基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的CAPS分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業生物技術工程領域，特別涉及一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病 基因 Ty-3的CAPS標記及擴增該分子標記的引物、利用分子標記的檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 番前(Solanum lycopersicum L.)屬于前科(Solanaceae)，為一年生草本前科植 物。番茄起源于南美西部地區，是世界范圍內廣泛栽培的重要蔬菜作物之一，深受廣大消費 者的喜愛。隨著番茄栽培面積的逐年擴大，栽培方式的多樣化，番茄病蟲害問題日趨嚴重， 近年來，番茄黃化曲葉病毒病在世界各地保護地番茄種植上普遍發生，給番茄生產帶來巨 大經濟損失。
[0003] 近年來，番茄黃化曲葉病毒病抗病育種取得長足進步，截止目前，已發現了7-1、丁7_ 2、丁7-3、了7-3&、了7-4、了 7-5等多個抗性基因，其中了7-1、了7-2、了7-3作為番茄抗了￥^^的主效 抗性基因在生產中得以應用(Liedl，et al. ,2013)。
[0004] 近年來，分子標記尤其是以PCR為基礎的DNA分子標記技術在番茄育種中廣泛應 用，大大加快了育種的進程和效率。目前，已有諸如REX_l(de Castro et al.，2007)、 TG0302(Garcia et al.,2007)、P6-25(Ji ve ark.,2008)和UF_TY3-P23(Verlaan,et al·， 2013)等多個與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因緊密的連鎖標記被陸續開發出來，并逐步在 育種實踐中加以應用。但這些標記均與抗病基因間存在一定的遺傳距離，故篩選時會出現 一定比例的假陽性。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因 Ty-3的CAPS標記， 該標記與Ty-3基因完全連鎖。
[0006] 本發明的另一目的在于提供該分子標記在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3檢 測以及標記輔助育種中的應用。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明提供了一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因 Ty-3 的CAPS標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本發明還提供了一種擴增基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3的CAPS標記的 弓丨物對，該引物對序列如下：
[0009] 正向引物序列：5' -TTGCCACATTAAGCAGAACG-3' ；
[0010] 反向引物序列：5'-TGATGGTCATTGAATGTGCT-3'。
[0011] 本發明還提供了一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3的CAPS標記的檢測 方法，該方法以抗感番茄黃化卷葉病毒的番茄基因組DNA為模板經PCR擴增，擴增產物經 BamHI酶切后得到能同時鑒定抗病親本、感病親本及其雜合體的基因型的特異譜帶，該特異 譜帶為攜帶抗性基因的植株譜帶和不攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因 Ty-3的 植株譜帶為核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的分子標記。
[0012] 上述方法中，能同時鑒定抗病親本、感病親本及其雜合體的基因型的特異譜帶分 別為 332bp，21 lbp/121bp，332bp/21 lbp/121bp。
[0013] 上述方法中，不攜帶抗性基因 Ty-3的植株PCR擴增產物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0014] 上述方法中，PCR反應體系（20yL)為：包括正、反向引物各0.8μΜ，1.2πιΜ dNTPs， 2 · 5mMMgCl2，2μ1 10 X buf f er，0 · 5uni ts Taq聚合酶，DNA模板30-50ng，ddH20補至20yL。 [0015] 上述方法中，PCR擴增的程序均為：94°C預變性5min;94°C變性30s，58°C退火45s， 72°(：延伸458,35個循環;72°(：延伸1〇1^11 ;保存溫度4°(：。
[0016] 上述方法中，PCR產物酶切反應體系：15yL反應體系包括PCR產物5.0yL，CutSmart Buffer 1.5yL，BamHI 0.3yL，ddH2〇補至 15yL。
[0017] 本發明還提供了上述分子標記和檢測方法在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因 Ty-3 檢測或標記輔助育種中的應用。
[0018] 本發明有益效果：
[0019] 番茄黃化曲葉病毒病是目前我國番茄生產上威脅最為嚴重的病害之一。本發明從 抗病基因 Ty-3(S〇lyc06g051190)直接入手，開發抗病基因（Ty-3)特異CAPS標記，該標記為 共顯性標記，可直接應用于標記輔助選擇。
[0020] 該標記是一個基于PCR技術的共顯性標記，跟RFLP、AFLP等標記相比，可顯著降低 成本，節省勞力。另外，該標記完全基于抗病基因 Ty-3，與Ty-3基因共分離，用其檢測不存在 假陽性問題。將該標記應用于苗期選擇，不僅可以減少工作量，而且能夠避免因接種不充分 難以準確篩選出具有抗病基因的個體植株，從而加速育種進程。
【附圖說明】
[0021] 本發明有如下附圖：
[0022]圖1為CAPS標記(Ty-3-CAPS)在感病材料和抗病材料中的部分DNA序列 [0023] (A39中存在BamM酶切位點，A45中無 BamM酶切位點）；
[0024] 圖2為CAPS標記Ty-3-CAPS在親本間及F1中的酶切結果
[0025] (1:100bp ladder;2_3:感病親本A39;4_5:抗病親本A45;6_7:Fi單株）
[0026] 圖3為CAPS標記Ty-3-CAPS在F2群體中的驗證
[0027] (M:D2000; 1-48 :F2 代單株）；
[0028] 圖4為CAPS標記Ty-3-CAPS在回交群體中的應用
[0029] (M:D2000; 1-48 :BCi 代單株）。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的保護范 圍。
[0031] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0032] 實施例1基于Ty-3基因的CAPS標記的開發及驗證
[0033] 1.供試材料
[0034]本試驗所用的抗病自交系A45和感病自交系A39經已知分子標記P6-25檢測，A45為 抗病純合體(Ty-3/Ty_3)，而A39為感病純合體(丨7-3八7-3)<^45為母本439為父本配制雜 交組合，得到F1后，再自交得到F2分離群體。
[0035] 2.接種鑒定
[0036]抗性鑒定采用煙粉虱接種鑒定法，具體參照楊曉慧(2012)的方法。于幼苗2-3片真 葉期，將其放置于放有帶毒煙粉虱的生長室內，兩周后殺死帶毒的煙粉虱，之后將苗子移栽 到日光溫室或大田中，觀察病情結果。
[0037] 3. CAPS分子標記的開發及驗證 [0038] A、CAPS標記的開發
[0039] Verlaan等（2013)報道Ty-3基因即為Solyc06g051190。登陸SGN(Sol Genomics Network)網站( //solgenomics.net/)，獲得Solyc06g051190序列，利用在線引物設計 軟件Primer 3plus，分段設計引物(表1)。本試驗中所用到的番前材料A45和A39的基因組 DNA從2-3周幼苗的葉片中用CTAB法提取(Fulton et al. ,1995)。根據設計的引物，對樣品 A45和A39的DNA進行PCR擴增。PCR擴增體系:擴增反應的總體積為50yL，5. OyL模板DNA，5.0μ L 10XPCR Buffer(含Mg2+)，4.0yL High Pure dNTPs(2.5mM)，10yM的上下游引物各l.OyL， 0.3yL EasyTaq DNAPolymerase(5U · μΓ1)，(ΗΗ2〇33·7μΙ^ΡΟ?反應程序為：94°C 預變性 51^11;94°(：變性11^11，55°(：退火458,72°(：延伸1111丨11，35個循環 ；72°(：延伸1〇111丨11;保存溫度4 °C。取PCR擴增產物約10yL，在1 %瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR擴增結果，Bio-RAD自動凝膠成 像系統觀察照相，記錄電泳結果。瓊脂糖凝膠電泳檢測成功后，PCR產物使用膠回收試劑盒 (Z