專利名稱：一種用于多組分中藥的藥物代謝動力學的分析方法
技術領域：
本發明屬于藥物組分分析的技術領域，特別涉及用于評價中藥多組分藥物代謝動力學的分析方法。更具體地說，是測定生物樣品中中藥各組分含量的液相色譜-質譜LC/ MS/MS分析方法。
背景技術：
藥物代謝動力學是定量研究藥物在生物體內吸收、分布、代謝和排泄規律依據測得的生物樣品中藥物濃度，運用數學原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規律的一門學科。中藥復方具有多味、多成分、多劑型的特點，存在復雜環境下及病癥模型條件下的多因素相互作用。因中藥化學成分眾多，很難購買到所有標準品。中藥藥動學評價目前是按化學藥物研究方法，測定多種組分中的一種或幾種，這顯然無法揭示多組分中藥藥物代謝動力學規律。由于中藥成分復雜，即使一味中藥也含有十幾類數百種化學成分，因此以往僅以有限幾種成分的藥物動力學研究結果來代表某味中藥或某一復方藥物的藥代動力特征是不準確的。因此需要建立全新的可整體評價中藥藥動學的分析方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，建立一種新的中藥藥代動力學評價方法，以代替傳統的依賴于有限標準品的評價方法，使其達到在沒有標準品的情況下，也可對生物樣品中多組分中藥進行定量，進而全面評價中藥的藥代動力學行為。液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)的快速掃描和多重反應監測(MRM)檢測模式，可很好地滿足生物樣品中多組分中藥對分析速度和專屬性的要求。同時本發明以中藥原料藥作為標準品，利用LC-MS/MS建立各組分的定量測定方法，標定生物樣品中原料藥對應的各組分相對濃度，依據該濃度結果建立藥-時曲線，進而計算各組分的藥代動力學參數。該方法可定量地描述中藥多組分進入機體后的吸收、分布、代謝和排泄等過程的動態變化規律， 研究給藥后體內中藥的分布、濃度、療效與時間之間的關系，整體揭示中藥在體內的經時變化，對中藥的臨床安全合理用藥具有重要指導意義。以升麻口服片劑為模型藥物，將本發明提出的定量方法與傳統的定量方法進行了方法學驗證的比較研究。結果表明兩者的線性范圍是一致的，本法的精密度和準確度也符合國家食品藥品監督管理局(SFDA)的要求，采用該法成功地對升麻口服片進行了多組分體內藥代動力學評價。本發明的技術方案是一種用于多組分中藥的藥物代謝動力學的分析方法，有下述的步驟，(1)稱取原料藥，配制原料藥溶液；再以同樣的溶劑分別稀釋成不同濃度，作為系列標準溶液，以原料藥溶液的總濃度作為標示量，計量各標準溶液中各組分的相對濃度；(2)建立液相色譜-質譜分析條件利用質譜Ql全掃描方式選擇原料藥中物質的離子對，即待測物質；建立待測物質色譜-質譜分析條件、生物樣品前處理方法、以內標法建立待測物質定量方法，即為原料藥體內藥物代謝動力學分析方法；(3)體內試驗健康受試動物給予相同批次原料藥后，按照設計時間點采集生物樣品；(4)生物樣品測定采用步驟O)中建立的液相色譜-質譜分析條件對生物樣品中離子對代表的物質進行定量分析；(5)數據處理利用步驟中獲得的生物樣品中離子對代表的物質定量分析數據，即為離子對代表的物質對于標示量的相對濃度，利用相對濃度建立藥-時曲線，進而得到各組分的藥物代謝動力學參數。本發明的用于多組分中藥的藥物代謝動力學的分析方法，可以先將中藥原料藥溶解，配制成不同濃度的標準系列溶液，按SFDA生物樣品分析指導原則進行方法學驗證；所述的方法學確證，內容包括標準曲線、定量下限、精密度與準確度、樣品穩定性、提取回收率、基質效應、儲備液穩定性。更細致的實驗步驟如下(1)稱取原料藥時，應保證與動物實驗用藥品所用原料藥一致。稱取原料藥適量， 以適當溶劑溶解后作為儲備液，用相同溶劑分別稀釋適當倍數，作為系列標準溶液，含量以原料藥總濃度作為“標示量”標定，即標準溶液中各組分的濃度均以該“標示量”計。(2)建立LC-MS/MS分析條件進行質譜參數優化，選擇靈敏度高、專屬性強的離子對進行定量，輸入質譜工作站；優化色譜分析條件。(3)選擇合適的內標以及合適的樣品前處理方法進行樣品處理。(4)方法學確證包括標準曲線、定量下限、精密度與準確度、樣品穩定性、提取回收率、基質效應、儲備液穩定性。(5)體內試驗健康受試動物，給予相同批次中藥原料藥后按照設計時間點采集生物樣品。(7)生物樣品測定用已建立的原料藥“標準品”標定生物樣品中的不同組分的濃度。(8)數據處理有效整合各項試驗數據，選擇科學合理的數據處理及統計方法，獲得各組分的體內藥代動力學參數。本發明的有益效果(1)以多組分中藥原料藥為標準品，使其達到在沒有標準品的情況下，也可對生物樣品中中藥多組分定量，進而進行整體中藥藥代動力學研究。0)LC-MS/MS法方法快速、靈敏度高、特異性好，可高通量地分析生物樣品中多組分中藥，能滿足中藥臨床前或臨床藥代動力學研究的需要。避免逐個分離標準品，大大縮短試驗周期，降低試驗成本，試驗結果準確可靠。(3)可實現中藥有效組分的快速篩選，建立Hi-PD關系，為臨床安全合理用藥提供試驗依據。


圖1是實施例1測定大鼠血漿中待測物和內標Rg3的典型MRM色譜圖。
圖2是實施例16只大鼠灌服升麻原料藥后十四種成分平均血藥濃度-時間曲線。
具體實施例方式實施例1升麻總皂苷藥代動力學研究1、藥物溶液的配制升麻原料藥為“標準品”，配制標準系列溶液準確稱取升麻原料藥10. Omg,甲醇定容至10mL，作為儲備液，用甲醇-水(80 20，v/v)溶液逐步稀釋至0.5，2.0，10，50，200， 800 μ g/mL，作為標準系列溶液。2、建立升麻總皂苷LC-MS/MS多組分測定方法以升麻原料藥作為物質組的標準品，用甲醇-水(80 20，ν/ν)將其稀釋到適當倍數(1)用注射泵(FIA)進樣，質譜的Ql采用全掃描的方式，獲得響應較高的升麻物質組的m/z數據；(2)將這些數據分別作為LC-MS/MS的SIM監測的離子，輸入質譜工作站；(3)色譜采用梯度洗脫的方式，質譜選擇[M-H]-信號穩定的準分子離子；(4)采用MS2掃描方式，尋找母離子相對應的子離子，并對質譜參數進行優化，選擇靈敏度高、專屬性強的離子對進行定量，輸入質譜工作站；十四種組分質譜條件見表1。表1測定大鼠血漿中十四種成分的質譜條件
Peak# TR(min)MS/MSDPCECXP
-32-5
-19-5
-32.2-5
-35.4-5
-22.85-5
-30-11
-24.77-5
-35-5
-30.8-11
-35-5
-37-5
-31.5-5
-35-5
-49.8-5
-31.8-5 (5)優化色譜分析條件，選擇內標，按現有國際通用的分析方法確證的要求，建立升麻物質組的體內藥物代謝動力學分析方法。
5
11.46305.3/231.3-11024.43501.3/131-14634.45653.4/501.4-5044.84369.2/335.4-16854.85635.4/501.4-56.764.99609.8/131-8074.78589.2/130.9-10684.97677.4/131-10595.15679.4/131-79.65105.13607.4/369.5-80115.48695.7/525.5-38.2126.29639.4/131-68.9136.54663.4/.66783.8/161.1-158IS6.81681.4/131-89.5
3、藥代動力學實驗取健康雌性wistar大鼠6只，灌服升麻總皂苷(10mg/kg)。于給藥前Oh及給藥 j^5，15，30min，l，l. 5，2，3，4，6，8，10，12，18，24，36 和 48h 經眼眶取血 0. 4mL，置于肝素試管中，離心(3000g) IOmin,分離血漿并保存于_35°C冰箱中待測。4、血漿樣品測定4. 1血漿樣品的處理方法取血漿樣品IOOyL置IOmL試管中，加入內標溶液100yL(l μ g/mL Rg3)，補加 IOOyL甲醇-水(80 20,ν/ν)混合溶液，渦流混合aiiin，加入萃取液正己烷二氯甲烷 異丙醇O 1.5 0. 1)，渦流混合lOmin，離心10min(3000g)，取上清于另一試管中，40°C 氮氣流下吹干，殘留物加入100 μ L流動相溶解，渦流混合，取20 μ L進行LC-MS/MS分析。4. 2建立血漿標準曲線取空白血漿樣品IOOyL置IOmL試管中，加入內標溶液IOOyL(1 μ g/mL Rg3)，加 “升麻總皂苷系列溶液” 100 μ L，配制成相當于“升麻原料藥”血漿濃度為0. 5，2. 0，10，50， 200，800μ g/mL標示濃度的樣品，按“血漿樣品處理”項下依法操作，建立標準曲線。以升麻原料藥總濃度(X)為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程。升麻原料藥標準品在0. 5 800 μ g/mL范圍內線性良好，升麻原料藥中十四種成分的典型回歸方程見表2。表2十四種組分典型標準曲線、精密度和準確度
權利要求
1.一種用于多組分中藥的藥物代謝動力學的分析方法，有下述的步驟，(1)稱取原料藥，配制原料藥溶液；再以同樣的溶劑分別稀釋成不同濃度，作為系列標準溶液，以原料藥溶液的總濃度作為標示量，計量各標準溶液中各組分的相對濃度；(2)建立液相色譜-質譜分析條件利用質譜Ql全掃描方式選擇原料藥中物質的離子對，即待測物質；建立待測物質色譜-質譜分析條件、生物樣品前處理方法、以內標法建立待測物質定量方法，即為原料藥體內藥物代謝動力學分析方法；(3)體內試驗健康受試動物給予相同批次原料藥后，按照設計時間點采集生物樣品；(4)生物樣品測定采用步驟O)中建立的液相色譜-質譜分析條件對生物樣品中離子對代表的物質進行定量分析；(5)數據處理利用步驟(4)中獲得的生物樣品中離子對代表的物質定量分析數據，即為離子對代表的物質對于標示量的相對濃度，利用相對濃度建立藥-時曲線，進而得到各組分的藥物代謝動力學參數。
2.根據權利要求1所述的用于多組分中藥的藥物代謝動力學的分析方法，其特征在于，先將中藥原料藥溶解，配制成不同濃度的標準系列溶液，按國家食品藥品監督管理局生物樣品分析指導原則進行方法學驗證；所述的方法學確證，內容包括標準曲線、定量下限、 精密度與準確度、樣品穩定性、提取回收率、基質效應、儲備液穩定性。
全文摘要
本發明的一種用于多組分中藥的藥物代謝動力學的分析方法屬于藥物組分分析的技術領域。采用液相色譜-串聯質譜法的多重反應監測掃描方式，以原料藥為“標準品”，建立原料藥中各組分的定量反應離子，相對定量生物樣品中各中藥組分的濃度。具體步驟有配制原料藥溶液、建立液相色譜-質譜分析條件、體內試驗、生物樣品測定和數據處理。本發明初步解決了在沒有標準品的情況下，實現對生物樣品中多組分中藥進行定量分析。采用該方法，對中藥制劑中的已知和未知組分進行了藥代動力學分析。結果表明，本方法的精密度和準確度符合SFDA相關規范的要求。
文檔編號G01N30/72GK102175783SQ20101061366
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者劉萬卉, 張繼穩, 張超, 李海燕, 楊艷, 蓋蕓蕓, 顧景凱 申請人:吉林大學