一種用于HPLC測定絲瓜種子內源激素含量的樣品前處理方法。
背景技術：
絲瓜是我國南北皆可栽培的蔬菜作物。絲瓜除自身具有豐富的營養價值外，還有醫療保健作用，具有清熱化痰等功效。深入研究絲瓜種子，可為絲瓜良種繁育提供理論基 礎。植物激素是植物生命活動的重要調控者。植物激素自身在植物體內含量甚微，組成復雜，再加上種子材料中干擾物質較多，因而，對種子內的植物激素進行測定比較困難。高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,又稱高效液相層析，簡稱HPLC)，它作為一種重要的分析方法，廣泛的應用于化學和生化分析中，常用于醫藥品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成份分離、成分定性及定量分析。適于分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。高效液相色譜具有重現性好，檢測限低等優點，是檢測植物激素較為理想的方法。該方法也成功應用到多種植物種子內源激素測定上。然而，高效液相色譜法，對樣品前處理要求高。因此設計一個合理的樣品前處理方法是成功利用HPLC分析待測物質的關鍵環節。當前用于植物激素前處理的多是采用80%的甲醇作為提取液，利用旋轉蒸發儀進行濃縮，使用PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮)或C18預處理小柱進行激素的純化。這種前處理方法不但實驗費用較高，而且操作復雜、費時費事。目前，對絲瓜種子內激素含量的測定，尚未見公開報道，且利用上述前處理方法，來處理絲瓜種子效果不甚理想。再加上絲瓜種子自身脂肪等干擾物質含量高，因此，設計一種適合絲瓜種子的前處理方法十分必要。
發明內容
本發明方法的目的是提供一種利用高效液相色譜測定絲瓜種子內源激素樣品前處理的方法，處理步驟包括乙腈浸提，氮吹濃縮，冷凍去脂等，該方法可有效出去脂肪等雜質，且操作簡單，結果可靠，經濟高效。本發明提供的技術方案如下所述。一種用于HPLC測定絲瓜種子內源激素含量的樣品前處理方法，其處理步驟包括
1)制備待測絲瓜種子植物激素粗提液；
2)濃縮粗提液后，再加入3ml pH=8. 0磷酸緩沖溶液(0. lmol/L)；3)冷凍去脂，過濾除雜；
4)用稀鹽酸(0.5 mol/L)調解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；
5)將酯相濃縮后，用流動相定容至Iml，經0.45 Pm的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。其中，所述待測絲瓜種子植物激素粗提液的制備方法為準確稱取I. 000 g去除外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，并裝入IOml帶蓋離心管中，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4°C冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘渣中加入
4ml的冷乙腈低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復提取2次,合并3次上清液。
其中，在所述的前處理方法中，所述步驟2)及步驟5)中的濃縮方法是指將步驟I)制備的絲瓜種子植物激素粗提液或步驟4)所得的酯相在35 1下用氮氣吹干。其中，在所述的前處理方法中，所述步驟3)中冷凍去脂，過濾除雜的方法為將步驟2)所得溶液放入-80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min，然后在4°C條件下解凍，低溫離心15min (10000 r/m),過濾棄去雜質即可。本發明的顯著優點是本方法操作簡單，成本低，可以一次處理多個樣品，可節省時間，純化過程中未做過柱處理，減少了待測物在提取過程中的損失。本方法可用于多種植物激素的提取的前處理，并可滿足高效液相色譜對樣品處理的要求。
具體實施例方式下面給出本發明的較佳的實施例，這些實施例并非限制本發明的內容。本發明所用儀器裝置包括氮吹儀，超聲振蕩儀，低溫高速離心機，超低溫冰箱和普通冰箱。實施例I 處理步驟包括
準確稱取樣品I. 000 g去掉外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘渣中加入4 ml的冷乙腈低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復提取2次，合并3次上清液。利用乙腈浸提不但可減少雜質的溶出，且乙腈易揮發，有利于加快氮吹濃縮的效率，縮短實驗用時。在35 °C下用氮氣吹干,加入3 ml pH=8. 0的磷酸緩沖溶液(0. I mol/L)。氮吹儀一次可處理多個樣品，起到縮短實驗用時的作用。放入-80 °C超低溫冰箱中，冰凍30 min，在4 °C條件下解凍，低溫離心15 min(10000 r/m)，過濾棄去雜質。相對于過柱處理，此操作方便易行。用鹽酸(0. 5 mol/L)調解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；在35 1條件下氮氣吹干，用流動相定容至I ml，溶液經0.45 U m的微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。
實施例2
利用本方法測定發育中的絲瓜種子內源激素ABA的含量。
準確稱取樣品I. 000 g去掉外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘洛中加入4 ml的冷乙腈,低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復提取2次,合并3次上清液。在35 °C條件下用氮氣吹干，加入3 ml pH=8. 0的磷酸緩沖溶液(0. I mol/L)，放A -80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min,在4 °C條件下解凍,低溫離心15 min (10000 r/m),過濾棄去雜質，用鹽酸(0. 5 mol/L)調解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 1條件下氮氣吹干，用流動相定容至I ml，溶液經0.45 y m的微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。色譜條件Waters C18反相色譜柱(4. 6 mmX250 mm, 5 iim);柱溫35 °C;流動向體積比為5:5的甲醇和水(含0. 2%磷酸)混合溶液；流速0. 8 ml/min ;進樣量20 U I ;波長260 nm ;用外標法進行定量測定。利用本方法對植物激素進行前處理得到較好的純化和富集。該方法與高效液相色 譜連用，成功測定了絲瓜種子內源激素ABA的含量。進行加標回收率實驗，平均回收率為80. 53%，相對標準偏差(RSD)小于3. 43%，符合激素測定要求。實際測定授粉后發育28天的雜交絲瓜種子內源ABA含量為1496. 2ng/g Fff (鮮重)
實施例3
利用本方法測定發育中的絲瓜種子內源激素GA3的含量。準確稱取樣品I. 000 g去掉外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘洛中加入4 ml的冷乙腈,低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復提取2次,合并3次上清液。在35 °C條件下用氮氣吹干,加入3 ml pH=8. 0的磷酸緩沖溶液(0. I mol/L),放A -80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min,在4 °C條件下解凍,低溫離心15 min (10000 r/m),過濾棄去雜質，用鹽酸(0. 5 mol/L)調解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 1條件下氮氣吹干，用流動相定容至I ml，溶液經0.45 y m的微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。色譜條件Waters C18反相色譜柱(4. 6 mmX250 mm, 5 iim);柱溫35 °C;流動向體積比為5:5的甲醇和水(含0. 2%磷酸)混合溶液；流速0. 8 ml/min ;進樣量20 U I ;波長205 nm ;用外標法進行定量測定。利用本方法對植物激素進行前處理得到較好的純化和富集。該方法與高效液相色譜連用，成功測定了絲瓜種子內源激素GA3的含量。進行加標回收率實驗，平均回收率為71. 33%，RSD小于3. 84%，符合激素測定要求。實際測定授粉后發育28天的雜交絲瓜種子內源GA3含量為2223. 5 ng/g Fff (鮮重)。本方法具有良好的發展前景，可進一步用于其他植物激素的前處理。
權利要求
1.一種用于HPLC測定絲瓜種子內源激素含量的樣品前處理方法，其特征在于，其處理步驟包括 1)制備待測絲瓜種子植物激素粗提液； 2)濃縮粗提液后，再加入3ml、pH=8. 0,0. lmol/L磷酸緩沖溶液； 3)冷凍去脂，過濾除雜； 4)用0.5 mol/L稀鹽酸調解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相； 5)將酯相濃縮后，用流動相定容至Iml，經0.45 Pm的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。
2.如權利要求I所述的前處理方法，其特征在于，所述待測絲瓜種子植物激素粗提液的制備方法為準確稱取I. 000 g去除外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，并裝入IOml帶蓋離心管中，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4°C冰箱浸提24 h，10000 r/m低溫離心10 min取上清液,再向殘洛中加入4 ml的冷乙腈低溫超聲振蕩I h, 10000 r/m離心10 min取上清液，重復提取2次，合并3次上清液。
3.如權利要求I所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟2)及步驟5)中的濃縮方法是指將步驟I)制備的絲瓜種子植物激素粗提液或步驟4)所得的酯相在35 °C下用氮氣吹干。
4.如權利要求I所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟3)中冷凍去脂，過濾除雜的方法為將步驟2)所得溶液放入-80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min，然后在4°C條件下解凍，10000 r/m低溫離心15 min,過濾棄去雜質即可。
全文摘要
本發明提供一種用于HPLC測定絲瓜種子內源激素含量的樣品前處理方法，其處理步驟包括制備待測絲瓜種子植物激素粗提液；濃縮粗提液后，再加入3ml、pH=8.0、0.1mol/L磷酸緩沖溶液；冷凍去脂，過濾除雜；用0.5mol/L稀鹽酸調解至pH=3.0~3.5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；將酯相濃縮后，用流動相定容至1ml，經0.45μm的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。本方法操作簡單，成本低，可以一次處理多個樣品，可節省時間，純化過程中未做過柱處理，減少了待測物在提取過程中的損失。本方法可用于多種植物激素的提取的前處理，并可滿足高效液相色譜對樣品處理的要求。
文檔編號G01N30/06GK102830183SQ201210267580
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者胡晉, 秦國臣, 王洋, 朱巖芳, 祝水金 申請人:浙江大學