專利名稱：分泌抗番茄黃化曲葉病毒單抗雜交瘤細胞株及其單抗應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗的應用。
背景技術：
番茄是全球重要的蔬菜作物，它品種多，適應性廣，營養豐富，是全世界總產量最高的30種農作物之一。雙生病毒對番茄的危害是番茄生產的重要制約因素之一，尤其是近幾十年來雙生病毒病在全球范圍的擴展蔓延導致其在番茄上的危害日趨嚴重。在所有侵染番茄的雙生病毒中，番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, ITLCV)危害最為嚴重。ITLCV最早于1964年在以色列被發現并正式命名，之后的30年間該病害迅速擴散到中東、地中海沿岸、東南亞地區、美國、日本、澳大利亞、印度、墨西哥等眾多國家和地區。20世紀90年代中期，隨著雙生病毒的傳毒介體一B型煙粉虱入侵我國，導致煙粉虱傳番茄雙生病毒在我國由東向西、由南向北急速蔓延，嚴重威脅我國產值近千億元的番茄產業。2005年秋，ITLCV首次在廣西番茄主產區百色市田陽鎮大面積爆發，2006年在上海、 江蘇和浙江等地相繼被發現，之后迅速擴展至安徽、山東、河南、河北、廣東、重慶、云南、福建、遼寧和北京等地。目前全國已有15個省(自治區、直轄市)發現該病毒的危害現象，已造成嚴重損失的地區有浙江、江蘇、安徽、山東、河南和河北等省。番茄黃化曲葉病由番茄黃化曲葉病毒(ITLCV)引起，該病毒隸屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬 (Begomovirus),具有典型的雙生病毒孿生顆粒形態，病毒粒子的大小約為20 X 30 nm。其基因組結構組成因不同分離物而分為單組份或雙組份。病毒鏈上的AVl基因編碼病毒的外殼蛋白(Coat protein，CP)，與病毒粒子的包裝、介體傳毒、系統侵染及與寄主的互作相關。感染TYLCV的植株發病癥狀與病毒分離物、寄主的遺傳背景、生長階段以及環境條件有關，癥狀的表現會有所差異。發病植株的典型癥狀為頂部葉片變小、皺縮卷曲黃化，節間縮短，植株明顯矮化，開花延遲，花朵減少，坐果少而小，成熟期果實不能正常轉色，且成熟不均勻。 該病在番茄生長各階段均可發生。若在開花前感病，果實產量和商品價值均大幅度下降，嚴重時造成的損失可達100 %。番茄黃化曲葉病毒主要通過B型煙粉虱傳播，煙粉虱獲毒后可終生傳毒，但不經卵傳，研究表明嫁接也可導致病毒的傳播，但不能經機械摩擦或種子傳毒。ITLCV寄主很廣，據報道能夠侵染包括栽培作物以及雜草在內的12個科的30多種植物，一些無癥帶毒的雜草和野生植物往往成為下茬番茄作物的侵染源，同時傳播介體煙粉虱也具有很廣的寄主范圍。加上各地區氣候條件、品種和栽培方式有所不同，單憑一種方法很難達到有效防治效果，因而對TYLCV的防治應采用因地制宜的綜合防治措施，為此建立一套靈敏、快速的病毒檢測方法對該病毒的監控和防治具有重要的意義。而目前僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法和核酸雜交等方法對小樣本進行病毒檢測。本發明以原核表達的TYLCV衣殼蛋白(CP)為抗原通過雜交瘤技術制備了 1株抗TYLCV的特異性單克隆抗體， 以制備的單抗為核心建立了檢測ITLCV的高通量的血清學方法，并成功應用于田間ITLCV 的檢測，從而為我國番茄黃花病毒病早期監測和預警，防控策略提供物質和技術支持。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種分泌抗番茄黃花曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗應用。分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏號為CGMCC No. 5538, 它能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。雜交瘤細胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達 10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結合反應。抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法和免疫學試劑盒。本發明與現有技術相比具有的有益效果1)提供的雜交瘤細胞株能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、 Tissue-ELISA、和TAS-ELISA等免疫學方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準確、 靈敏的檢測番茄黃化曲葉病毒；2)利用本發明所制備的單克隆抗體檢測番茄黃化曲葉病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設備；3)利用本發明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物中番茄黃化曲葉病毒的檢測。


圖1是dot-ELISA方法檢測番茄ITLCV的靈敏度分析；
圖2是Tissue-blot ELISA方法檢測番茄樣品中ITLCV的結果。
具體實施例方式分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，于2011年11月觀日，保藏于中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5538，它能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。雜交瘤細胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達 10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結合反應。抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法和免疫學試劑盒。本發明提供的雜交瘤細胞株能大量分泌抗番茄黃化曲葉病毒單抗，且該單抗特異性強、效價高、穩定性好。以該單抗為核心建立了檢測TYLCV的高通量的血清學方法，并成功應用于田間TYLCV的檢測，從而為我國番茄黃化曲葉病的早期監測和預警、科學防控提供物質和技術支持。下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。一、雜交瘤細胞獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原的制備
根據已報道的ITLCV-SH2編碼外殼蛋白基因序列(登錄號)設計一對特異引物CP-F (5，-AATGGATCCATGTCGAAGCGACC-3’，劃線部分為 BamHI 酶切位點)和 CP-R (5，-CCCAAGCTTTTAATTTGATATTG-3，，劃線部分為HindIII酶切位點)，并由上海英駿生物技術有限公司合成。利用CTAB法提取番茄病樣的基因組總DNA，以總DNA為模板，進行常規 PCR 擴增，S卩模板 μ ，5XPrimeSTARTM Buffer (含]\%2+)10μ1，dNTP Μ χ4μ1,PrimeSTARTM DNA Polymerase (2.5 U/μ L) 0. 5μ1，上下游引物各 μ ，最后雙蒸無菌水補足反應終體積為50μ1。PCR反應體系如下預變性94°C 2 min，變性94°C 30 s，退火52°C 45 s，延伸72°C 1 min，循環擴增35次，最后延伸72°C 10 min。擴增產物于0. 8%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參考試劑盒說明書進行。將純化的PCR產物末端加A與克隆載體pMD-18T vector連接，重組質粒命名為PMD18-T-CP，并轉化到大腸桿菌DH 5α的感受態細胞中，用質粒提取試劑盒(AxyGEN) 提取重組質粒，對提取的重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定，并通過測序驗證重組克隆載體pMDIS-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、 NCBI-BLAST,所用的數據庫為GeneBank等。重組質粒pMD18_T_CP中CP基因片段經BamH I和HindIII雙酶切后定向插入經同樣酶切的ρΕΤ-3^ι表達載體中。PCR、酶切篩選陽性克隆，并通過測序驗證重組原核表達載體pET-32a-CP中所攜帶CP基因序列未突變且讀碼框正確。并把原核表達質粒pET-32a-CP 42°C熱擊轉化入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)中， 挑取單菌落接種到含氨卞青霉素抗性的LB液體培養基，37°C培養過夜，按1 : 100的比例將培養物接種于含氨卞青霉素抗性的新鮮LB培養基中，振蕩培養至0D600 ^ 0. 5，加入終濃度為1 mmol . L-I IPTG誘導表達4 h，離心收集菌體。部分菌體加入1 X SDS-PAGE上樣緩沖液懸浮，沸水中處理5-10 min, 12 000 rpm離心后取上清10 μ 進行12. 5% SDS-PAGE 電泳分析，其余菌體經超聲波破碎，收集上清按照產品說明書進行用M2+-NTA親和層析柱純化目的蛋白。以純化的重組CP蛋白作為免疫原及檢測抗原。2.免疫動物
用純化的ITLCV-CP蛋白免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠純化的CP蛋白以生理鹽水稀釋與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點注射0. 2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射 0. 2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合。3.細胞融合
取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無血清的 RPMI-1640 (Gibco)培養基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640 培養基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養基懸浮，分裝到96孔細胞培養板中， 37°C，5 % C02的細胞培養箱中培養。4.雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及其克隆
細胞培養箱中培養5天后，用HAT培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底5%-50%時，以表達純化的ITLCV-CP為包被抗原用常規間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲60多個陽性孔。選擇5個呈強陽性反應的細胞孔，進行有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗TYLCV的特異性單抗的雜交瘤細胞株D10。經6個月以上體外傳代和多次凍存復蘇后，細胞株均能良好生長，并穩定分泌抗體。經擴大培養后，用于腹水制備和液氮保存。5.單克隆抗體的特異性檢測
用感染中國番木瓜曲葉病毒(PaLCuCNV)、煙草曲莖病毒(TbCSV)、中國勝紅薊黃脈病毒(AYVCNV)、臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV)和中國番茄黃化曲葉病毒(ITLCCNV)的組織提取液包被ELISA反應板，以相應的健葉提取液作陰性對照，以感染番茄黃化曲葉病毒的番茄病汁葉為陽性對照，用間接ELISA法測定單抗的特異性反應。間接ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后 IOOul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉30-60min;加入單抗IOOul/孔， 370C 1-2小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標記羊抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)IOOul/孔，37°C 1-2小時，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色， 2mol/L氫氧化鈉終止反應后，用酶標儀讀取OD4tl5的值，以與陰性OD值比值大于2. 1為陽性。結果發現，DlO單抗對TYLCV有特異性反應，而與PaLCuCNV、TbCSV、AYVCNV、ToLCTWV和 TYLCCNV其他病毒均無特異性反應。6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入 5-10 X IO5個雜交瘤細胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心 3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0. 06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清1小時，12000rpm離心20min， 收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動透析M小時后即獲純化的腹水抗體，_70°C保存。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴散試驗，結果為DlO單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，結果為上述單抗腹水效價在10 —6以上。二、病毒檢測免疫學方法及其試劑盒
1.用單抗建立的抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)按1:20 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液進行包被，即100 μ L每孔加至酶標板，TYLCV病葉為陽性對照，相應健葉為陰性對照，37°C 2h，或 4°C過夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后IOOul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)標記的羊抗鼠IgG 二抗 (Sigma), IOOul/ 孔，37°C，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物IOOul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽性，或用2mol/L氫氧化鈉終止反應后，用酶聯免疫檢測儀測0D405值，以P/N> 2. 1作為陽性判斷標準。ACP-ELISA方法檢測靈敏度檢測單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對病葉從1 :10至5120作倍比稀釋，以相應稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進行上述ACP-ELISA方法檢測。結果表明ACP-ELISA方法對 1 10 640倍稀釋的病葉汁液呈陽性反應，即對檢測病葉的靈敏度可達到1 :640，表明 ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。2.檢測 TYLCV 的 TAS-ELISA 檢測方法 2. 1. TAS-ELISA方法的操作流程
(1)抗TYLCV-CP的兔抗血清1 3000倍稀釋后(由純化的原核表達TYLCV-CP免疫兔子制備)IOOul/孔包被聚苯乙烯板，37°C，2-4h或4°C，過夜；
(2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉200ul/孔于 37 °C 封閉 30-60min ；
(3)加入檢測樣品IOOul/孔。以TYLCV病葉為陽性對照，以相應的健康樣品作陰性對照，37°C l-2h ；
(4)洗滌后用封閉液5000倍稀釋單抗腹水，IOOul/孔，37°Cl-2h ；
(5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標記羊抗鼠IgG二抗(Sigma) IOOul/孔，37°C l-2h ；
(6)PBST洗滌后拍干，加PNPP底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽性，2mol/L氫氧化鈉終止反應后，用680型酶聯免疫檢測儀測405nm的OD值，以 P/N> 2. 1作為陽性判斷標準。2. 2. TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定
采用TAS-ELISA方陣試驗進行，即橫向加用包被緩沖液從1 : 100至1 : 128000倍比稀釋的兔抗TYLCV血清；ITLCV病葉汁勻漿液；縱向加用封閉液從1 : 1000至1 : 512000 倍比稀釋單抗腹水；AP標記的羊抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說明書稀釋，1 10000倍；按 TAS-ELISA方法流程進行操作。結果為TYLCV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1 : 3000、1 5000。2. 3. TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將TYLCV病葉汁用含3% BSA的PBS倍比稀釋后進行TAS-ELISA測定，結果為TAS-ELISA檢測病葉的靈敏度達到1 2560倍稀釋(w/V， g /mL)，說明本方法具有很好的靈敏度。3. dot-ELISA方法的建立及田間檢測應用
將番茄葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1 10 30 (w/v, g /mL)加入0. 01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ 1上清點到NC膜上，同時設置健康和感病番茄葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入1 5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC 膜放入1 8000倍稀釋的AP酶標記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min ； PBST洗膜4 5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris CU0. 1 mol/L NaCl,0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應，肉眼觀察結果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應，拍照記錄結果。用方陣試驗確定dot-ELISA單抗和酶標二抗的最適工作濃度，試驗表明DlO單抗及酶標二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測TYLCV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當番茄葉片稀釋到1 320倍(w/ ν, g/mL)時，以DlO單抗建立的dot-ELISA檢測仍呈現紫色的陽性斑點，即其檢測病葉的靈敏度達到1:320倍稀釋(圖1)。
4. Tissue-blot ELISA (組織印跡ELISA)檢測番茄黃化曲葉病毒方法及其試劑盒 4.1 Tissue-blot ELISA 檢測方法
Tissue-blot ELISA檢測方法中將硝酸纖維素膜剪成適當大小，鋪墊在三層干凈的吸水紙上。將植物組織用刀片迅速橫切，將橫切面在膜上壓印;Γ5 s，其中葉片需緊卷成筒后用刀片橫切。其后膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測番茄中ITLCV 方法相同。用建立的Tissue-blot ELISA方法對2011年采自番茄發病田間或大棚的疑似帶毒樣品進行檢測。結果發現，82個水稻檢測樣品中有M個樣品產生紫色的陽性斑點 (圖2)，陽性樣品進一步用RT-PCR分析，結果表明所有的Tissue-blot陽性樣品均檢測到 ITLCV特異性的PCR產物，PCR產物核酸測序表明陽性樣品感染ITLCV。說明該Tissue-blot 方法能準確、可靠地用于番茄樣品中番茄黃化曲葉病毒的檢測。4. 2檢測番茄黃化曲葉病毒Tissue-blot ELISA試劑盒
1)試劑盒主要成分
TYLCV單克隆抗體1管0. 2 ml
AP標記羊抗鼠IgG 二抗 1管0. 1 ml
NBT/BCIP底物各1瓶分別為2 ml和Iml
陽性對照1 (ITLCV番茄組織)1管2 ml
陰性對照1 (健康番茄組織)1管2 ml
抗體稀釋液(IOX)I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)操作步驟
a.將硝酸纖維素膜放在吸水紙上；
b.將植物組織用刀片迅速橫切，將橫切面在膜上壓印3 5s，其中葉片需緊卷成筒后用刀片橫切；
c.同時設置健康和感病番茄分別作為陰性和陽性對照，膜室溫干燥10 20min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1 5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
f.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 8000稀釋的AP酶標記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
g.PBST洗膜4 5次，每次3 min ； 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris CU0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應，肉眼觀察結果；h.待陽性對照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應，拍照記
錄結果。3)保存及有效期于2 8°C避光保存，有效期12個月。4)緩沖液配方
磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 01 mol/L, ρΗ7· 4)
NaCl8 g
KCl0. 2 g
KH2PO40. 2 g
Na2HPO4* 12H203g
疊氮化鈉0. 2 g
加蒸餾水950溶解后調pH至7. 4，定容至1000 ml
洗滌液(0. 01 mol/L PBST)
1000 ml 0. 01mol/L PBS 中力口 0. 5 ml Tween-20
封閉液
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
權利要求
1.一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏號為CGMCC No. 5538，其特征在于能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。
2.一種如權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa 鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結合反應。
3.—種如權利要求2所述的抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應用， 其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法和免疫學試劑盒。
全文摘要
本發明公開了一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗的應用。克隆了番茄黃化曲葉病毒上海分離物(TYLCV-SH2)的外殼蛋白基因，利用原核表達系統表達了該病毒的外殼蛋白，用表達純化的蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，經細胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩定傳代并分泌抗TYLCV單抗的雜交瘤細胞株D10，其保藏號為CGMCCNo.5538。D10單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10-6以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。利用D10單抗建立的檢測番茄中TYLCV的dot-ELISA檢測方法，當病葉1:320倍稀釋(w/v,g/mL)時仍能檢測到病毒。建立的dot-ELISA和Tissue-blotELISA方法能準確、特異、靈敏地檢測田間番茄樣品中的TYLCV病毒。抗TYLCV單抗的制備及其檢測方法的建立為該番茄病毒病的診斷、預測預報及科學防控提供技術和物質支撐。
文檔編號G01N33/577GK102559603SQ20121000419
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者劉歡, 吳建祥, 周雪平, 尚海麗, 謝艷 申請人:浙江大學