專利名稱：利用生物分析儀測定液體樣品的被分析物含量的方法
技術領域：
本發明涉及利用生物分析儀測定液體樣品的被分析物含量的方法。
背景技術：
生物傳感器可被細分成基于親和性的生物傳感器和代謝性生物傳感器，用于待檢測液體樣品中包含的預定被分析物的優選選擇性和特異性檢測各用于濃度測量。在這樣的情形中，一大類各式各樣的生物傳感器包含:受體層，其可以具有固定在表面上的大量受體，所述受體例如抗體、半抗原、DNA、細胞或酶；信號轉換器，其輸出與結合在所述受體層上的被分析物的量相關的測量信號；以及信號處理系統，其用于放大和/或進一步處理由所述信號轉換器輸出的測量信號。被分析物可以是液體樣品中的待檢測物質，所述物質例如為生物化學、生物學或醫學系統中待檢測的蛋白質、肽、抗體、酶或一些其他物質。然而，被分析物也可以是在環境監測或水質監測的情形中需要檢測或測定的細胞、細胞組分或DNA或例如活性成分。在基于親和性的生物傳感器的情形中，在給定情況下，除了被分析物之外，可能還必需使其他物質連接于受體層的受體。優選以高特異性和選擇性結合于受體的物質，在這里被統稱為靶分子，或者也被稱為這樣的受體的配體。因此，在給定生物傳感器的情況下，被分析物表示受體的靶分子。然而，其他靶分子也可以是不同于真正被分析物的分子，并且，這些分子類似地連接于受體層的受體，并與例如被分析物競爭受體層的結合位置。在代謝性生物傳感器的情形中，被分析物和/或其他靶分子在瞬時結合于受體層后發生催化轉化，在代謝性生物傳感器的情形中所述受體層含有至少一種酶、細胞、細胞組分或其他催化有效的生物分子，它們在給定情況下能夠催化轉化所述被分析物和另外存在的物質。為了檢測液體樣品中的被分析物或測定其濃度，將液體樣品與受體層進行接觸，使得被分析物分子以及在給定情況下存在于液體樣品中的其他靶分子連接于受體層或被受體層轉化。通過這種方式實現物理和/或化學變化，例如涂層厚度、折射率、光吸收或電荷的變化。可以利用信號轉換器來檢測和/或定量測定這些變化。用于記錄所述變化的適合的信號轉換器包括例如光電傳感器和測量電流或電壓的傳感器。也可以用具有例如發光或磁特性的標記物直接或間接標記結合在受體層上的祀分子，或者在祀分子結合到受體層上之后進行直接或間接的后續標記。在這種情況下，光學傳感器適合作為用于記錄發光的信號轉換器，或者磁性傳感器適合用于記錄磁特性。適合作為標記物的其他物質還包括催化后續化學反應的酶，其中可以用相應的適合的信號轉換器來記錄所述反應的過程。已知有大量不同的各式各樣的生物傳感器方法。下面將提及并通過實例簡要解釋最常用的方法:-肓接法:被分析物結合在受體層的受體上，并且不存在其他靶分子。在這種方法的改良中，被分析物在結合到受體上之前或之后與一種或多種附加物質(標記物)反應，這一般來說用于直接或間接引入被分析物不具有的物理特性，并因此可以通過測定這種所提供的物理特性來檢測被分析物的結合。因此，在直接法的情形中，被分析物在受體層上的結合被直接檢測到，或通過檢測與被分析物反應的標記物而被間接檢測到。
-競爭法:一般來說，向待檢測被分析物含量的液體樣品添加已知濃度或活性的其他靶分子(競爭物)，然后將如此獲得的待測量液體施加到受體層。在這樣的情況下，在被分析物與競爭物之間存在對在受體層的受體上的結合的競爭。一般來說，競爭物具有標記物，這繼而直接或間接地向系統中引入可以被檢測到的物理特性。因此，在競爭法的情形中，競爭物在受體層上的結合被直接檢測到，或通過檢測競爭物的標記物而被間接檢測到。然后可以從測量信號推導出液體樣品的原始被分析物濃度。
-結合抑制試驗:向待檢測被分析物含量的液體樣品添加已知濃度或活性的與被分析物結合的互補分子。隨后，將如此形成的測量液體引導到具有受體的受體層上，所述受體結合游離的互補分子，但不與被分析物結合。可以利用適合的方法直接檢測這種結合。可選地，互補分子在結合到受體上之前或之后或與被分析物結合之前或之后，可以與標記物直接或間接反應。因此，在結合抑制試驗的情形中，直接檢測互補分子在受體上的結合，或者直接或間接檢測互補分子上的標記物。然后，可以從測量信號推導出液體樣品的被分析物濃度。
為了制備受體層，將受體固定在固體載體材料上，即與固體載體材料結合。這可以通過例如受體在載體材料即所謂的基底的表面上的非特異性吸附來進行。然而，受體的共價鍵合或經由大量其他結合層的結合，也是用于制備受體層的已建立的方法。因此，例如，可以將鏈霉親和素共價鍵合于固體載體表面上，并且為了制備受體層，利用生物素與鏈霉親和素之間的親和相互作用將生物素偶聯的抗體連接在鏈霉親和素結合層上。一般來說，人們將構建在固體載體材料表面上的整個層系統稱為生物傳感器的“傳感器基質”，其中最后一層是受體層。
在許多應用中，將具有受體層的傳感器基質施加于被集成在微流體系統中的生物芯片上。一般來說，這些生物芯片是單次使用的產品，其在單次執行被分析物的測定或濃度測量后被丟棄，相應地用新的生物芯片更換。此外，在代謝性生物傳感器的情形中，含有傳感器基質的芯片或筒盒也必須定期更換。其中的原因是生物受體的穩定性和穩健性一般來說低，并且靶分子與受體結合的親和性通常高。因此，一般來說，使結合在受體上的靶分子從受體脫離的條件，也伴有受體層或多或少的破壞。從相關技術文獻只能了解到很少的特殊情況在其中描述了受體層的這種再生，即在保持受體層的功能性基本上不變的同時幾乎完全移除靶分子。然而，根據現有技術狀態，這對于絕大多數生物傳感器、特別是用于測定蛋白質的生物傳感器來說是不可能的。
其中使用帶有受體層的單次使用芯片的自動或半自動生物分析儀是已知的。因此，例如在歐洲專利EP I 343 011 BI中，描述了一種用于核苷酸序列的電化學檢測的裝置。這種裝置具有用于導入液體樣品的可更換的分析盒，優選實施為單次使用的部件。所述盒具有帶有受體層的測量電極，核苷酸序列選擇性且特異性地結合在所述受體層上。所述分析盒可以經由模擬接口與計算系統相連，其中可以利用所述計算系統來執行核苷酸序列的電化學檢測。
相反，為了將生物傳感器、特別是基于親和性的生物傳感器應用于過程測量技術，例如用于自動監測工業工廠中的生物技術過程或用于自動監測例如水中的藥物殘留或內分泌活性物質的含量，希望能夠一個接一個地執行多個測量，而不需每個測量都更換或調換芯片或含有傳感器基質的其他部件。對于這樣的測量任務來說，生物傳感器的一種可能應用可以是生物分析儀，待監測的過程介質的液體樣品被特別是在線地供應給所述生物分析儀。任選地，可以用執行上面描述的方法的試劑例如用其他靶分子、標記物等，優選自動地對液體樣品進行預處理。生物分析儀還包括:受體層，液體樣品或通過預處理獲得的待測量液體被供應給所述受體層；信號轉換器，其輸出與結合在受體層上的被分析物或靶分子的數量相關的測量信號；以及信號處理系統，其進一步處理測量信號并輸出測量值，特別是從測量信號推導出的測量值。在自動或半自動分析儀中，可以利用泵裝置、氣動系統或其他液體運輸系統來執行樣品和在給定情況下的試劑向受體層的供應，以及液體樣品或待測量液體在蒸發測量后的排出。為了維持所需試劑量以及蒸發分析后待廢棄的液體體積，用于樣品和在給定情況下的試劑的小的供應和排出管線應該具有盡可能小的橫截面，例如在亞毫米范圍內。這樣的具有在亞毫米范圍內的橫截面的液體管線，在后文中也被稱為微流體管道。具有這樣的微流體管道的生物分析儀模塊，也被稱為微流體單元。為了將用于這些目的的生物分析儀的維護工作降至最低，或者為了提高自動化程度，對適合于一個接一個地執行多個測量并且其中傳感器基質及其相應的受體層可以在現場、以高的可重復性被基本上完全再生或更新的生物傳感器，存在著需求。關于如何能夠使生物傳感器的傳感器基質或受體層再生，從文獻中已知有不同的方法。在這樣的情況下，通常改變溶劑以便引起受體與靶分子之間的結合的解開。為此，通常改變溶液的PH值。此外，也常常進行離子強度或溶劑極性的改變或添加特異性作用物質，以便實現受體層的再生。然而，這些方法的缺點在于，為了能夠多次再生受體層，對于每種受體-靶分子相互作用來說，必須在復雜的試驗運行中確定最佳再生效率與受體的最小破壞之間的最適折衷。根據這些方法，受體或受體層的更新是不可能的。A.T.Ttidos , E.R.Lucas-van-den Bos, E.C.A.Stigter, “脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的基于表面等離子體共振的快速抑制測定法”(Rapid surface plasmon resonance-basedinhibition assay of deoxynivalenol), Journal of Agricultural and FoodChemistry51 (2003), 5843-5848，描述了這樣的一種受體層再生方法，所述受體層使用半抗原作為特別小且穩健的受體。宣稱了在499和717個之間的再生循環。對于免疫測定法來說，在受體是蛋白質的情況下，沒有已知的受體層可以類似地成功進行多次再生。從EP 2 189 793 Al 了解到，為了從相應受體層的受體移除靶分子，可以使用選擇性分解與受體相連的靶分子的酶。然而，在這樣的情況下，必須注意所使用的酶不會同等地攻擊受體，這強烈限制了應用這種技術的能力。由于結合的靶分子的這種酶性分解的化學特性，在多次執行方法后維持所述受體的密度顯得極為不可能。用于再生生物傳感器的受體層的另一種方法包括經由寡核苷酸、因此經由短的DNA或RNA分子來結合受體。為此，將寡核苷酸共價鍵合到表面，并將形成用于結合受體的相應結合層的受體或分子與互補的寡核苷酸偶聯。互補寡核苷酸之間的特異性親和相互作用導致受體固定在表面上，并由此導致形成受體層。互補寡核苷酸之間的親和相互作用可以通過化學方法或通過提高溫度來移除，以便從表面釋放受體。然而，在蛋白質存在下，例如在存在作為受體的抗體的情況下，這種方法一般是不可執行的，這是由于在面對升高至超過40°C的溫度時或者在釋放所需的試劑存在下，蛋白質一般來說會變性。在這樣的情況下，特別是在蛋白質含量高的情況下、在蛋白質變性的情況下，可能形成難以溶解的蛋白質聚集物，在不使用攻擊性化學清潔的情況下，所述蛋白質聚集物只能被不完全地移除，并且，所述蛋白質聚集物通過粘著并積聚到例如液體供應和排出系統的液體管線，可以極為麻煩地影響自動或半自動生物分析儀的功能。當結合在受體層上的分子彼此橋接或交聯時，情況也是如此。在這種情況下，也必須使用攻擊性化學條件來釋放這些橋接或交聯的分子。此外，在面對移除蛋白質聚集物所需的攻擊性化學條件時，表面鍵合的寡核苷酸也不再穩定。
此外，從文獻中了解到第一類用于電化學移除結構簡單的生物層的方法。與使用純化學手段例如通過酸、堿溶液或溶劑來化學移除傳感器基質、相應的受體層相比，在電化學移除受體層的情形中，實現了經由帶有受體層的基底的電流流動，這導致受體層、相應的傳感器基質的氧化或還原釋放(解吸附)。
因此，例如在Seokheun Choi, Junseok Chae, “微流體應用中經由現場電化學表面再生的可重復使用的生物傳感器”(Reusable biosensors via in situelectrochemical surface regeneration in microfluidic applications), Biosensorsand Bioelectronics25 (2009) 527-531, Seokheun Choi, Junseok Chae, “微流體裝置中使用短鏈自組裝單層的電化學解吸附的再生性生物傳感表面” (A regenerative biosensingsurface in microfluidics using electrochemical desorption of short—chainself-assembled monolayer), Microfluidics and Nanofluidics7 (2009) 819-827 或Christie A.Canaria等,“在水性溶液中燒基硫醇鹽自組裝單層在金上的形成和移除”(Formation and removal of alkylthiolate self-assembled monolayers on gold inaqueous solutions), Lab on a Chip 6 (2006) 289-295 幾篇文章中，描述了利用燒基硫醇作為結合分子將受體施加在金表面上以便通過這種方式提供受體層的方法。在這些文章中還描述了與如何移除被用作結合分子的烷基硫醇這一問題相關的調查。在這樣的情況下，特別是通過已釋放的烷基硫醇的重新吸附和由烷基硫醇的電化學分解引起的氫產生而出現了問題。此外，在重復制備和移除層的情形中，觀察到存在表面占據情況的連續漂移，這表明移除不完全。在引述的文章中都沒有探索在受體層占據情況不同的情況下清潔效力是否相等。然而，這對于在用于過程測量技術的自動生物分析儀中的應用來說是必不可少的，這是由于生物傳感器測量一般來說基于一個或多個參比測量來進行，在所述參比測量的情形中受體層的占據一般來說發生得不完全或幾乎完全。特別是在SPR測量的情況下，正如文章中所描述的，參比測量的質量對于測量結果的質量起到決定性的重要作用。因此，例如在Seokheun Choi, Junseok Chae,“微流體應用中經由現場電化學表面再生的可重復使用的生物傳感器，，(Reusable biosensors via in situ electrochemical surfaceregeneration in microfluidic applications), Biosensors and Bioelectronics25(2009)527-531的情形中，不應假定在受體層上結合有大量纖維蛋白原的情況下(圖3c)清潔效力與受體層上僅結合有很少纖維蛋白原的情況下相同。
對于生物傳感器在過程測量技術中的自動或半自動應用來說，重要的是順序執行的濃度測定能夠產生彼此相當的測量結果。因此，需要一種即使在受體層多次再生或更新后，例如在50、100或更多個再生或更新循環后，也能對相等的靶分子濃度產生基本上相等的測量信號、即強度相當的測量信號的系統，特別是在測量信號相對于參比測量而言的情況下。

發明內容
因此，本發明的目的是提供適合應用于過程測量技術、利用上述類型的生物分析儀測定液體樣品中的被分析物含量的方法，并相應地提供適合用于執行這種方法的生物分析儀。這個目的通過利用生物分析儀自動現場測定液體樣品的被分析物含量的方法來實現，所述生物分析儀包含具有至少一個測量導管的微流體系統以及引導一種或多種液體通過所述測量導管的裝置，其中所述測量導管具有至少一個基底，所述方法包括用于至少在測量區內執行測量的如下所述的可重復執行的步驟:( i )制備具有多個受體的傳感器基質，所述受體優選選擇性且特異性地、特別是由于親和相互作用而結合所述被分析物和/或其他靶分子，或引起所述被分析物或所述其他靶分子的化學轉化，所述制備包括引導至少第一化學物質的制備溶液通過所述測量導管的步驟，所述第一化學物質包括至少一個結合在所述基底上的官能團以及至少一個其他官能團，其中多個所述第一化學物質經由結合在所述基底上的官能團結合在所述基底上，其中結合在所述基底上的多個所述第一化學物質的其他官能團用作受體或用于隨后結合受:體；(ii)引導所述液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測量液體通過所述測量導管，其中包含在所述液體樣品或所述待測量液體中的被分析物和/或包含在所述液體樣品或所述待測量液體中的其他靶分子，優選選擇性且特異性地結合在所述受體上，或被所述受體化學轉化，并測定與被所述受體結合或轉化的靶分子的量或與被所述受體結合或轉化的被分析物的量相關的測量變量，并從所述測量變量推導出所述液體樣品的被分析物含量；以及(iii)再生并相應地清潔所述至少一個基底。特別是可以將所述至少一個基底再生，其中所述傳感器基質以及在給定情況下與所述傳感器基質結合的分子特別是被分析物分子、其他靶分子或結合在所述傳感器基質上的其他物質，基本上完全從所述基底釋放和/或至少被部分分解。通過這種方式，所述至少一個基底可以被完全或基本上完全清潔，即至少被充分清潔，使得留在所述基底上的所述傳感器基質的殘留組分和可能結合在所述傳感器基質上的物質僅有非常少的量，以致在重復所述步驟(i)_ (iii)的情況下，即在新制備所述傳感器基質、新引導新的液體樣品的情況下以及在新再生所述基底的情況下，不產生明顯的影響，特別是對測量的準確性不產生明顯影響。步驟(i)_ (iii)的序列在下文中也被簡稱為“測量循環”。由于通過移除傳感器基質和可能與所述傳感器基質結合的分子，并隨后重新制備所述傳感器基質來將基底定期再生并相應地重新清潔，因此，出于維護目的而更換基底或伸入到生物分析儀的其他機械裝置、特別是伸入到其中執行所描述的方法的測量導管中的其他機械裝置，不是必需的。因此，液體樣品的分析可以被完全自動地執行，一個接一個地執行大量測量循環。由于基底被完全或基本上完全清潔，因此確保了在順序測量循環中，傳感器基質具有基本上相當的特點，這確保了在不同測量循環中獲得的測量結果和相應的分析結果具有非常良好的可比性。
至少可以在預定的測量區內執行測量，所述測量特別包括步驟(ii)的引導所述液體樣品或所述待測量液體通過所述測量導管，并測定與被所述受體結合或轉化的靶分子的量或與被所述受體結合或轉化的被分析物的量相關的測量變量。測量區是測量導管表面的一部分。基底被至少部分布置在測量區中，然而，它也可以延伸到測量導管內或微流體系統的其他液體管道內的測量區之外。
使用本發明的方法，其上結合靶分子特別是被分析物的受體，經由第一化學物質而結合在基底上。在這樣的情況下，受體可以由第一化學物質的其他官能團形成。在這種情況下，通過將第一化學物質固定在基底上，在單一制備步驟中形成了受體層。于是，傳感器基質僅由受體層構成。如果官能團形式的受體不是第一化學物質的直接組分，那么其他官能團可用于結合受體。在這種情況下，第一化學物質結合在基底上形成第一結合層，受體繼而可以通過例如特異性結合在其他官能團上，而被直接結合或經由一個或多個其他結合層被結合在所述第一結合層上。在每種情況下，可以通過使含有在每種情況下結合在最上方結合層上、用于形成附加結合層的其他化學物質的附加制備溶液流過，來順序形成一個或多個附加結合層。通過這種方式，傳感器基質由一個或多個結合層以及結合在最上方結合層上的最終受體層形成。由第一化學物質形成的最下方結合層和每個其他結合層，優選通過特異性親和相互作用、例如經由生物素-鏈霉親和素結合或抗體與其抗原之間的結合，而被結合在每種情況下形成位于下方的層的化學物質的結合位置上。此外，受體也優選經由特異性親和相互作用而被結合在最上方結合層上。施加附加結合層，即經由第二化學物質和可能的其他化學物質將受體間接結合在第一化學物質上，提供了可以如下實施的優點，即在給定的結合層系統上，可以將大量不同的受體制備成受體層，但是其中所有受體相對于它們的結合使用相同的官能團，使得不需要對結合層和受體進行匹配。
在步驟(iii)中進行基底再生之前，可以將步驟(ii)重復一次或多次，所述步驟(ii)包括引導并分析所述液體樣品或通過用試劑處理例如混合所述液體樣品而產生的待測量液體。
通過重復執行方法步驟(i)至(iii)的序列，受體層以及相應的傳感器基質總是可以現場、即在沒有伸入到測量導管中的機械裝置的情況下被重新重構在相同基底上，并因此可以以自動方式確定一個接一個供應到生物分析儀的液體樣品的被分析物含量。優選情況下，方法步驟(i)至(iii)可以被執行至少50次，優選至少150次，更優選至少300次。
術語“官能團”一般是指決定性地確定帶有它們的化合物的材料特性和反應行為的原子團。在這里以及下文中，官能團的概念還包括:能夠形成與其他化學物質的優選特異性的結合相互作用的原子團或分子區；以及結合在化學物質上的標記物、特別是分子，例如由分子、肽、蛋白質或蛋白質標簽形成的標記物。例如，結合在烷基硫醇上并用作用于受體-靶分子結合的結合配偶體的生物素分子，形成所述烷基硫醇的第一官能團。所述烷基硫醇的硫醇基形成第二官能團。
結合在基底上的第一化學物質的官能團優選與基底材料匹配。基底可以是例如金屬或者可以包含至少一個金屬涂層。
在這里，術語“受體”是指如上所定義的官能團，互補分子、也稱為靶分子優選選擇性且特異性地、特別是由于親和相互作用而結合在所述受體上，或者其他化學物質被所述受體酶催化轉化。在這樣的情況下，不一定必須涉及生物學意義上的受體例如抗體。許多不同方法可用于測定液體樣品的被分析物含量。例如，可以將被分析物作為靶分子直接結合在受體層上(直接法)。也可以將被分析物和不同于所述被分析物的靶分子結合在受體層上，以便記錄與結合在受體層上的靶分子的數量相關的測量變量，并從所述測量變量確定被分析物濃度(競爭法)。還可以將待測量液體在引導通過測量導管之前與預處理溶液混合，其中所述預處理溶液含有已知濃度的被分析物反應配偶體，然后再將混合物引導通過測量導管。在這種情況下，未與被分析物分子結合的剩余反應配偶體用作靶分子，其中從結合在受體表面上的靶分子的數量，可以推導出所測量溶液中被分析物的濃度(結合抑制試驗)。術語“測定被分析物含量”是指被分析物的純定性檢測、一定樣品體積的待測量液體中被分析物級分的半定量測定、或甚至是待測量液體中被分析物的定量濃度測定或活性測定。優選情況下，根據這里和下文中描述的方法測定被分析物含量，不用于測定脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在這里以及下文中，術語“化學物質”特別是指分子、復合體、生物分子聚集體或微生物。分子可以包括例如酶、肽、蛋白質或DNA。復合體的實例是蛋白復合體，其也被稱為蛋白聚集體。微生物可以包括特別是細胞，例如酵母細胞。在有利實施方式中，基底是導電的。在這樣的情況下，它可以是例如測量導管的導電表面區域，其可以實施為例如在測量導管壁上的金屬膜。基底可以包含例如具有高親硫特性的化學上穩定的金屬，特別是諸如金或鉬的金屬。在這種情況下，官能團在基底上的結合可以包括硫原子鍵合、特別是共價地鍵合于基底。特別適合于此的是硫醇或二硫化物基團。第一化學物質的實例包括硫醇，特別是烷基硫醇和聚乙二醇硫醇。本領域的技術人員已知這樣的分子可以作為生物化學分子、特別是生物傳感器的受體的結合分子，即所謂的連接物(比照上面引用的文章)。使用硫醇基結合表面作為基底，烷基硫醇在基底例如金或鉬基底與硫醇基的硫原子之間形成共價鍵，并通常在表面上形成自我組織化的單層，也稱為自組裝單層或簡稱SAM。然而，這樣的SAM的形成對于構建傳感器基質以及相應的受體層來說不是絕對需要的。這里以及下文中描述的方法優選自動進行，其中包含電子數據處理單元例如微型計算機的控制單元控制引導液體通過測量導管和記錄測量值。用于引導液體的裝置可以包括特別是泵例如注射泵或氣動裝置。從生物分析儀的適合于記錄測量變量的信號轉換器輸出的測量信號可以被控制單元轉化成數字信號，并可以從所述數字信號形成測量變量的測量值。可以使用純化學手段來進行基底的再生，例如通過將含有過氧化物的氫氧化鈉溶液弓I導通過測量導管以溶解傳感器基質。基底的再生和相應的清潔，也可以通過在基底和經由電解質與基底導電接觸的對電極之間產生電流流動來進行，以便特別是基本上不依賴于基底被傳感器基質以及在給定情況下與所述傳感器基質結合的其他物質的當前占據情況而清潔基底。因此，為了移除傳感器基質，在基底與對電極之間產生電流流動，以便實現基底的清潔，這意味著完全或幾乎完全移除和/或至少部分分解傳感器基質和可能與所述傳感器基質結合的物質。
如果用于制備所述層的物質之一含有位于其下方的層的物質或形成隨后層的物質的大于一個的結合位置，那么在各個層具有高覆蓋度的情形中，可以在分子水平上發生共價或非共價鍵合聯結，從而形成交聯網絡。在這些情況下，通過溶解層結構來移除受體層以及使用純化學手段例如通過酸、氧化劑或有機溶劑來清潔基底，通常是不完全的，或者只能在損壞基底的情況下實現。然而已發現，通過在基底和經由電解質連接與基底導電接觸的對電極之間產生電流流動來電化學溶解層結構，引起了全部層結構的盡可能完全的釋放和基底的清潔。特別是，當在表面上產生的電流流動足以電解產生氧或氫或可選地氧和氫時，可以實現導電表面的盡可能完全的清潔(電化學清潔)。有利的是，對電化學清潔進行優化，使得傳感器基質和與所述傳感器基質結合的分子或其他化學物質的釋放，與傳感器基質的至少部分分解一起發生。
在基底與對電極之間產生電流流動的步驟，可以被特別執行成使得通過電解在基底和/或對電極上形成氫和/或氧。通過這種方式，在每種情況下，由電流流動和產生的氫或氧實現的受體層以及相應的傳感器基質的氧化和相應的還原的清潔作用，還被進一步擴大。與此相反，在上面引述的Seokhun Choi等的文章中,在清潔期間,在含有氯化物的溶液例如磷酸鹽氯化鈉溶液存在下執行層的氧化解吸附，這排除了更高電勢以及與其相關的傳感器基質的氧化分解的應用，因為否則的話，在正電勢的情況下由此形成的金氯絡合物將弓I起金表面的破壞。然而，如果避免了氯化物和/或氰化物的存在，則電化學清潔可以在更高以及相應的更低電勢下，以氧化以及還原兩種方式執行，從而進一步提高清潔效力。特別是可以在基底上建立交替的氧化和還原條件。優選情況下，在電流流動期間，基底與對電極之間的導電接觸由電解質引起，所述電解質含有濃度低于150mmol/l、優選低于15mmol/l、更優選低于1.5mmol/l的氰離子和/或鹵素離子，特別是當基底包含金膜或鉬膜時。
因此，在方法實施方式的情形中，在通過電解在基底上形成氫和/或氧的情況下，可以獲得非常高的清潔效力，其在超過50個測量循環中保持相等，并且在每種情況下，隨后以高的可重復性在現場重新重建傳感器基質。在內部調查中顯示，在這樣的情況下，由層序列烷基硫醇-PEG-生物素-中性親和素(NeutrAvidin)構成的橋接蛋白質層結構和由層序列烷基硫醇-PEG-生物素-中性親和素-BSA-生物素-中性親和素-BSA-生物素-中性親和素構成的高度交聯蛋白質層結構兩者能夠被重復地并以相等尺度被移除，并且在每種情況下，在移除層結構后隨后實施的傳感器基質與在比較實驗中在新的非再生基底上構建的傳感器基質具有相同的特性。
對電極可以被布置在位于測量導管內，特別是與基底相對。因此，對電極可以是例如化學上非常惰性的材料，并優選以膜的形式被施加。這樣的惰性電極材料由例如摻雜硼的金剛石樣碳層形成。這樣的電極被用在例如水處理中，并在那里用于電解產生羥基游離基以分解有機殘留物。
對電極可以類似地作為另一個基底實施在測量導管中，特別是與基底相對放置，在所述另一個基底上結合有結合在基底上的第一化學物質的官能團。例如，基底以及對電極兩者可以包含結合硫醇基或二硫化物基團的導電材料。基底和用作另一個基底的對電極可以例如作為金膜或鉬膜形成在測量導管的相對放置的壁上。通過這種方式，在步驟(i)的執行中，將具有大量受體的傳感器基質形成在基底以及對電極兩者上。在步驟(i i )的執行中，液體樣品中或待測量液體中包含的被分析物和/或其他靶分子優選選擇性且特異性地結合在形成在基底上和附加基底上的傳感器基質的受體上，或者被它們化學轉化。可以測定與被兩個傳感器基質的受體結合或轉化的被分析物的量或與被兩個傳感器基質的受體結合的靶分子的量相關的測量變量。這是特別有利的，這是因為由此增大了可有效使用的基底表面，由于測量信號相應增大，這對測量的準確性具有積極影響。步驟(iii)的再生起到清潔兩種基底的作用。為了控制傳感器基質的電化學氧化和/或還原性移除，在基底與對電極之間產生電流流動期間，可以參照經由電解質、特別是利用電解質橋與基底電解接觸的參比電極的參比電勢來設定、特別是控制基底的電勢。可以通過生物分析儀的控制單元來進行所述控制。通過使用參比電極來調節或控制基底以及相應的對電極的電勢，可以防止在被連接作為工作電極的基底上和/或在對電極上出現過大的正或負電勢，因為否則的話，基底以及相應的對電極可能受到攻擊或甚至損壞。術語“電解接觸”是指經由電解質、特別是含有離子的水性溶液而離子傳導性接觸。優選情況下，包含無隔膜的電解質橋。相反，在上面引述的Seokheun Choi等的文章中，利用雙電極電路進行受體層的還原性移除。由于不存在參比電極，因此不能檢查在兩個電極上實際得到的電勢。通過這種方式，依賴于微流體系統中起支配作用的條件以及電解質濃度和組成，可能在基底上或對電極上產生過大的正電勢或負電勢。這些大的電勢在重復出現時，能夠引起電極功能的破壞。不管怎樣，這使本文公開的發明的目的不能實現。參比電極可以實施為與測量導管相連的附加液體導管的導電涂層。作為參比電極，也可以使用金屬絲特別是鉬絲或金絲形式的無電流操作的假參比電極，其可以被布置在測量導管或與測量導管相連的附加液體導管中。如果在測量循環期間假參比電極被所使用的試劑占據，那么假參比電極同樣被再生或清潔。相對于參比電極的參比電勢，用作工作電極的基底的電勢可以在最小值與最大值之間連續或不連續地、特別是線性地變化，使得通過電化學清潔、特別是使用氧和相應的氫的產生來重新清潔基底。優選情況下，電勢在最大值與最小值之間來回、特別是線性地移動多次，特別是在2和1000次之間。類似地，過程持續時間以及清潔持續時間可以在廣泛限度內變化，并根據清潔結果進行變化或設定。為此，生物分析儀的控制單元可以為服務人員提供相應的輸入設備或用于加載預定過程參數的裝置。任選地，在產生電流流動期間或之后或之間，可以記錄基底上出現的電流水平，以便獲得一個或多個循環伏安圖，從圖中可以推導出導電表面區段的狀態。此外，也可以使用可選分析方法例如光學、電壓測量或其他電化學分析方法來評估基底的狀態。可選地，在基底與對電極之間產生的電流流動的電流水平，也可以在最小值與最大值之間連續或不連續地變化，以便通過電化學清潔來重新清潔基底。在這樣的情況下，在基底與參比電極之間建立的電勢差不能低于最小值，也不能超過最大值，以避免損壞基底。如果對電極類似地用作基底，則這里為被連接作為工作電極的基底所給出的所有數據和條件，同樣適用于對電極。在基底與對電極之間產生電流流動的步驟之前、期間或之后，可以將一種或多種清潔和/或輔助液體引導通過測量導管。在基底與對電極之間產生電流流動之前或之后被引導通過的清潔液體，主要用于基底的化學清潔。適合作為清潔液體的是例如酸或堿溶液或溶劑。用作輔助液體的是例如電解質溶液，其有利地支持導電基底上的電化學過程(例如Na2SO4溶液或添加H2O2)。在電流流動期間被引導通過測量導管的輔助或清潔液體，用于支持電化學清潔。在電流流動期間，特別有利的是酸性并且在給定情況下含有增補的過氧化氫的電解質溶液。施加的電解質在電極上所施加的電勢下不應分解或反應。在這里，相應的所謂的導電鹽是已知的。酸性磷酸鹽緩沖液極其適合于使所添加的過氧化物在儲存期間的無電流分解最小化。
優選情況下，電解質和/或輔助液體在電流流動期間被連續或不連續地引導通過微流體測量導管。通過這種方式，可以防止所需輔助試劑的耗盡或電解產生的反應性物質的富集，這對基底表面的壽命有正面影響。此外，傳感器基質的分解產物以及由電解形成的氣泡從基底表面的區域被移除，這有助于更快速且安全的清潔。
在基底與對電極之間產生電流流動期間，可以將例如酸性磷酸鹽緩沖溶液作為輔助液體引導通過測量導管。相對于銀/氯化銀參比電極的電勢，鉬基底的電勢在-0.5V至-1.25V范圍內的負值(還原，在給定情況下伴有氫的形成)與+1.5V至+2.25V范圍內的正值(氧化，在給定條件下伴有氧的形成)之間變化的情況下，這樣的輔助液體對支持電化學清潔來說是有利的。
在基底再生期間或再生之后，可以檢查基底上傳感器基質的殘留組分，特別是利用電化學測量方法例如循環伏安法或阻抗譜法、光學測量方法例如橢圓偏光法或吸附試驗進行檢查。特別有利的是，為了評估和/或控制再生以及相應的再生效率，可以將再生期間的電流水平考慮在內。在吸附試驗的情況下，將結合在基底上的傳感器基質的殘留組分上的物質引導通過測量導管，然后確定吸附的物質的量。所述檢查也可用于控制再生。
輔助液體還可以包括例如光化學或電化學產生的臭氧，臭氧由于其強氧化效果而被考慮用于傳感器基質的有效分解。此外，也可以使用有效分解傳感器基質的其他化學物質或物理方法。在這種情況下，不需要提供電流流動，因此也不需要基底是導電的。
如果選擇不導電的、特別是非親硫的材料作為基底，并且第一化學物質以經由含硫官能團結合之外的其他方式結合在基底上，則可以使用純化學手段來實現基底的再生以及相應的清潔。例如，基底可以是玻璃，在包含(三烷氧基)甲硅烷基團作為用于結合在玻璃基底上的第一官能團的第一化學物質的協助下，在所述玻璃上制備用于構建傳感器基質的第一結合層。在這種情況下，為了再生基底并相應地移除傳感器基質，可以使用例如含70體積％硫酸和30體積％過氧化氫溶液(30%的水溶液)的溶液。
這里描述的用于清潔基底的所有方法的共同之處在于，不單只存在結合在受體上的被分析物、相應的被分析物分子或可能結合在受體層的受體上的其他靶分子或其他物質的釋放，同樣地也不單只存在傳感器基質從基底上的釋放。相反，優選同時存在傳感器基質組分以及在給定情況下被所述傳感器基質結合的其他分子的分解。通過這種方式，傳感器基質的重復、可靠且有把握的移除可能基本上不依賴于傳感器基質的復雜性，特別是在具有蛋白質作為組分的傳感器基質的情況下，和/或在存在形成傳感器基質的組分和/或與所述傳感器基質結合的分子的上述交聯的情況下。此外，測量程序所需的所有步驟，包括傳感器基質的構建(步驟i)、測定被分析物含量(步驟ii)和傳感器基質的再生和相應的移除(步驟iii)，都在現場執行，即通過將相應的溶液以預定順序相繼引導通過測量導管而不對測量導管進行其他操作。第一化學物質的其他官能團可以包括例如生物素。在這種情況下，受體可以被直接結合在第一化學物質的其他官能團上，或經由結合在第一化學物質的其他官能團上并具有至少一個生物素結合位置的結合生物素的第二化學物質而被間接結合在第一化學物質的其他官能團上。結合生物素的第二化學物質可以包括結合生物素的分子，例如親和素、親和素衍生物或類似于親和素的分子，特別是鏈霉親和素或中性親和素。相反，結合生物素的分子例如鏈霉親和素、中性親和素或親和素、或親和素衍生物，也可以用作第一化學物質的官能團。然后利用結合在受體上的生物素基團直接結合受體，或經由多種結合物質例如結合分子來結合受體。結合在第一化學物質的其他官能團上的受體，可以經由至少一個非共價鍵直接或間接結合在第一化學物質上。當第一化學物質的其他官能團用作受體時，由結合在基底上的第一化學物質形成的層同時為結合層和受體層。當第一化學物質的其他官能團用于結合受體時，由第一化學物質形成的層形成結合層，在該結合層上可以任選形成一個或多個其他結合層，其中受體層被提供為最終層，該最終層由結合在位于其下方的結合層的結合位置上的受體形成。形成各個層的化學物質，在每種情況下可以通過親和相互作用、特別是非共價鍵合，而與形成位于其上方或下方的層的化學物質結合。優選情況下，傳感器基質的每一層根據具體情況，相對于在每種情況下位于其下方的層具有完全的覆蓋度，并且無論如何具有至少超過80%的覆蓋度。通過這種方式確保了，使用順序重新制備的傳感器基質進行的測量產生彼此相當的測量結果，這是由于在這種情況下，總是存在基本上相同數量的受體結合位置，使得每個重新制備的傳感器基質能夠結合相當的最大靶分子數量。這確保了生物分析儀的測量信號的高度可重復性，盡管傳感器基質是連續重新制備的。與本發明相關的術語傳感器基質的“層”不一定被理解為形態學描述。相反，術語“層”是指在相同結合步驟中并以相同方式結合、優選非共價地、更優選經由親和相互作用結合在位于其下方的層的化學物質上或基底上的多個化學物質。層不必僅僅由多個相同的化學物質例如相同的分子、特別是相同的蛋白質形成，相反，也可以包含大量不同的化學物質。決定性的是在相同的結合步驟中例如在將包含形成所述層的化學物質的制備溶液傳送通過的過程中，經由基本上相同的物理相互作用力進行結合。為了獲得高的可重復性和小的個體變差，特別有利的是在重復或多次制備傳感器基質的情況下，將受體層的受體的平均表面密度以及在有利情況下平均取向盡可能保持恒定。這可以通過在制備傳感器基質的情況下使各個層的表面密度盡可能高和/或盡可能接近各自的平衡狀態來實現，所述平衡狀態各自由在位于其下方的層的結合位置上形成特定層的物質的結合和釋放構成。術語超過80%的覆蓋度是指在每種情況下，在用于結合的條件的情況下，在表面的覆蓋度超過平衡狀態下的覆蓋度的80%的情況下的表面的覆蓋程度，所述用于結合的條件基本上是制備溶液中待結合的物質的濃度、流速、結合速率和流體測量導管的幾何形狀。在測量導管的預定幾何形狀的情況下，引導相應溶液通過測量導管的流速和持續時間可以以彼此之間匹配并與溶液濃度匹配的方式進行選擇，并使得能夠獲得超過80%的覆蓋度。所述參數可以在初步實驗中被確定，然后被提供用于執行所描述的用于確定被分析物含量的方法。覆蓋度可以通過測量來確定，其中相應物質的覆蓋度通過例如橢圓偏光法或利用微米尺度石英而被直接測量到，或通過向相應的層供應與相應物質特異性結合的分子，并通過例如光學方法確定結合的分子的數量而被間接測量到。
為了可重復地設定受體層的某一受體密度，在傳感器基質的每一層的情況下，在下文中被稱為“結合物質”或者也稱為結合分子的形成結合層的特定物質可以與另一種化學物質相結合，所述另一種化學物質結合在位于其下方的層的與結合物質相同的結合位置上，但是不具有隨后被引導通過測量導管的化學物質可以結合在其上的其他官能團。結合物質的具體表面密度由結合物質的濃度、結合物質與一種或多種其他化學物質的濃度比和尺寸比、以及結合和釋放的相應平衡比所決定。類似地，也可以同樣地設定受體層的受體密度。因此，例如在傳感器基質帶有層序列金基底/烷基硫醇-PEG-生物素/中性親和素/生物素偶聯的抗體的情況下，將生物素-聚乙二醇與生物素偶聯的抗體混合能夠降低受體層的受體的表面密度。在這種情況下，受體與聚乙二醇的層同樣也被稱為受體層。也可以以同樣的方式來設定結合層中結合物質的密度。
與被受體結合的靶分子或被受體轉化的靶分子的量相關或與被受體結合或轉化的被分析物的量相關的測量變量，可以是光學測量變量，特別是根據發光測量、反射測量或吸收測量來確定所述光學測量變量。對于適合于生物分析儀的方法來說，由于尤其是由溫度和電解質波動所引起的大的擾亂性影響，SPR測量是不太適合的。為了確定光學測量變量，在例如靶分子上可以結合有或隨后結合有具有發光特性即熒光或磷光特性的官能團或轉化在后續步驟中供應的底物溶液以產生光(化學發光)或顏色變化的官能團。
當測量變量是由靶分子直接或間接產生的化學發光或靶分子的發光標記物的發光時，有利的是，基底以及相應的含有基底的測量區透射至少10%、優選至少50%或甚至至少70%的波長范圍在300nm和900nm之間的光。一般來說，對于在生物分析儀中使用光學測量方法來說，有利的是，基底以及相應的含有基底的測量區透射至少10%、優選至少50%或甚至至少70%的測量輻射。例如，基底可以作為具有晶格結構的金屬膜被施加在測量導管的壁上。在這種情況下，通過晶格結構的中間空間發生透射。
在實施方式中，被分析物可以是肽或蛋白質，其中除了被分析物之外的其他靶分子是不同于被分析物的另一種分子，特別是源自于被分析物并具有標簽、優選為蛋白質標簽的肽或蛋白質，所述標簽用于直接或間接產生測量變量或影響測量變量。不同于被分析物的靶分子可以是例如競爭物，所述競爭物由于親和相互作用而與被分析物同樣結合在受體上(比照競爭法)。可選地，不同于被分析物的靶分子可以是優選選擇性且特異性結合在受體層上的分子，特別是與被分析物分子形成復合體的肽或蛋白質，使得結合在受體層上的靶分子數量是被分析物濃度的度量(比照結合抑制試驗)。
這樣的具有蛋白質標簽并形成其他靶分子的蛋白質或肽，可以作為包含蛋白質標簽的重組蛋白或肽而被產生。在這樣的情況下，有利的是隨后不必進行蛋白質或肽與蛋白質標簽的化學偶聯，所述蛋白質標簽被用于隨后通過標記物進行直接或間接標記。如果具有蛋白質標簽的蛋白質或肽包含與被分析物相同的基礎蛋白質或基礎肽，則還存在另一個優點，即一般來說，被分析物和不同于被分析物的分子與受體的親和相互作用通常在相同的數量級。
為了測定與結合在受體上的被分析物分子或其他靶分子的量相關的測量變量，可以將標記物直接或間接結合在結合于傳感器基質上的被分析物上或結合在另一種靶分子上。標記物用于直接或間接引入影響測量變量的特性。具體地，它可以經由蛋白質標簽而被結合在具有蛋白質標簽的靶分子上。這可以例如通過將標記物或帶有作為官能團的標記物的化學物質的溶液引導通過測量導管來實現，其中所述標記物或帶有標記物的化學物質，具有在被分析物、其他靶分子、或靶分子的蛋白質標簽上結合的官能團。在后一種情況下，標記物特異性結合在結合于受體層上并具有蛋白質標簽的靶分子上，而不結合在同樣結合于受體層上的被分析物分子上。可選地，在先前的方法步驟中用標記物標記靶分子，使得已經標記有標記物的靶分子被引導通過測量導管，這也是一種選擇方案。與已知的蛋白質分析方法相比，優選作為競爭物的帶有蛋白質標簽的靶分子的應用，提供了極大優點，即為了測定不同的被分析物，只需要直接或間接結合在靶分子的蛋白質標簽上的標記物，或者蛋白質標簽本身就是標記物。因此，例如，使用綠色熒光蛋白(GFP)作為起到標記物作用的蛋白質標簽，提供了將其熒光作為測量變量引入的優點，利用光學信號轉換器可以直接測定所述熒光，和/或通過隨后結合針對GFP的抗體例如酶偶聯的抗體可以間接測定所述熒光。
適合直接結合的標記物除了 GFP之外，還包括其他發熒光物質，例如發熒光的納米粒子。有利情況下，間接結合的標記物可以經由親和相互作用而被結合在靶分子或被分析物上。在這種情況下，所描述的蛋白質標簽特別適合作為通用結合結構，用于隨后直接或間接結合標記物。除了例如由于某些熒光或吸收特征而可被檢測到的化學物質之外，適合的標記物還包括在其他化學物質存在下影響特別是可以通過信號轉換器而被光學檢測到的測量系統的特性的化學物質。它們的實例是進入化學反應并特別是由于化學發光或顏色變化而從所述化學反應產生可檢測的光學信號的標記物。這樣的標記物的實例是過氧化物酶，其在魯米諾(Iuminol) /H2O2溶液存在下,實現通過過氧化物酶催化的化學發光。
用于執行上述實施方式之一的方法的生物分析儀包含具有至少一個測量導管的微流體系統和用于將液體引導通過測量導管的裝置，
其中測量導管包括至少一個基底，在所述至少一個基底上，至少在測量區內、至少有時布置有具有多個受體的傳感器基質，所述受體優選選擇性且特異性地結合或化學轉化液體樣品或通過用至少一種試劑處理液體樣品而獲得的待測量液體中存在的靶分子或被分析物，
其中生物分析儀包括至少一個信號轉換器，所述信號轉換器根據結合在受體上或被受體轉化的被分析物的量或根據結合在受體上的靶分子或被轉化的靶分子的量而輸出測量信號。
結合的被分析物或結合的靶分子的量，對應于結合在受體上的被分析物分子或靶分子的數量。
可以將對電極布置在微流體系統內，所述對電極被特別布置在測量導管內與第一基底相對放置，并優選用作另一個基底。如果對電極用作另一個基底，那么在該另一個基底上也至少有時布置有具有多個受體的傳感器基質。傳感器基質的制備以及基底和用作另一 個基底的對電極的再生，可以如上所述根據自動現場測定液體樣品的被分析物含量的方法
來進行。基底和對電極可以與流過測量導管的電解質的流動方向相關地布置，使得由于基底與對電極之間的電流流動而出現在電解質中的氣泡被導流，以使所述氣泡基本上不影響電流流動。對電極可以實施為微流體系統的導管的導電涂層，相應地作為膜，其特別是可以與測量導管不同，但與它們粘合。它優選可以被布置在測量導管內，例如與基底相對或與其共軸放置。生物分析儀還可以包含被形成在微流體系統內的參比電極，所述參比電極經由電解質橋、特別是無隔膜電解質橋與至少一個基底導電連接。基底、對電極和在給定情況下參比電極，可以實施為它們被布置在其中的微流體系統的導管壁上的可導電連接的膜，特別是金屬涂層。微流體系統可以包含第一部件，其具有表面，其中測量導管以及在給定情況下其他導管、特別是與測量導管相連的用于液體運輸的導管，實施為凹陷部，其中至少第二部件與所述第一部件相連并覆蓋凹陷部，并將它們針對環境液密地密封。如此形成的液體管線，在液體可以從其導入到微流體系統中的一個或多個儲液器與液體可以從微流體單元轉移到其中的廢液容器之間延伸。第一和第二部件可以特別由電絕緣的、優選透明的材料例如玻璃或合成材料如塑料構成。基底、對電極以及在給定情況下參比電極，可以作為可導電連接的膜、特別是作為金屬涂層形成在第二部件上。在可選實施方式中，微流體系統可以包含第一部件、特別是平面平行的第一板，以及與所述第一部件隔開布置的第二部件、特別是平面平行的第二板，其中所述第一部件和第二部件經由布置在第一部件與第二部件之間的一個或多個間隔元件、特別是一個或多個中間板而彼此相連，其中所述一個或多個間隔元件具有中間空間和/或穿孔，所述中間空間和/或穿孔形成在所述第一部件與第二部件之間延伸的導管結構，包括所述測量導管以及在給定情況下與所述測量導管相連的用于液體運輸的附加導管。第一和第二部件特別是電絕緣的、優選透明的材料，例如玻璃或塑料。所述一個或多個中間板可以是例如柔性的。因此，它們可以實施為例如有機硅墊的形式。所述第一和第二部件可以實施為例如玻璃板的形式。在這里，有利的是使用顯微鏡載片。在這種實施方式中，基底、對電極以及在給定情況下參比電極，可以是第一和/或第二部件上的可導電連接的膜、特別是金屬涂層的形式。在其他實施方式中，可以使用導電的微流體小管作為基底、對電極以及在給定情況下的參比電極。因此，例如，基底可以是小金管，對電極可以是小鉬管，參比電極可以是內部襯有氯化銀的小銀管。在這種類型的實施方式的情形中，優點在于這些小管的簡單的電學和微流體連接性。在這樣的情況下，一種有利的變化形式由測量導管構成，所述測量導管的測量區由至少內部導電的小管形成，例如小的鉬管，在其內部共軸且不與小管直接接觸地放置有至少在表面上是導電的絲，例如鉬絲。在這樣的情況下，小管可以用作基底，絲用作對電極以及在給定情況下用作另一個基底。此外，顛倒的功能性表示另一種選擇方案。小管可以具有晶格形式的壁，其中晶格的空間是透明的，允許光學輻射通過，使得小管內部的絲可見。由于基底與對電極之間的間隔小，基底和對電極的共軸布置允許高的電流密度，這使得即使在電再生以及相應的清潔期間基底和/或對電極的表面被輕度移除的情況下也具有長使用壽命。
為了進行光學測量，測量導管優選在測量區的區域中實施為其透過至少10%的波長范圍在300nm和900nm之間的光。這種情況發生在例如基底是厚度合計在2和30nm之間的薄的鉬層的實施方式中，或者發生在透明材料上施加例如襯結構的或晶格結構的不透明基底的情形中。
在優選實施方式中，微流體單元或給定情況下的大量微流體單元，與用于供應試齊U、相應的試劑溶液和用于容納廢液的容器一起，被布置在生物分析儀的可更換單元、即所謂的可更換盒中。可更換盒內的容器利用微流體連接系統，與用于將試劑供應到微流體單元中以及用于將用過的液體排入廢液容器中的一個或多個微流體單元相連。液體通過微流體單元的運輸優選間接地例如氣動地進行，以便除了用于遞送待分析液體樣品的管線之夕卜，不需要將附加的液體輸送管線連接到可更換盒。這使得能夠進行生物分析儀的簡單且用戶友好的操作。在將這樣的填充有所需試劑和相應的試劑溶液的可更換盒插入到生物分析儀中之后，在初始步驟中，用液體填充流體管線和導管。隨后可以現場并直接一個接一個地重復執行步驟i至iii，以在生物分析儀的協助下執行測量。可以利用自動樣品獲取系統將用于分析的液體樣品從待監測的過程介質中取出，并經由可更換盒與樣品獲取系統的連接進料到可更換盒，并相應地進料到所述可更換盒中包含的微流體單元。通過這種方式，在這種在線生物分析儀的協助下，可以進行全自動測量。在儲存的且為測量操作所需的試劑以及相應的試劑溶液消耗后，或者在用于容納廢液的容器完全充滿后，將可更換盒更換為新的或復原后的可更換盒。


現在，將根據附圖中示出的實施方式實例更詳細地描述本發明，所述附圖如下所示:
圖1是a)帶有結合的被分析物和靶分子的受體層的第一示意b)帶有結合的被分析物和靶分子的受體層的第二示意圖2是生物分析儀的微流體單元的平面示意圖3是圖2的微流體單元的示意性縱截面；
圖4是a)圖2的微流體單元在電化學清潔之前的平面示意b)圖2的微流體單元在電化學清潔期間的平面示意圖5是生物分析儀的微流體單元的第二種實施方式的示意圖，所述微流體單元由第一部件、形成導管的有穿孔的中間板和第二部件的復合體構成，其中:
a)是第一部件的平面示意b)是形成導管的有穿孔的中間板的平面示意圖；并且
c)是第二部件的平面示意圖6是生物分析儀的微流體單元的第三種實施方式的示意圖，其中:
a)是使用圖6b)的切割面C-C獲得的示意性縱截面；并且
b)是使用圖6a)的切割面B-B獲得的示意性橫截面。
具體實施方式
圖la)是生物分析儀的可再生傳感器基質的示意圖，所述傳感器基質帶有受體R350和結合在受體R350上的被分析物分子R400以及同樣結合在受體R350上的其他靶分子R450。用作傳感器基質的基底3的是結合硫醇基的導電表面。這可以是例如金或鉬表面，其由例如涂層、膜或固體金屬件例如小管形成。鉬和金具有高的親硫特性，并且還具有在化學上穩定以及在面對下面詳細描述的受體層的電化學溶解和新受體層的制備時在化學上不改變、特別是不氧化的優點。
在基底3上布置有第一化學物質的層，所述第一化學物質用作受體R350的結合分子R200。在親硫表面例如金或鉬表面的情況下，用于在基底3上形成結合層的結合分子R200可以是例如具有另一種官能團的烷基硫醇，其中硫醇基與金或鉬表面共價鍵合。結合分子R200的另一個實例是α-巰基-ω-生物素聚乙二醇(也簡稱為硫醇PEG生物素)。它可以經由金屬硫在基底3上的結合而從水性溶液中被結合。通過任選添加具有僅僅一個在基底3上結合的硫醇基但不具有用于結合受體R350的另一種官能團的巰基聚乙二醇，一方面，可以設定生物素基團的表面密度。另一方面，引入的聚乙二醇防止了隨后添加的蛋白質在基底表面上的非特異性吸附。
結合分子R200還具有至少一個其他官能團，所述其他官能團用作結合位置，用于經由官能團結合到受體R350的互補分子的特異性結合。在這種實例中，結合分子R200的其他官能團由烷基硫醇的生物素基團形成。如果α-巰基ω-生物素聚乙二醇用作結合分子R200，則其生物素基團類似地用作用于特異性直接或間接結合受體R350的官能團。在這種實例中，受體R350優選選擇性且特異性地結合在結合于結合分子R200上的分子R300上。在這種實例中，分子R300是結合生物素的分子例如鏈霉親和素。結合分子R200和分子R300 (分子R300優選選擇性且特異性地結合在結合分子R200的其他官能團上，并且受體R350經由分子R300而被結合在結合分子R200上)形成了通用接口，用于將大量可選擇的受體350結合在相同結合分子R200上，并由此用于將多個不同受體(間接)結合在基底3上。在這里示出的實例中，用于將受體R350結合在結合分子R200上的生物素-鏈霉親和素連接非常適合作為通用接口，這是因為生物素化以及相應地用鏈霉親和素標記分子是生物技術中已建立的技術。特別是，生物素官能化的抗體被廣泛用于例如執行免疫測定。
在圖1a)中所示的實例中，結合在受體R350上的是被分析物分子R400和其他靶分子R450，所述其他靶分子R450與被分析物分子R400競爭結合在受體R350上并被生物分析儀用于檢測。與被分析物R400類似，其他靶分子R450能夠通過親和相互作用優選選擇性且特異性地而結合在受體R350上。被分析物R400可以是例如蛋白質。在每種情況下，蛋白質分子相應地優選選擇性且特異性地結合在受體R350上。在這種情況下，其他靶分子R450優選同樣是蛋白質分子，其同樣優選選擇性且特異性地、特別是通過親和相互作用結合在受體R350上。特別是，其他靶分子R450可以是標記的或可隨后標記的蛋白質分子。在本實例中，其他靶分子R450被提供有蛋白質標簽。蛋白質標簽是結合在實際蛋白質上的氨基酸序列。蛋白質標簽在例如親和層析中用于凈化在生物技術方法中制造的靶蛋白，這是通過結合在靶蛋白上的蛋白質標簽與層析柱中使用的結合配偶體的特異性相互作用而將靶蛋白從方法的其余產物中分離來實現的。在本實例中，蛋白質標簽起到直接或間接結合帶有標記物的分子R500的作用。標記物具有物理或化學特性，生物分析儀的信號轉換器可以根據這些特性產生與結合在受體R350上的其他靶分子R450的數量相關并與結合在受體R350上的被分析物分子的數量間接相關的測量信號。為此目的，帶有標記物的分子R500包含官能團，該官能團由于親和相互作用而特異性結合在靶分子R450上、優選結合在它們的蛋白質標簽上。
如果液體樣品中存在的被分析物R400是蛋白質Pfs，那么相應的抗體(抗Pfs抗體)可以用作受體R350。在競爭法中，為了測定液體樣品的被分析物含量，向液體樣品添加用作其他靶分子R450的競爭物，在本情況下，其他靶分子R450例如為重組制造并裝備有血凝素標簽(HA標簽)的Pfs (HA-Pfs)，通過這種方式，獲得了用于生物分析儀所提供的分析的待測量液體。帶有標記物的分子R500可以是例如與過氧化物酶偶聯的針對HA標簽的抗體。通過添加被標記物過氧化物酶催化的魯米諾/H2O2溶液而實現的化學發光，被特別是包含光電二極管的光學信號轉換器轉變成電測量信號，其信號強度依賴于化學發光的強度。所述化學發光的強度又依賴于結合在靶分子R450上的帶有標記物的分子R500的數量。因此，從利用信號轉換器產生的測量信號，可以推導出結合在受體層R450上的靶分子的數量，并可以從該信息得知待測量液體中被分析物分子R400的濃度。可以用生物分析儀的測量電路和/或電子數據處理單元對測量信號進行處理，并可以由此推導出待測量液體以及相應的液體樣品中被分析物的濃度。
為了證實使用這種由結合分子R200和其上結合在受體R350上的優選選擇性且特異性結合的分子R300構造而成的通用結合結構也可以執行完全不同的免疫測定，現在將參考圖1a)給出另一個實例，在該實例的情況中對液體樣品中的卡馬西平進行檢測。與前面的實例中相同，用于結合受體的通用接口，經由被結合分子R200固定的大量生物素基團和與其結合的中性親和素或鏈霉親和素分子R300，而被形成在基底3上。針對藥劑卡馬西平的生物素化抗體R350被結合在所述通用接口上。隨后，將從已添加有過氧化物酶偶聯的卡馬西平衍生物的液體樣品形成的待測量液體引導經過如此形成的傳感器基質。在這樣的情況下，最初包含在液體樣品中的卡馬西平作為被分析物R400結合在受體上，并與以已知濃度存在的過氧化物酶偶聯的卡馬西平分子競爭，所述過氧化物酶偶聯的卡馬西平分子是較早時制造的偶聯物，包含靶分子R450的功能性以及帶有標記物的分子R500的功能性兩者。可選地，也可以使用與HA標簽共價鍵合的卡馬西平作為競爭物。這與使用過氧化物酶偶聯的卡馬西平衍生物相比，具有的優點是，HA標簽具有比過氧化物酶顯著更小的分子量，使得被分析物與競爭物之間的尺寸比盡可能小。如果被分析物與競爭物具有非常不同的尺寸，則可能引起被分析物與競爭物的極為不同的結合親和性，這通常是不合乎需要的。特別是在低分子量被分析物例如卡馬西平的情況下，與這樣的高分子量被分析物的偶聯、例如在酶的情況下與過氧化物酶的偶聯，可引起結合親和性的顯著改變，這對檢測和測定下限有不利影響，并相應地增加測量誤差。
用于結合受體R350的另一種通用層結構被顯示在圖1b)中。在這里，圖1a)中示出的基底3、大量結合分子R200的結合層和優選選擇性且特異性地結合在結合分子R200的官能團上的分子R300這樣的層結構，同樣用于結合受體R350。然而，所述層結構增補有另一種結合層，在該另一種結合層上也可以以各種不同方式結合非生物素化的受體R350。在本實例中，該附加的結合層由生物素化的免疫球蛋白結合分子R310例如針對IgG型免疫球蛋白的生物素化抗體(生物素抗IgG抗體)、或生物素化的蛋白A/G構成。隨后，可以將在過去的免疫學測試方法中已確立的大量不同抗體結合在其上作為受體，而不必改變位于下方的層或其構建方法。
圖2示出了用于檢測液體樣品中的被分析物或測定其濃度的生物分析儀的微流體系統100的平面圖。微流體系統100包括例如透明合成材料的底板la，其在底平面上具有開放的導管結構，所述導管結構由底板Ia中的凹陷部形成并包括導管區段10、15、20、30、40和接合部12、18。位于底板Ia上并將導管區段10、15、20、30、40相對于彼此以及環境密封的，是終端蓋板lb，其例如同樣由透明合成材料形成。這在圖2的切割面A-A上所獲取的圖3的橫截面圖中是明顯的。平臺Ia和蓋板Ib通過形狀、力或材料粘合的互鎖連接件Ic例如膠粘劑粘合或加壓接縫而彼此固定地連接。由蓋板Ib密封的導管區段10、15、20、30、40形成液體管線，待分析的液體樣品以及給定情況下的其他試劑被引導通過所述管線用于執行測量。
此外，平臺Ia包括可以與液體供應管相連的連接件110，120和可以與排出管相連的連接件130、140，液體可以通過所述連接件被進料到導管結構或從導管結構排出。供應和排出管線將微流體系統100與被布置在遠處的儲液器相連，在所述儲液器中容納有用于執行測量以及相應的分析的液體。經由供應和排出管線，可以將待檢測的液體樣品以及在給定情況下被容納在儲液器中并將被添加到液體樣品中的試劑兩者供應到微流體系統100。液體通過微流體系統100的導管結構的遞送和排出，可以例如利用泵或通過氣動方式來進行。
可選地，如圖2中所示，導管結構也可以被看作微流體系統的基礎結構，其不依賴于液體管線的具體實施方式
。因此，也可以例如使用微流體軟管和/或小管來構造圖示的結構。液體管線優選具有在IO7和I μ m2之間、優選在IO6和IO2 μ m2之間、更優選在IO5和IO4 μ Hl2之間的橫截面。
由微流體系統100的導管區段形成的測量導管30包括基底3，所述基底3已經根據圖1進行過描述并實施為測量導管的導電表面區域。基底3可以例如實施為被放置在蓋板Ib上的金屬膜，例如金或鉬膜。與在測量導管30中流動的液體發生接觸的基底區域用作測量區7，傳感器基質被構建在所述測量區中，并且在給定情況下，被引導通過測量導管30的液體樣品或待測量液體中包含的被分析物結合在傳感器基質上，并利用信號轉換器、特別是光學信號轉換器進行檢測。
經由接合部18與測量導管30相連的另一個導管區段40，包含附加的導電的表面區域作為對電極4，其被形成為例如置于蓋板上的金屬膜。基底3以及對電極4兩者經由電連接件(未示出)與恒壓或恒流電壓源相連。如果電解質流過導管區段30和40，則基底3和對電極4經由電解質進行導電接觸。通過在基底3與對電極4之間施加電勢差，可以實現通過電解質的電流流動。
在這里顯示的實例中，在附加的導管區段20中布置有第三導電表面區域，其可以任選用作參比電極2。參比電極2同樣實施為金屬層，特別是微流體單元100的蓋板Ib上的銀層，用于形成Ag/AgCl參比電極。在這里，電連接件也可以連接到例如恒壓或恒流源。
現在，將參考圖2中示例的微流體系統和圖1的帶有受體的傳感器基質，來描述用于制備傳感器基質和用于檢測待測量溶液中的被分析物或測定其濃度的方法。
首先，在基底3上制備傳感器基質。傳感器基質包括具有受體R350的受體層，在所述受體上優選選擇性且特異性地結合待測定的靶分子R450。為此，在第一步驟中，將具有硫醇基和另一種官能團的結合分子R200例如帶有附加官能團的烷基硫醇的第一制備溶液，引導通過測量導管30。結合分子R200經由它們的硫醇基共價鍵合于基底3，并在理想情況下在基底3上形成單層。將制備溶液以優選恒定的流速引導通過測量導管30，持續預定的第一時間長度，直至產生的結合層的如上所定義的覆蓋度安全地達到大于80%。可以在初步實驗中確定為此所需的時間長度。該時間長度特別依賴于流速、結合分子R200的類型、制備溶液的濃度、結合速率和其他環境變量例如溫度。
當已經完成用結合分子R200形成傳感器基質的第一結合層時，在一次或多次洗滌、漂洗步驟(在下面不進一步明確陳述)后，在第二步驟中，將第二制備溶液引導通過測量導管30。該第二制備溶液含有實際的受體R350，受體R350被結合在優選選擇性且特異性地結合在第一結合層上的官能團R300上。例如，形成第一結合層的結合分子R200可以具有生物素基團，結合在受體R350上的結合生物素的基團R300例如鏈霉親和素基團特異性結合在所述生物素基團上。第二制備溶液的進料被執行一段時間長度，該時間長度被選擇成使得由結合在結合分子R200上的受體所形成的受體層的覆蓋度如上所定義合計為至少80%。為此所需的時間長度可以在初步實驗中被確定。
在本實例中，傳感器基質的制備只需要兩個步驟，即將結合分子R200結合在基底3上，以及隨后將受體R350經由它們的官能團R300結合在結合分子R200上。然而，另一個選擇方案是不將受體R350結合在直接特異性結合在第一結合層上的官能團上，而是首先經由一種或多種其他結合分子、由此經由一個或多個其他結合層而結合在第一結合層上。該一種或多種附加的結合分子，在一個或多個附加步驟中通過引導在每種情況下含有將要結合在最后施加層的官能團上的結合分子的相應制備溶液，而被結合。在這樣的情況下，產生了具有一個或多個結合層和最終受體層的傳感器基質的層結構。優選情況下，傳感器基質的所有層具有至少80的覆蓋度，正如上面已經解釋的。
如果受體R350已被施加在表面上，則傳感器基質的制備已經結束，并且可以執行液體樣品中或通過用一種或多種附加試劑處理所述液體樣品而獲得的待測量液體中被分析物的檢測或被分析物濃度的測定。
用于測定被分析物濃度的各個方法步驟依賴于所執行的檢測方法。例如，可以將被分析物結合在受體上，并直接檢測該結合或通過將附加的受體結合在被固定在第一受體上的被分析物上來檢測該結合(夾心試驗方法)。正如上面已經描述的，也可以檢測競爭性結合在受體上的靶分子來代替被分析物。也可以將含有被分析物的測量溶液在較早時與含有結合在被分析物上的靶分子的附加溶液(試劑)混合，以便形成被分析物與靶分子的復合體。然后將該混合物引導通過測量導管并檢測結合在受體層上的剩余游離靶分子(結合抑制試驗)。本領域技術人員已知許多通過將靶分子結合在受體層上來檢測被分析物或測定其濃度的其他方法，正如開始時簡要刻畫的。通過將測量溶液或與一種或多種試劑溶液混合的測量溶液相應地引導通過帶有微流體單元100或下面描述的實施方式的生物分析儀中的測量導管30，可以重現所有這些方法。
在本實例中，執行競爭試驗方法。在這樣的情況下，將含有被分析物R400的待測量液體與含有濃度已知的作為競爭物的其他靶分子R450的溶液的混合物引導通過測量導管30。靶分子R450與被分析物分子R400競爭結合在受體R350上。正如較早時描述的，靶分子R450是標記有蛋白質標簽的蛋白質，并且除了標簽之外，與被分析物R400基本相同。
在將靶分子以及因此被分析物R400和其他靶分子R450結合在受體層上后，在附加步驟中，將含有帶有標記物的分子R500的溶液引導通過測量導管30，所述帶有標記物的分子R500特異性結合在靶分子R450的官能團上，在本實例中是結合在靶分子R450的蛋白質標簽上。在本實例中，帶有標記物的分子是抗HA抗體-過氧化物酶偶聯物。可選地，帶有標記物的分子也可以被間接結合。因此，例如在第一步驟中，可以在含有蛋白質標簽的其他靶分子R450上結合生物素化的抗HA抗體，其上隨后結合標記有熒光染料的鏈霉親和素作為帶有標記物的分子。
如果標記物是過氧化物酶，那么在附加步驟中，將含有魯米諾和H2O2的溶液引導通過測量導管30，其引起發光輻射的發射。利用光電信號轉換器(未示出)例如光電二極管來記錄發出的輻射，并將其轉變成電測量信號。通過信號轉換器將測量信號輸出到測量電路，所述測量電路放大并處理測量信號，并將處理過的測量信號輸出到數據處理系統例如微型計算機。數據處理系統利用安裝的評估程序從測量信號推導出待測量液體中被分析物的濃度，并將該濃度輸出到顯示系統，和/或經由數據線輸出到上級單元。數據處理系統可以是控制單元的部件，所述控制單元控制生物分析儀的功能，處理、儲存并輸出測量信號，并處理和執行來自于服務人員或來自于上級單元的用于生物分析儀的維護和/或控制的輸入命令。
依賴于用于檢測液體樣品或待測量液體中的被分析物或測定其濃度的測試方法，可以使用不同的信號轉換器來產生與結合在受體層上的靶分子數量相關的測量信號。例如，代替用于檢測靶分子的化學發光，也可以激發熒光。在這種情況下，將用于激發熒光的輻射輻照到微流體單元內受體層的區域中，并利用光電信號轉換器例如光電二極管記錄發射的熒光輻射。此外，還可以執行吸收測量來檢測靶分子。在所有這些情況下，有利的是，記錄通過微流體單元100的透明底板Ia或通過微流體單元100的蓋板Ib的測量輻射、即例如發光或熒光輻射，并在給定情況下將必需的激發輻射(用于熒光或吸收測量)相應地發送通過透明底板或蓋板，。對于輻射被輻照到蓋板Ib中或記錄通過蓋板Ib的輻射的情形來說，有利情況下，其上施加有傳感器基質的基底3對于施加的波長一般來說位于300nm和900nm之間的輻照來說是透明的。這通過使形成基底3的導電涂層例如金或鉬涂層足夠地薄來實現。在這里，優選情況下，這意味著涂層厚度小于IOOnm,優選在10和50nm之間。這種厚度的金或鉬層對于使用300至900nm波長范圍內的測量輻射進行光學測量來說，足夠透明。為了在測量區區域中獲得所需光學透明性，可選地，也可以將基底施加為結構化涂層，例如無涂層并因此具有透明的中間空間的襯結構或晶格結構的形式。在使用酶作為標記物和發色酶底物的情形中，另一種變化形式是在實際測量區后、例如在測量導管30的區域中出口 130前方帶有透明區，以便可以在透明區中測量流過導管的液體的吸收。除了過氧化物酶之外，磷酸酶和其他酶也在生物分析中廣泛用作標記物。可用于它們的還有大量不同的酶底物。
在結束測量后，為了執行下一個測量，進行受體層的再生。由于被分析物分子R400以及相應的靶分子R450的釋放，或者經由結合基團R300結合在結合分子R200上的受體R350的釋放不完全能夠以足夠可重復的方式進行，因此為了重新清潔基底3，釋放整個傳感器基質，包括其上結合的被分析物分子R400以及相應的靶分子R450，包括結合在其上的所有附加分子。實驗顯示，結合分子R200和經由結合基團R300結合的受體R350在分子水平上形成互連的共價或非共價鍵合的網絡，該網絡通過純化學清潔即使在升高的溫度下也只能艱難地或在長時間后被完全溶解，在所述情況下將清潔液體例如酸、氧化酸、堿溶液或有機溶劑引導通過測量導管30。
已發現，為了完全移除傳感器基質和結合在其上的分子，電化學清潔方法是有效的，在這種情況下在基底3與對電極4之間放置電勢差，同時將電解質液體引導通過測量導管30以及附加導管區段40兩者。由施加在基底3與對電極4之間的電勢差引起的通過電解質液體的電流流動，導致在給定情況下在分子水平上共價或非共價交聯的傳感器基質、包括結合在其上的附加分子溶解。
在這里描述的基于圖2的實施方式中，基底3、對電極4和參比電極2實施為3個電極電路的形式，其中利用恒壓電路來設定參比電極2與基底3之間的電勢差，并利用對電極4來控制所述電勢差。
為了清潔基底3，可以將恒定的電勢差施加例如預定長度的時間。已發現，當施加在基底與參比電極之間的電勢差通過例如電勢的線性掃描而在最大值與最小值之間連續變化，其中所述最大值和最小值優選具有不同符號，使得氧化電勢和還原電勢交替出現在基底3上時，對形成基底3的金屬涂層特別具有保護性。基底3相對于參比電極的的電勢從起始值向最大值、隨后向最小值、然后返回到起始值(或其他輪轉方式)的移動、特別是線性移動，被稱為“循環”。優選情況下，為了清潔基底3，完成許多循環，例如2至100個或甚至多達1000個循環。
為電化學清潔所選擇的實際條件，除了其他因素之外，還依賴于電解質和傳感器基質各自的組成、微流體系統的幾何形狀、以及基底3和相應的對電極4的布置和材料選擇。這些因素一般來說在初步實驗中被確定。在這樣的情況下，清潔方法將被優化，使得一方面確保完全移除傳感器基質，而在另一方面電極不受攻擊。在初期實驗中發現，一般來說，當基底相對于Ag/AgCl參比電極的電勢在-0.5V至-1.25V范圍內的負值與+1.5V至+2.25V范圍內的正值之間線性變化時，獲得特別好的清潔效力，其中在達到最大和最小值后，任選將電勢在每種情況下保持固定數秒的時間長度。通過這種方式，將傳感器基質交替暴露于氧化和還原性條件以及產生的氫和相應的氧，使得傳感器基質的不同組分氧化性以及相應地還原性地釋放、特別是分解。純氧化性的清潔同樣也是可能的；然而已發現，在這種情況下，基底可能受損。在所陳述的電勢范圍內特別有利的是，在最大值以及相應的最小值時，在水性電解質存在下，分別發生氧和氫的產生。在這種情況下，形成的氧和相應的氫支持性地有助于傳感器基質組分的溶解和分解。
存在大量不同的可以使用的電勢或電流函數，其實例是三角、鋸齒、正弦、矩形或不同脈沖和階梯函數。在這樣的情況下，特別優選的函數是其中在每個周期中、因此在每次電勢掃描的情形中，電流流動在某段時間、更優選在相對于周期長度的10至95%的時間內合計接近零的函數。
在使用鉬基底的實驗中已發現，對于氧化性清潔來說，基底的電勢相對于銀/氯化銀參比電極的電勢，至少有時優選被設定為高于+0.6V，優選高于+1.0V。對于還原性清潔來說，基底的電勢相對于銀/氯化銀參比電極的電勢，至少有時優選被設定為低于-0.2V，優選低于-0.4V。由于小的過電壓在這些條件下在鉬上產生氫，因此為還原性清潔產生了足夠的氫。優選情況下，作為電勢的循環或周期性移動的結果，發生氧化性和還原性清潔的交替。在特別簡單的變化形式中，為了調節電勢，使用可設定或可改變的電壓源，其輸出不參比于地電勢。
優選情況下，在電勢掃描期間以及相應的循環期間出現的最大電流密度，相對于微流體管道內的基底面積、特別是基底的測量區中的面積，為大于2mA/cm2、更優選大于20mA/cm2。在每種情況下，相對于微流體管道內的基底面積、特別是測量區的面積，優選地，在基底的再生以及相應的清潔期間流過的正電流電荷大于+0.2C/cm2、更優選大于+2C/cm2,流過的負電流電荷小于-0.2C/cm2、更優選小于-2C/cm2。此外，優選情況下，在電解再生以及相應的清潔中流過基底的正電荷和負電荷，具有基本上相等或差別小于25%的量值。
在電勢進行線性掃描的情況下在基底3上出現的電流，可以任選以循環伏安圖的形式被記錄和評估。如此測量的循環伏安圖尤其可以提供關于傳感器基質的殘留物是否仍結合在導電基底3上的信息。因此，可以根據記錄的循環伏安圖來確定清潔階段的成功結束。此外，其他電壓測量分析方法例如方波伏安法或差分脈沖伏安法，也適用于此。
現在將根據圖4a)和4b)詳細描述這種利用微流體系統100清潔基底3的電化學清潔方法的實例。在基底3與對電極4之間施加電勢差之前，首先經由連接到液體供應管線的連接件120將3M KCl水溶液引導到導管區段20中，然后經由接合部12進一步引導到測量導管30中，并經由測量導管30與附加導管區段40之間的接合部18引導到其中布置有對電極4的附加導管區段40中。液體通過所述導管區段的供應，通過在輸入連接件120與排出連接件130、140之間提供壓力差，而在輸入連接件110與排出連接件130、140之間沒有壓力差來進行。
一旦為了電化學清潔而將其中布置有參比電極2的導管區段20用KCl溶液填充后，立即將用于電化學清潔的清潔電解質例如IOOmMNa2SO4溶液經由供應連接件100引導通過測量導管30，并也經由接合部18引導到帶有對電極4的導管區段40中。此外，還發現，在給定條件下添加有0.25體積％過氧化氫的磷酸鹽含量為100mmol/l的酸性磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.1),也適合作為清潔電解質。總的來說，清潔溶液的組成應該被選擇成使得在基底與對電極之間的低電勢下能夠獲得盡可能高的電流流動。通過這種方式，能夠實現高的清潔效力并且對電極損害很小或沒有損害。
清潔電解質在該流動通路上的導流，通過在供應連接件110與兩個排出連接件130、140之間施加壓力差來實現。同時，確保在第二供應連接件120與排出連接件130、140之間不存在壓力差，以便防止Na2SO4溶液在帶有參比電極2的導管區段20中流動。因此，在接合部處形成了較早導入的KCl溶液與Na2SO4溶液之間的過渡，經由這種過渡可以發生載荷子交換。通過這種方式，為參比電極形成了無隔膜的電解質橋，所述參比電極的參比電解質KCl溶液經由接合部與用作清潔電解質的Na2SO4溶液導電接觸，而不需要多孔隔膜、間隙、燒結玻璃或將參比電解質與清潔電解質物理隔開的其他手段。
在測量導管30和帶有對電極4的導管區段40完全充滿清潔電解質后，在基底3與對電極4之間施加電勢差。這可以通過例如向基底3相對于參比電極2施加一定電勢來進行。在導管區段10與導管區段20之間的接合部12處，導管區段20中包含的KCl電解質與導管區段10、15中容納的清潔電解質之間的液體接合部形成了無隔膜的電解質橋，參比電極2經由所述無隔膜的電解質橋與基底3相連。使用恒壓電路，對基底3與對電極4之間的電流進行設置以獲得所需電勢。相應地，也在基底3與對電極4之間產生電勢差和電流流動。如上所述，相對于參比電極2施加到基底3的電勢在最大值與最小值之間例如線性地移動多次。這一過程被證明對形成基底3的金屬膜特別具有保護性。
在基底3或對電極4的電化學清潔中出現的、在給定情況下由例如一個電極上產生的氫或氧所造成的氣泡，以從接合部18經由排出管130、140離開微流體系統的管道系統的電解質液體流動方向(比照圖4b)的箭頭)排出。同樣地，從基底3釋放的分子、分子部分或分子聚集體也以該流動方向從測量導管30排出，以便防止重新吸附。
生物分析儀的微流體單元的大量可選實施方式是可能的。圖5示出了微流體單元的優選實施方式。用與前面的實例中所使用的同樣的指稱符號指稱同樣的部件。微流體單元包括第一部件la’(圖5a))、第二部件lb’(圖5c))和布置在第一部件la’與第二部件lb’之間的中間板lc’(圖5b))，它們都以平面圖被示出在圖5中。
圖5a)中示出的第一部件la’可以是透明材料例如玻璃或塑料。在平面圖中可以看見實施為膜的參比電極2和基底3。用作參比電極2的是例如銀/氯化銀參比電極，其由在給定情況下經由一個或多個中間層、特別是增粘劑而被施加在部件la’上的銀膜形成。通過例如用氯化鐵(III)溶液處理，將銀膜的表面氯化。基底3同樣在給定情況下經由一個或多個中間層被施加為第一部件la’上的膜。在這樣的情況下，例如，它可以是例如通過濺射施加的50至500nm厚的鉬層。鉬層用作親硫性基底，利用形成第一結合層的第一化學物質的鉬硫結合的形成來結合傳感器基質。基底3與參比電極2可以與例如測量電路和/或電壓源例如恒壓源或恒流源電連接(經由沒有更詳細示出的連接件)。
部件la’的區域5和5’未涂覆有導電材料。在給定情況下，可以用化學上穩定和電絕緣的材料例如氮化硅Si3N4涂覆區域5和5’，在給定情況下，這僅僅在與電極相鄰的區域中做出。優選情況下，這樣的涂層被施加成在電極表面上重疊例如10至100 μ m，因此在基底3的電化學清潔期間能夠有效地避免電極的侵蝕，并因此避免例如粘合助劑如二氧化鈦的攻擊。此外，用110、110’和120標出的是微流體單元的供應連接件，用130和140標出的是微流體單元的排出連接件。它們在圖示的實例中作為孔實施，其中在視圖中未示出的表面上，可以例如通過粘附來安裝例如常規連接件，用于連接微流體軟管線。
圖5c)在平面圖中示出了微流體單元的第二部件lb’。與第一部件la’相同，第二部件lb’可以由透明材料例如玻璃或塑料形成，其中電極2’、4和4’以及電絕緣區域6、6’以膜的形式，在給定情況下經由中間層、特別是促進粘合的中間層而被提供在第二部件lb’上。參比電極2’實施成與被施加在第一部件la’上的參比電極2相同。對電極包括第一對電極區4和第二對電極區4’。第一對電極區4由導電的化學惰性物質例如摻雜硼的金剛石或鉬形成，以完整膜的形式被施加。在組裝的微流體單元中位于彎曲形狀的測量導管30區域中的區域4’中，對電極以被中斷的方式實施。在圖示的實例中，其是與對電極區4側面相連的管線結構，例如由寬度為例如10 μ m并以例如20 μ m的相互間隔平行布置的管線構成。同樣地，其他尺寸和幾何形狀例如晶格結構，也適用于這里。在使用非光學透明電極材料的情形中，由此在測量導管的測量區7中、因此也在相應信號轉換器的幫助下被用于獲得測量信號的區域中，產生了部分光學透明性。因此，在酶標記物的幫助下使用間接方法運行的生物分析儀的微流體單元的優選實施方式中，例如，光學信號轉換器被布置在對電極4’的區域或部分的下方，所述信號轉換器的記錄區由圖5c)中用圓形區域標出的測量區7形成。信號轉換器可以具有例如光電二極管，其記錄由酶標記物催化產生的化學發光的光，并將其轉變成成比例的電流信號。對電極4、4’和參比電極2’具有沒有更詳細示出的用于電接觸的連接件。在微流體單元的組裝狀態下，形成在第一部件la’上的參比電極2和形成在第二部件lb’上的參比電極2’可以彼此導電連接，和/或通過來自于測量電路例如恒壓或恒流電路的共有連接件進行接觸。
圖5b中示出的有穿孔的中間板lc’包含例如125 μ m厚的聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性墊。為了形成微流體單元，第一部件la’的在圖5a)中面朝觀察者的底板表面和第二部件lb’的在圖5c)中面朝觀察者的底板表面被布置成彼此面對，彼此隔開并彼此相對放置，并且中間板lc’作為兩個部件la’與lb’之間的間隔元件被插入，并與部件la’和lb’對齊。如果中間板lc’由彈性材料形成，則第一部件la’和第二部件lb’可以通過將兩側壓向布置在其間的中間板lc’來液密性地連接在一起，并由此形成具有相對于環境密封的導管結構的微流體單元。在圖示的實例中，導管的寬度為500 μ m。在可選實施方式中，在光刻法中從光敏材料例如從光致抗蝕劑產生形成導管的有穿孔的中間板。在這種情況下，中間板lc’優選與第一和第二部件la’以及相應的lb’固定相連。
現在將在下面描述如此形成的導管結構。構建傳感器基質(步驟i)、執行測量(步驟ii)以及再生和相應地清潔基底(步驟iii)所需的試劑和相應的試劑溶液，可以經由連接件110和110’從供應容器或樣品進料供應以及給定情況下的混合系統(未示出)被進料。任選地，微流體單元還可以具有其他連接件(未示出)。在優選的變化形式中，將可以彼此相互作用的試劑或試劑溶液經由兩個不同的供應管線進料到微流體單元。通過這種方式，防止這樣的組分與供應系統中已經存在的另一種組分相互作用，例如一種后續的試劑可能與早先被傳送通過供應管線并仍保持吸附在供應系統的壁上的其他試劑相互作用。在本發明的生物分析儀的運行較長的情況下，供應系統中組分和試劑的這種相互作用一方面可以引起較大的合生，另一方面可以引起試劑在移動通過微流體單元、特別是通過測量導管30時初始濃度降低，這特別是在需要低的檢測限的情況下，對測量結果的可重復性具有負面影響，并相應地可能增加必須供應試劑的時間長度，并由此強烈地增加試劑消耗。
來自于連接件110’的導管區段10’與來自于連接件110的導管區段10在導管接合部12處相匯。在導管接合部11處，可以將液體經由導管區段40引導到與排出連接件140相連的廢液容器(未示出)中，這相當于繞過測量區。在這樣的情況下，微流體單元的外部電路相應地經由液體驅動裝置和閥進行導流。由導管區段40形成的旁路的優點在于，通過這種方式，可以首先引導試劑和相應的試劑溶液通過實際的測量單元，直至最初可能包含的氣泡從供應系統中被移除，并且在用第二種得到的試劑和相應的試劑溶液替換第一種試劑和相應的第一種試劑溶液時，直至向第二種試劑和相應的試劑溶液過渡的濃度梯度已通過導管系統或至少通過導管接合部12。通過試劑或試劑溶液的這種預備性導流，可以確保在將試劑或試劑溶液引導通過測量導管30并引導通過測量區的情況下，它們從一開始就以相同濃度和基本上不含氣泡的狀態通過，因此在使用自動生物分析儀重復執行上述方法步驟i至iii的情況下，對測量結果的可重復性具有正面影響。
在本實例中，測量導管30是彎曲的形狀，其中優選情況下，微流體單元的所有導管具有相同的橫截面。通過這種方式，從外部導入到微流體單元中的氣泡以及主要是在基底的電化學再生和相應的清潔情況下產生的氣泡，可以非常簡單地向回移出微流體單元，并且降低了它們在具有更大導管橫截面的區域中附著于導管壁的風險。測量導管30在接合部18處與附加導管區段20匯合，用于確保參比電極2和2’的參比電勢穩定的試劑例如3M的氯化鉀溶液可以經由供應連接件120被進料通過所述導管區段20。被引導通過測量導管30并通過導管區段20的液體流向導管接合部18，然后在受到外部電路和液體驅動系統和閥的控制時，通過導管區段30’和排出連接件130，進入連接在下游的廢液容器(未示出)。通過這種方式，有效防止了氯離子穿透到測量導管30的區域中。
與在較早描述的實例中相同，參比電極2和相應的2’經由無隔膜的電解質橋與基底3和對電極4以及4’電接觸。此外，在基底的電化學再生和相應的清潔期間產生的氣泡，當氣泡位于緊鄰導管接合部18之前的測量導管30的末端處時，僅僅瞬時地中斷參比電極2、2’與被連接作為工作電極的基底3和對電極4，4’之間的這種電接觸。然而，由于優選至少有時施加的通過測量導管30的體積流量和同樣優選至少有時施加的通過導管區段20的體積流量引起的氣泡被快速導流到導管區段30’中，因此參比電極與工作電極和相應的對電極之間的電接觸的這種中斷僅僅持續短時間，并且還可以例如使用電子輔助裝置進行檢測和補償。
圖5a)至c)的微流體單元示出了測量導管、測量區、基底與對電極之間的幾何關系。測量導管30是微流體系統中的一個區域，其中，在將用于構建傳感器基質所需的試劑引導通過的情形中，生物分析儀的傳感器基質以總是相同并可重復的方式被建造在其中布置的基底上。在圖5a)至c)的微流體單元中，導管區域30延伸至緊鄰導管接合部18之前的基底末端。此外，在導管接合部11與12之間的導管區域中以及在旁路的導管區域40中，試劑和相應的試劑溶液通過這些導管區域的初步流動，引起傳感器基質的構建。然而，這可能在其組成和密度上發生變化，或者在氣泡通過后可能甚至部分或完全沒有功能。在圖5中示出的實例中，除了測量導管之外，基底和對電極還另外覆蓋導管區10、10’和40以及導管接合部11和12。在這里，其他幾何形狀也是可能的。對于本發明的微流體單元的操作來說，必需的是基底應該至少部分存在于至少測量區中。然而，含有基底的測量導管還可以另外延伸到被信號轉換器記錄的區域7之外，所述基底在其上以可重復的方式構建有完整的傳感器基質。這種情況的一個實例是，用例如可以被布置在微流體單元的兩側并在緊鄰導管接合部18之前的導管區段30的末端處測定透射率的用于測量透射率的光學裝置，代替圖5a)至c)中示出的微流體單元的實例中用于記錄由酶標記物引起的化學發光信號的光電二極管。在使用發色底物代替化學發光酶底物的情形中，使用導管區段30的被基底覆蓋的整個區域作為測量區，而不再只使用光電二極管的記錄區域中的區域作為測量區，這是由于在被引導通過測量導管30并在連接在測量導管之后的信號轉換器的幫助下進行檢查的酶底物溶液的透射率發生變化的情況下，該整個區域被用于獲得測量信號。
被連接作為工作電極的基底3和對電極4、4’相對于微流體管道進行布置，使得導管區段10、10’、30和40以及導管接合部11和12被它們液密性覆蓋。通過這種方式，確保了在這些區域中通過電化學再生和相應的清潔進行基底表面的完全清潔。通過所有導管區域中各處的基底與對電極之間的近似相等的隔開，基底表面的清潔同樣在所有導管區域中各處基本上相等，并且流過基底表面的電流密度的分布沒有顯著差異。這是有利的，因為由此在給定情況下由于再生或清潔條件造成的基底的表面釋放，同等地影響所有區域、特別是測量導管中的區域，并因此能夠進行頻繁的再生并由此利用生物分析儀頻繁地現場執行測量，并伴有恒定的高質量測量結果。正如上面已經描述的，對電極4和4’也可以用作用于構建傳感器基質的另一個基底。在這樣的情況下，對電極優選由與基底3相同的材料構成，因此在圖示的實例中由鉬構成。然后在執行步驟i至iii期間，在該另一個基底上優選進行與在微流體管道中相對放置的基底3的區域上基本上相同的過程。
圖6示出了微流體單元1000形式的另一種實施方式。在這樣的情況下，使用導電的微流體小管和相應的絲作為基底3和對電極4。因此，基底3由例如小的金管構成，對電極4由與基底3共軸布置的金絲構成。這種類型的實施方式的優點在于利用相應的支架1001、1001’可實現這些小管的簡單的電和微流體可連接性。在這樣的情況下，小管3用作基底，絲4用作對電極并同樣作為另一個基底。顛倒的功能性也代表了另一種選擇方案。基底3與對電極4的共軸布置允許高電流密度通過基底與對電極之間的小的間隔，這使得使用壽命延長，并且在電再生和相應的清潔的情況下，基底和/或對電極的表面僅僅輕度移除。通過利用微流體軟管和小管進行相應的連接，也可以實施更復雜的微流體單元，其不被或僅僅被部分構建為微流體芯片。
在基底3的電勢在最大值與最小值之間移動的一些循環后，基底3被基本上完全清潔。然后，可以以上述方式形成傳感器基質的更新的制備物，以便隨后用于重新測量。通過這種方式，在每種情況下可以使用新制備的傳感器基質執行至少50個或甚至100至200個測量。
由于傳感器基質被定期完全重新制備，因此也可以執行各種被分析物的順序測量，其中在每種情況下，接著制備特別適用于相應的待測定被分析物的具有某種受體的傳感器基質。例如，在順序制備中，在每種情況下對于當前待檢測的被分析物或對于相應地用于被分析物檢測的靶分子來說，不同的、優選選擇性且特異性結合的受體可以被結合在結合分子R200上。
在微流體系統的可選和優選構造中，對電極和基底可以被布置在同一個導管中，并放置成彼此相對。在這樣的情況下，參比電極被布置在經由接合部與測量導管區段相連的導管中，使得它如圖4b中所示，在電化學清潔期間經由無隔膜的電解質橋與基底導電連接。在上述用于制備傳感器基質的方法的情形中，當基底和對電極被布置在測量導管中彼此相對放置時，傳感器基質被構建在基底以及對電極兩者上，使得可以使用兩個傳感器基質來產生測量信號。在這樣的情況下，基底可以例如對測量輻射透明，使得例如在對電極和基底上產生的發光輻射透射通過基底，并可以作為測量信號被布置在基底后方的光電二極管記錄到。
對用于在工業過程中監測(定量)被分析物濃度的生物分析儀的重要要求是，在使用連續插入的再生的傳感器基質進行順序測量的情況下，由生物分析儀輸出的測量信號的可重復性。尤其是，必須確保生物分析儀在順序測量的情況下，在被分析物濃度保持相等的情況下，事實上輸出相同信號強度的測量信號，其中在所述順序測量之間，在每種情況下執行傳感器基質的新制備。
為了使用這里描述的方法確保這一點，傳感器基質的制備被執行成使得導電表面區段3上的結合分子R200的層的覆蓋度為如上所限定的至少80%。
最優情況下，在受體在一個或多個制備步驟中被結合在結合層上的情形中，在第二制備步驟以及在給定情況下附加制備步驟的情況下，第二制備溶液以及在給定情況下其他制備溶液被引導通過測量導管的時間長度也被選擇成使得在每種情況下獲得如上所限定的80%的覆蓋度。
如圖la)和b)中所示，傳感器基質的層結構以及在給定情況下帶有標記物的分子在被分析物上或與被分析物競爭傳感器基質的結合位置的靶分子上的直接或間接結合，允許以簡單的方式將從實驗室應用已知的用于單次使用測定的方法技術轉變成可以利用生物分析儀重復自動執行的方法。在這里，作為其實例描述了將用于單次使用的實驗室實施的免疫測定法轉移到用于過程測量技術的自動工作的生物分析儀:在實驗室測定中，通過將針對牛冠狀病毒(BCV)的抗體吸附在微量滴定板的疏水基底表面上，來產生受體層。然后，施加需要檢查BCV組分的測量樣品并隨后漂洗，以便移除未結合在受體上的BCV。隨后，施加針對BCV的另一個表位的第二抗體，重新漂洗，然后施加辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的第三抗體的偶聯物。該第三抗體結合在第二抗體上，使得第二抗體被HRP間接標記。在重復漂洗后，隨后通過添加發色底物2，2’-連氮基雙-(3-乙基-苯并噻唑啉)6-磺酸(ABTS)和過氧化氫并對該溶液的吸收進行光度測定的最終步驟，進行測量值的測定。
現在將描述用于將利用所描述的單次使用的親和生物測定法進行的液體樣品的BCV含量測定，向利用生物分析儀進行的液體樣品的BCV含量的自動且可重復執行的現場測定進行轉變的方法。在第一步驟(步驟a)中，選擇用于構建傳感器基質的結合層的適合的結合結構。由于用作受體R350的針對BCV的抗體(抗BCV抗體)涉及非生物素化的IgG類抗體，因此基于圖1b)的層序列硫醇-PEG-生物素-中性親和素-生物素-抗IgG抗體-抗BCV抗體是非常適合的，其中抗BCV抗體用作受體R350。作為可選測定方法(步驟b)，在使用HRP分子作為帶有標記物的分子R500的情形中，除了發色ABTS反應以及隨后的光度測定之外，還可以使用魯米諾與過氧化氫之間的化學發光反應。這在自動生物分析儀中具有只需要一個光電檢測器例如光電二極管作為信號轉換器的優點。
在附加步驟中，為自動生物分析儀中所使用的用于液體管線的材料或用于與液體樣品或其他使用的試劑發生接觸的其他部分的材料選擇適合的阻斷試劑，以便減少組分的非特異性吸附。
在通過這種方式限定了結合層并選擇了可選測定方法之后，產生了選自幾種通用的標準變化形式并由下列物質形成的傳感器基質的結合層序列:
-親硫的基底(基底3)
-硫醇-PEG-生物素(第一結合分子R200，其具有生物素作為官能團，用于經由第二結合分子R310間接結合受體R350)
-中性親和素(結合在結合分子R200上的分子R300，并且第二結合分子R310結合在其上)
-生物素-抗IgG抗體(第二結合分子R310)。
為了檢測液體樣品中的BCV含量，在該結合層序列上隨后跟有從實驗室方法可知的親和測定法的層序列:
-針對BCV的IgG類型的抗體(結合在第二結合分子上的受體R350)
-BCV (被分析物R400，其中占據密度依賴于液體樣品中被分析物的濃度)
-針對BCV的第二抗體(用于間接結合帶有標記物的分子R500)
-針對第二抗體的HRP標記的第三抗體(R500)，用于利用魯米諾/H2O2進行化學發光檢測。
在下面的步驟中，所有使用的組分必須檢查交叉反應性(步驟C)，以便由此排除測量信號的錯誤。為此，例如，可以在每種情況下省略一個層來連續構造受體層，并且在出現交叉反應性的情況下，測定到的測量信號為明顯高于零的值。此外，各個層、優選為主要結合層的密度，將通過共同結合相對于后面的層未官能化或無反應性的其他組分來設定。
如果自動生物分析儀具有用于液體運輸的微流體管道系統、包括在其中形成傳感器基質并執行被分析物檢測的測量導管，則還應該確定含有用于形成傳感器基質的化學物質的制備溶液的適合的體積流量、濃度以及各種制備溶液和在給定情況下漂洗溶液被引導通過測量導管的時間長度(步驟d)。在這樣的情況下，優選選擇高的濃度、同樣高的制備溶液體積流量和長的時間長度。通過這種方式，確保傳感器基質的各種組分在對應于該濃度下的化學平衡的給定條件下形成的層在每種情況下幾乎完全覆蓋位于其下方的層。在這樣的情況下，待檢測的每種組分相對于其在制備溶液中的濃度、體積流速和制備溶液被引導通過測量導管的時間長度是可變的。在每種情況下，向在所選的條件下實施的傳感器基質供應被分析物濃度已知的測量溶液，并利用根據生物分析儀的信號轉換器所選擇的檢測方法來記錄測量信號。從如此獲得的測量信號產生矩陣，從所述矩陣可以在每種情況下為傳感器基質的每個層確定最適的方法參數、濃度、體積流速和引導通過測量導管的時間長度。因此，例如，可以選擇下述組合，即所述組合能夠使制備溶液引導通過測量導管的時間盡可能短，并且盡管如此，能夠產生在制備溶液引導通過的持續時間明顯長得多的情況下的測量信號的95%的測量信號。通過這種系統性程序，可以快速實現所述方法參數與通過系統的微流體流動的匹配。
在附加步驟中，以類似方式確定用于執行基底的再生和相應的清潔的方法參數(步驟e)。為此，首先確定通過化學手段進行清潔、例如通過將清潔溶液引導通過測量導管是否足以基本上完全清潔基底，或者是否應該執行電化學清潔，在執行電化學清潔的情況下，除了將清潔溶液引導通過測量導管之外，還使基底相對于對電極以及相應的參比電極的電勢發生變化，使得在給定情況下，在通過清潔溶液的電解形成的氫和相應的氧的支持下，發生傳感器基質和在給定情況下結合在其上的分子的至少部分分解。使用一系列試驗，可以改變方法參數、清潔溶液的濃度/組成、基底的電勢、相應的在基底與對電極之間流動的電流的電流水平、引導清潔溶液通過測量導管的時間長度、在給定情況下引導輔助液體通過測量導管的時間長度、基底電勢的曲線、相應的在基底與對電極之間流動的電流的曲線，并且根據表示基底清潔程度的測量信號可以確定再生的成功。從將清潔成功作為不同過程參數的函數作圖而得到的相應的矩陣，可以確定最佳的方法參數。
在需要時使用來自于相應應用領域的樣品執行測量，以便在給定情況下鑒定(步驟f)從特定測量介質得到的矩陣效果。如果發生這種情況，可以確定用于特定情況的適合的對策，例如將樣品稀釋或在隨后的方法校準中將測量值的偏差考慮在內。在轉變為利用生物分析儀的自動現場測定的親和測定法已被校準后，進行相應的驗證(步驟g)。這包括檢查制備溶液和其他使用的試劑的儲存穩定性。
上述方法的優點在于，在例如生物技術生產廠中用于質量控制、在通常的實驗室實踐中使用的例如作為單次使用的實驗室方法執行的親和測定法，可以被有效地轉移到自動生物分析儀。因此，例如，能夠完全自動、重復并在線地分析物質例如蛋白質或如上述實例中所述的疫苗的含量。使用一個或幾個標準層系統來結合幾乎任何受體和/或使用一種或幾種帶有標記物的分子，提供了一種平臺或構建試劑盒、溶液，可以通過所描述的方式使用相對少的努力將已知的實驗室方法轉移到所述平臺或構建試劑盒、溶液。
權利要求
1.利用生物分析儀自動現場測定液體樣品的被分析物含量的方法，所述生物分析儀包含具有至少一個測量導管的微流體系統以及引導一種或多種液體通過所述測量導管的裝置，其中所述測量導管具有至少一個基底， 所述方法包括用于至少在測量區內做測量的如下所述的重復可執行的步驟序列: (i)制備具有多個受體的傳感器基質，所述受體一優選選擇性且特異性地、特別是因親和相互作用一結合所述被分析物和/或其他靶分子，或引起所述被分析物或所述其他靶分子的化學轉化， 所述制備包括引導至少第一化學物質的制備溶液通過所述測量導管的步驟，所述第一化學物質包括至少一個結合在所述基底上的官能團以及至少一個其他官能團，其中多個所述第一化學物質經由結合在所述基底上的官能團而結合在所述基底上， 其中結合在所述基底上的多個所述第一化學物質的其他官能團用作受體或用于隨后結合受體； (ii)引導所述液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測量液體通過所述測量導管，其中包含在所述液體樣品或所述待測量液體中的被分析物和/或包含在所述液體樣品或所述待測量液體中的其他靶分子一優選選擇性且特異性地一結合在所述受體上或被所述受體化學轉化， 并測定與所述受體所結合或轉化的靶分子的量相關或與所述受體所結合或轉化的被分析物的量相關的測量變量，并從所述測量變量推導出所述液體樣品的被分析物含量；以及 (iii)再生一特別是清潔一所述至少一個基底，其中所述傳感器基質以及在給定情況下與所述傳感器基質結合的分子一特別是被分析物分子、其他靶分子或其他分子，從所述基底釋放和/或 至少被部分分解。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述至少一個基底是導電基底。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述基底的再生一特別是清潔，通過在所述基底和經由電解質與所述基底導電接觸的對電極之間產生電流流動來進行，使得清潔所述基底——特別是基本上不依賴于所述基底的當前占據情況。
4.如權利要求2或3所述的方法，其中在所述基底和所述對電極之間產生電流流動期間，通過電解在所述基底和/或所述對電極上形成氫和/或氧。
5.如權利要求2至4之一所述的方法，其中所述對電極實施在所述測量導管中一特別是與所述基底相對或與所述基底共軸放置——作為另一基底，在該另一基底上結合有結合在所述基底上的所述第一化學物質的官能團。
6.如權利要求1至5之一所述的方法，其中所述至少一個基底包含親硫的導電基底，并且結合在所述基底上的所述第一化學物質的官能團包含硫醇或二硫化物基團，其中，通過所述硫醇或二硫化物基團的硫原子結合，在所述基底上形成所述第一化學物質的層。
7.如權利要求3至6之一所述的方法，其中在所述電流流動期間，所述基底與所述對電極之間的導電接觸由電解質建立，所述電解質含有濃度低于150mmol/l——優選低于15mmol/l、更優選低于1.5mmol/l-的氰離子或鹵素離子。
8.如權利要求3至7之一所述的方法，其中在所述基底與所述對電極之間產生電流流動期間，參照經由電解質——特別是利用電解質橋——與所述基底導電接觸的參比電極的參比電勢，設定一特別是控制一所述基底的電勢。
9.如權利要求3至8之一所述的方法， 其中，所述基底的電勢-優選相對于所述參比電勢-在最小值與最大值之間連續或不連續地變化——特別是線性地變化，使得通過電化學清潔來重新清潔所述基底，和/或 其中，在所述基底與所述對電極之間產生的電流流動的電流水平在最小值與最大值之間連續或不連續地變化，使得通過電化學清潔來重新清潔所述基底。
10.如權利要求3至9之一所述的方法，其中，為了支持清潔效力，在所述基底與所述對電極之間產生電流流動之前、期間或之后，把一種或多種清潔液體和/或一種或多種輔助液體引導通過所述測量導管。
11.如權利要求10所述的方法，其中，在所述基底與所述對電極之間產生電流流動期間，把酸性磷酸鹽緩沖溶液作為輔助液體引導通過所述測量導管，在給定情況下，酸性磷酸鹽緩沖溶液另外含有過氧化物。
12.如權利要求1至11之一所述的方法， 其中在現場重復并直接一個接一個地執行步驟(i)_ (iii)的序列，特別是執行至少50次，優選為至少150次。
13.如權利要求1至12之一所述的方法，其中，在所述再生期間或之后，檢查所述至少一個基底上所述傳感器基質的殘留組分——特別是利用電化學測量方法例如循環伏安法或阻抗譜法、光學測量方法例如橢圓偏光法、或吸附試驗或者通過在所述再生期間測量電流水平進行檢查。
14.用于執行如權利要求1至13之一所述的方法的生物分析儀，其包含具有至少一個測量導管的微流體系統和用于將液體引導通過所述測量導管的裝置， 其中，所述測量導管包含至少一個基底，在所述至少一個基底上，至少在測量區內、至少有時布置有具有多個受體的傳感器基質，所述受體——優選選擇性且特異性地——結合或化學轉化液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測量液體中存在的靶分子或被分析物， 其中，所述生物分析儀包含至少一個信號轉換器，該信號轉換器根據結合在所述受體上或被所述受體轉化的被分析物的量或者根據結合在所述受體上的靶分子的量或被轉化的革巴分子的量而輸出測量信號。
15.如權利要求14所 述的生物分析儀，其中所述基底是導電的，對電極被布置在所述微流體系統內并至少在所述再生——特別是清潔、靜置期間與所述基底導電接觸，并且其中所述生物分析儀還包括在所述基底與所述對電極之間產生電流流動的裝置。
16.如權利要求14或15所述的生物分析儀，其中所述對電極被布置在所述測量導管內，與所述第一基底相對放置或與所述基底共軸延伸，并優選用作另一個基底。
17.如權利要求15或16所述的生物分析儀，其中所述基底和所述對電極與流過所述測量導管的電解質的流動方向相關地布置，使得由于所述基底與所述對電極之間的電流流動而出現在所述電解質中的氣泡被導流而使所述氣泡基本上不影響所述電流流動。
18.如權利要求15至17之一所述的生物分析儀，其中所述生物分析儀還包括參比電極一一特別形成在所述微流體系統內，所述參比電極至少在所述基底的再生期間一特別是清潔期間，經由電解質橋——特別是無隔膜的電解質橋——與所述至少一個基底導電連接。
19.如權利要求14至18之一所述的生物分析儀，其中所述微流體系統包括: 第一部件，其具有表面，其中所述測量導管以及在給定情況下其他導管——特別是經由接合部與所述測量導管相連的用于液體運輸的導管——被實施成凹陷部， 其中至少第二部件與所述第一部件相連，以覆蓋所述凹陷部并將所述凹陷部液密地密封。
20.如權利要求19所述的生物分析儀，其中所述基底、所述對電極以及在給定情況下所述參比電極被形成為 所述第二部件上的可導電連接的膜，特別是金屬涂層。
21.如權利要求14至20之一所述的生物分析儀，其中所述微流體系統包含: 第一部件一特別是平面平行的第一板，以及與所述第一部件隔開布置的第二部件一特別是平面平行的第二板，其中所述第一部件和第二部件經由布置在所述第一部件與第二部件之間的一個或多個間隔元件——特別是一個或多個中間板——而彼此相連，其中所述一個或多個間隔元件具有中間空間和/或穿孔，所述中間空間和/或穿孔形成了在所述第一部件與第二部件之間延伸的導管結構，包括所述測量導管以及在給定情況下與所述測量導管相連的用于液體輸送的附加導管。
22.如權利要求21所述的生物分析儀，其中所述基底、所述對電極以及在給定情況下所述參比電極是所述第一部件上或所述第二部件上的可導電連接的膜的形式——特別是金屬涂層。
23.如權利要求14至22之一所述的生物分析儀，其中所述基底透射至少10%的在300nm和900nm之間的波長范圍內的光。
全文摘要
本發明涉及一種利用生物分析儀自動現場測定液體樣品的被分析物含量的方法，所述生物分析儀包含具有至少一個測量導管的微流體系統以及引導一種或多種液體通過所述測量導管的裝置，其中所述測量導管具有至少一個基底，所述方法包括用于至少在測量區內執行測量的如下所述的可重復執行的步驟序列(i)制備具有多個受體的傳感器基質，所述受體優選選擇性且特異性地、特別是因親和相互作用而結合所述被分析物和/或其他靶分子，或引起所述被分析物或所述其他靶分子的化學轉化，所述制備包括引導至少第一化學物質的制備溶液通過所述測量導管的步驟，所述第一化學物質包括至少一個結合在所述基底上的官能團以及至少一個其他官能團，其中多個所述第一化學物質經由結合在所述基底上的官能團結合在所述基底上，其中結合在所述基底上的多個所述第一化學物質的其他官能團用作受體或用于隨后結合受體；(ii)引導所述液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測量液體通過所述測量導管，其中包含在所述液體樣品或所述待測量液體中的被分析物和/或包含在所述液體樣品或所述待測量液體中的其他靶分子，優選選擇性且特異性地結合在所述受體上，或被所述受體化學轉化，并測定與被所述受體結合或轉化的靶分子的量或與被所述受體結合或轉化的被分析物的量相關的測量變量，并從所述測量變量推導出所述液體樣品的被分析物含量；以及(iii)再生、特別是清潔所述至少一個基底，其中所述傳感器基質以及在給定情況下與所述傳感器基質結合的分子特別是被分析物分子、其他靶分子或其他分子，從所述基底釋放和/或至少被部分分解。
文檔編號G01N33/543GK103189746SQ201180052501
公開日2013年7月3日 申請日期2011年8月26日 優先權日2010年10月29日
發明者邁克爾·漢克, 安哥拉·奧比施, 阿克塞爾·菲庫斯 申請人:恩德萊斯和豪瑟爾測量及調節技術分析儀表兩合公司