專利名稱：火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法
技術領域：
本發明屬于化學分析檢測領域，具體涉及火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法。
背景技術：
火鍋底料是由牛油、辣椒、花椒、蔥、姜、蒜和香辛料等幾十種材料混合熬制而成的一種固體復合調味料。色澤鮮紅是火鍋的一大特點，其主要成色物質來自辣椒中的辣椒紅色素等天然色素，但也有不法商家為了降低成本、改善賣相，在制作過程中加入各種人工合成色素。人工合成色素通常以苯及其同系物為原料，經過磺化、硝化、鹵化和偶氮化等一系列有機反應制得。毒理學研究發現，有些合成色素有慢性毒性或致癌性，各國都嚴格控制其使用范圍和使用量。鑒于合成色素對人體的危害性，世界各國對合成食用色素的使用種類、使用量和允許使用的食品均有明確規定。日本允許使用的合成色素有莧菜紅、藻紅、誘惑紅、胭脂紅、焰紅、孟加拉紅、桔紅、檸檬黃、日落黃、不退綠FCF或它的銀紅、亮藍，共11種；美國允許使用的有阿洛拉紅、亮藍、赤蘚紅、橘紅2號、堅固綠、靛藍、立索玉紅、日落黃、檸檬黃和橙色B等；歐盟允許使用的有酸性黃、檸檬黃、喹啉黃、日落黃FCF、胭脂紅、偶氮玉紅、莧菜紅、麗春紅4R、赤蘚紅、紅色2G、誘惑紅AC、專利藍V、靛藍、亮藍FCF、亮黑BN、棕色FK、棕色HT、立索爾寶紅BK等。截止1998年底，我國批準允許使用的合成色素有覓菜紅、覓菜紅鋁色淀、月因脂紅、胭脂紅鋁色淀、赤藥紅；赤露紅鋁色淀、新紅，新紅鋁色淀；檸檬黃、檸檬黃鋁色淀、日落黃、日落黃鋁色淀、亮蘭；亮蘭鋁色淀、靛蘭、靛蘭鋁色淀，葉綠素銅鈉鹽、B-胡蘿B卜素、二氧化鈦、誘惑紅；酸性紅等，共21種。由于火鍋底料組成復雜、基體干擾嚴重，檢測色素時按常規方法提取難度大，抽提不完全，影響測定的準確性，因此有必要建立火鍋底料中合成色素的高效和準確測定方法。為保護人體健康建立簡便、可靠、快速和靈敏的分析方法，對于監控火鍋底料的產品質量，確保食品安全，促進我國火鍋行業的健康和穩定發展，促進國際貿易，都具有十分重要的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法。為實現上述目的本發明采用的技術方案是
火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法，步驟如下
I)提取樣本
稱取5. OOg待測試樣于50mL離心管中，加入20mL甲醇-丙酮溶液，60°C水浴lOmin，油脂融化后旋渦混勻，5000rpm離心5min，將上清液轉移至150mL旋蒸瓶中；加入20mL甲醇-丙酮溶液，重復上述操作I次；加15mL 2mol/L尿素甲醇溶液，重復上述操作2次；合并每次上清液于旋蒸瓶中，40°C下旋蒸濃縮至近干。
2)分離凈化樣本
分別用5mL乙酸乙酯-環己烷溶液、5mL水洗滌步驟I)中旋蒸瓶各2次，并將洗滌液轉移至50mL離心試管中，旋潤混勻lmin, 5000rpm離心5 min ;將離心試管中乙酸乙酯-環己烷層轉移至IOmL比色管中，40°C下氮氣濃縮至近干，用乙酸乙酯-環己烷溶液溶解比色管中殘渣并定容至5mL，得待GPC凈化的脂溶性樣本；向離心試管水相中加入ImL磷酸溶液，混勻，得待SPE凈化的水溶性樣本。A、SPE 凈化
將水溶性樣本全部轉移至聚酰胺樹脂層析柱中，以2 3mL/min流經層析柱，同時用5mL O. 1%磷酸溶液洗滌離心試管并轉移至層析柱中，待試液剛剛到達層析柱頂端時，再向層析柱中加入5mL 80%甲醇溶液淋洗并抽空，最后用IOmL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，棄去前3mL洗脫液，收集后7mL洗脫液于IOmL比色管中，并用甲醇定容至刻度，得SPE凈化樣本。B、GPC 凈化
將脂溶性樣本按如下程序進行GPC凈化，得到GPC凈化樣本；
凝膠滲透色譜儀凈化柱400 mmX 25 mm,內裝Bio-Beads, S-X3, 38 Mm 75 Mm填料； 流動相環己烷-乙酸乙酯；
流速4. 7 mL/min ；
進樣量4. 5 mL ；
開始收集時間13 min ；
結束收集時間20 min。3 )濃縮SPE凈化樣本和GPC凈化樣本
將32.9mL GPC凈化樣本和9. OmL SPE凈化樣本轉移至同一旋蒸瓶中，40°C下旋蒸濃縮至近干，用5mL甲醇-丙酮溶液洗滌旋蒸瓶并轉移至刻度試管中，在40°C下氮氣濃縮近干，加入0.9mL甲醇-丙酮溶液溶解刻度試管中殘渣，過濾膜過濾后，供HPLC測定；過濾膜為
O.45 mm親水性聚醚砜膜。4) HPLC 條件
色譜柱C18,250 mmX4. 6 mm (內徑)，5 μ m ；
流動相甲醇-O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，梯度洗脫；
檢測波長程序可變波長，O 13. 7min 520nm ；13. 71 15min 420nm ；15. 01 30min520nm ；
柱溫30°C ;
流速1. OmL/min ；
進樣量10yL ;
后運行時間5. Omin。獲得液相色譜圖。5)結果計算
用色譜數據處理機或按公式(I)計算試樣中合成色素的含量，計算結果須扣除空白
值 CiXfrXl OOO
Xi = ---(I)
WXl 000
式中
Xi——待測試樣中待測物質的含量，單位為毫克每千克；
Ci——從液相色譜圖上得到的待測物質的溶液濃度，單位為微克每毫升；
V——樣液最終定容體積，單位為毫升； m——最終樣液所代表的待測試樣質量，單位為克。步驟4)中所述梯度洗脫的洗脫程序如下
時間/min 甲醇/% O. 01mol/L磷酸鹽緩沖液/%
O1090
14100O
30100O。與現有檢測方法相比本發明可同時檢測多種火鍋底料中水溶性和脂溶性的合成色素，檢測步驟簡便、準確度和精密度高。


圖I為十六種合成色素標準溶液的液相色譜圖(O. 05 mg/L)；
圖中橫坐標表示各色素保留時間，縱坐標表示各色素的響應強度(峰高);第5和第6個峰分別是9. 742和9. 923。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明的具體實施方式
做進一步的描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。本實施例采用的是重慶小天鵝集團生產的麻辣火鍋底料，規格為300g/袋。甲醇、乙酸乙酯和環己烷選用色譜純級的。具體測定過程如下
I)提取
準確稱取5. 00 g試樣(精確至O. 01 g)于50 mL離心管中，分別加入20 mL甲醇-丙酮溶液(1+1，置于60 °C水浴10 min,讓油脂融化后,旋渦混勻2 min, 5000 rpm離心5 min，將上清液轉移至150 mL旋蒸瓶中；再用20 mL甲醇-丙酮溶液(1+1，V/V)重復上述操作I次；加15 mL 2 mol/L尿素甲醇溶液(含5%氨水溶液)重復上述操作2次；合并每次上清液于40 °C下旋蒸濃縮近干。2)凈化
分別用5 mL乙酸乙酯-環己烷溶液(1+1，V/V)、5 mL水洗滌步驟I)中旋蒸瓶各兩次，并將洗漆液轉移至50 mL離心試管中，旋潤混勻I min,5000 rpm離心5 min。將乙酸乙酯-環己烷層轉移至10 mL比色管中，40°C下氮氣濃縮近干，用乙酸乙酯-環己烷溶液(1+1，K/K)溶解殘渣并定容至5 mL，待GPC凈化；向水相中加入I mL磷酸溶液(1+1，K/K)，混勻，待SPE凈化。A、SPE 凈化將經過酸化的水相全部轉移至聚酰胺樹脂層析柱中，以2 3 mL/min流經層析柱，同時用5 mL O. 1%磷酸溶液洗滌離心試管并轉移至層析柱中，待試液剛剛到達層析柱頂端時，再向層析柱中加入5 mL 80%甲醇(含0.1% H3PO4)溶液淋洗并抽空，最后用10 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，棄去前3 mL洗脫液，收集后7 mL洗脫液于10 mL比色管中，并用甲醇定容至刻度(IOmL)。
B、GPC 凈化
凝膠滲透色譜儀凈化柱400 mmX 25 mm (i. d.),內裝Bio-Beads, S_X3, 38 Mm 75Mm填料。流動相環己烷-乙酸乙酯(1+1，V/V)；
流速4. 7 mL/min ；
進樣量4. 5 mL ；
開始收集時間13 min ；
結束收集時間20 min。3)濃縮
將32.9mL GPC洗脫液和9. O mL SPE洗脫液轉移至旋蒸瓶中，40°C下旋蒸濃縮至近干，用5 mL甲醇-丙酮溶液(1+1，V/V)少量多次洗滌旋蒸瓶并轉移至刻度試管中，在40°C下氮氣濃縮至近干，加入O. 9mL甲醇-丙酮溶液(1+1，V/V)溶解殘渣，過濾膜(O. 45 mm親水性聚醚砜膜)后，供HPLC測定。4)液相色譜(HPLC)條件
色譜柱C18,250 mmX4. 6 mm (內徑)，5 μ m,或相當者；
流動相甲醇-O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液(4. 17)，梯度洗脫程序如下
時間/min 甲醇/% O. 01mol/L磷酸鹽緩沖液/%
O1090
14100O
30100O ；
檢測波長程序可變波長，O 13. 7min 520nm ；13. 71 15min 420nm ；15. 01 30min520nm ；
柱溫30 °C ；
流速1. 0 mL/min ；
進樣量10 UL ；
后運行時間5. O min。5)液相色譜測定
根據樣品中被測物的含量，選定峰面積相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣液中各種合成色素的響應值均應在儀器的線性范圍內。標準工作溶液和樣液等體積穿插進樣測定，在上述色譜條件下，各目標化合物的參考保留時間見中表I。標準溶液的液相色譜圖參見圖I。表I十六種合成色素的參考保留時間
權利要求
1.火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法，步驟如下 1)提取樣本 稱取5. OOg待測試樣于50mL離心管中，加入20mL甲醇-丙酮溶液，60°C水浴lOmin，油脂融化后旋渦混勻，5000rpm離心5min，將上清液轉移至150mL旋蒸瓶中；加入20mL甲醇-丙酮溶液，重復上述操 作I次；加15mL 2mol/L尿素甲醇溶液，重復上述操作2次；合并每次上清液于旋蒸瓶中，40°C下旋蒸濃縮至近干； 2)分離凈化樣本 分別用5mL乙酸乙酯-環己烷溶液、5mL水洗滌步驟I)中旋蒸瓶各2次，并將洗滌液轉移至50mL離心試管中，旋潤混勻lmin, 5000rpm離心5 min ;將離心試管中乙酸乙酯-環己烷層轉移至IOmL比色管中，40°C下氮氣濃縮至近干，用乙酸乙酯-環己烷溶液溶解比色管中殘渣并定容至5mL，得待GPC凈化的脂溶性樣本；向離心試管水相中加入ImL磷酸溶液，混勻，得待SPE凈化的水溶性樣本； A、SPE凈化 將水溶性樣本全部轉移至聚酰胺樹脂層析柱中，以2 3mL/min流經層析柱，同時用5mL O. 1%磷酸溶液洗滌離心試管并轉移至層析柱中，待試液剛剛到達層析柱頂端時，再向層析柱中加入5mL 80%甲醇溶液淋洗并抽空，最后用IOmL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，棄去前3mL洗脫液，收集后7mL洗脫液于IOmL比色管中，并用甲醇定容至刻度，得SPE凈化樣本； B、GPC凈化 將脂溶性樣本按如下程序進行GPC凈化，得到GPC凈化樣本； 凝膠滲透色譜儀凈化柱400 mmX 25 mm,內裝Bio-Beads, S-X3, 38 Mm 75 Mm填料； 流動相環己烷-乙酸乙酯；流速4. 7 mL/min ； 進樣量4. 5 mL ； 開始收集時間13 min ； 結束收集時間20 min ； 3)濃縮SPE凈化樣本和GPC凈化樣本 將32.9mL GPC凈化樣本和9. OmL SPE凈化樣本轉移至同一旋蒸瓶中，40°C下旋蒸濃縮至近干，用5mL甲醇-丙酮溶液洗滌旋蒸瓶并轉移至刻度試管中，在40°C下氮氣濃縮近干，加入0.9mL甲醇-丙酮溶液溶解刻度試管中殘渣，過濾膜過濾后，供HPLC測定； 4)HPLC測定條件 色譜柱C18 ； 流動相甲醇-O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，梯度洗脫； 檢測波長程序可變波長，O 13. 7min 520nm ；13. 71 15min 420nm ；15. 01 30min520nm ； 柱溫30°C ;流速1. OmL/min ； 進樣量10yL ; 后運行時間5. Omin ； 獲得液相色譜圖；5)結果計算 用色譜數據處理機或按公式(I)計算試樣中合成色素的含量，計算結果須扣除空白值
2.根據權利要求I所述火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法，其特征是步驟4)中所述梯度洗脫的洗脫程序如下 時間/min 甲醇/% O. 01mol/L磷酸鹽緩沖液/% O1090 14100O 30100O。
3.根據權利要求I所述火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法，其特征是步驟3)中所述過濾膜為O. 45 mm親水性聚醚砜膜。
4.根據權利要求I所述火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法，其特征是步驟4)中所述色譜柱規格為250 mmX4. 6 mm, 5 μ m。
全文摘要
本發明公開了一種火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法。該方法包括火鍋底料中新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、日落黃、酸性紅G、酸性大紅GR、羅丹明B、對位紅、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ、蘇丹橙G和蘇丹紅7B等多種合成色素的提取、濃縮、凈化和同時檢測方法。本發明提供的火鍋底料中多種合成色素的同時測定方法具有步驟簡便、準確度和精密度高的優點。
文檔編號G01N30/88GK102636592SQ201210143699
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者唐柏彬, 張進忠, 張雷, 李應國, 李賢良, 王國民, 鄭小玲, 郗存顯 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心