專利名稱：富集肺癌細胞復合納米微球的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于高分子化學和細胞生物醫學領域，特別涉及一種結合肺癌細胞的復合 Fe3O4磁性納米顆粒及其制備方法，以及一種富集和檢測痰液中肺癌細胞的方法。
背景技術：
肺癌居十大惡性腫瘤之首，具有“三高”現象發病率高、死亡率高、上升幅度高； 是影響人類健康的主要疾病，與愛滋病并列成為21世紀主要醫學問題之一。憑借目前診斷肺癌的手段，一旦發現和確診是肺癌，基本上處于中晚期，尚難以獲得有效的控制。因此，實現肺癌的早期診斷是實現早期治療的長期未能破解的國際醫學難題。痰液細胞病理學檢查是目前極有希望開發推廣為早期診斷肺癌的最有效的方法。 目前存在的最主要問題是1、痰液送檢費時費力；2、假陰性率高QO 40% )，原因在于 痰液制片手工操作而導致細胞丟失(標本不能全部取用)、涂片的質量太差(不均勻、過厚， 過多的黏液、血液或炎細胞遮蓋了不正常的細胞、細胞形態保存不佳)，細胞成分復雜(大量脫落上皮細胞、炎癥細胞)，脫落肺癌細胞散在，分布不均。所以，必須去除無關細胞，才能做到低成本地連續檢測，大幅度提高陽性率。因此， 肺癌細胞分離富集是實現肺癌早期診斷這個國際性難題首先要解決的問題。如果能夠尋找到一種比較簡便實用的方法將肺癌細胞從痰液中分離出來富集，早期治療肺癌就有希望。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對痰液中細胞成分復雜，檢測痰液中肺癌脫落細胞假陰性率高的缺陷，提供一種結合肺癌細胞的復合狗304磁性納米顆粒及其制備方法，和一種檢測痰液中肺癌細胞的方法。該方法檢測痰液中肺癌細胞具有較高的陽性率。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是一種結合肺癌細胞的復合 !^e3O4磁性納米顆粒，其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標記有對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白的狗304磁性納米顆粒，其中，所述的對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白是由蛋白SPA(葡萄球菌A蛋白)和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。所述的抗⑶44抗體優選兔抗人⑶44，抗CK7抗體優選兔抗人CK7。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之二是一種如上所述的結合肺癌細胞的復合狗304磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟1)制備!^e3O4磁性納米顆粒；2)在步驟1)所得的!^e3O4磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺；3)在步驟2、所得的聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4磁性納米顆粒表面標記對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白，該復合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。本發明中，步驟1)制備!^e3O4磁性納米顆粒的方法可以本領域常規方法，較佳的采用共沉淀法。更佳的步驟1)具體包括將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質量比為4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質量10倍于鐵離子的環氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經陳化后用去離子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝膠進行400°C下退火處理即制得!^e3O4 沉淀；將制得的!^e3O4沉淀依次用去離子水和乙醇交替清洗，至pH值為中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性納米顆粒。步驟1)所述的!^e3O4磁性納米顆粒的平均粒徑范圍較佳的是15 50nm，更佳的是20nm。本發明中，步驟幻在!^e3O4磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺的方法可以采用現有技術，較佳的，步驟2、具體包括將!^e3O4磁性納米顆粒置于PBS緩沖溶液中，超聲分散， 緩慢加入聚乙酰亞胺(PEI)，慢速充分攪拌均勻后，移至恒溫水浴上繼續慢速攪拌M小時， 水浴溫度保持30°C ；用磁分離法將固體從溶液中分離，將固體依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至PH值為中性，真空干燥，即得PEI修飾的!^e3O4納米粒子。本發明中，較佳的，步驟幻具體包括將聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子懸浮于 0. OlM pH7. 2TBS之中，得納米粒子溶液，其中聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子的濃度約為 3 X IO13個/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分別溶解蛋白A和蛋白B,混勻，4°C反應30分鐘，即得復合蛋白溶液，其中，蛋白A濃度為10mg/ml，蛋白B濃度為lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白 B是抗CD44抗體和/或抗CK7抗體，優選兔抗人CD44和/或兔抗人CK7 ；將上述復合蛋白溶液與上述納米粒子溶液均勻混合，室溫60分鐘，即得復合納米磁性顆粒溶液。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之三是一種富集痰液中肺癌細胞的方法，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入所述的復合納米磁性顆粒溶液進行反應；c)將步驟b)的反應液離心富集其中的細胞。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之四是一種檢測痰液中肺癌細胞的方法，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入所述的復合納米磁性顆粒溶液進行反應；c)將步驟b)的反應液離心富集其中的細胞，將所得細胞重新懸浮，然后采用液基薄層細胞學檢測系統將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。本發明中，步驟a)中采集和液化痰液的方法是本領域常規方法。較佳的，痰液中加入堿性裂解液以充分液化痰液，所述的堿性裂解液優選丨^蛋白酶！^，川^ NaOH的水溶液。本發明中，步驟b)所述的反應優選室溫靜置15分鐘。本發明中，步驟c)離心富集細胞的方法是常規方法，所述的離心優選500rpm，5分鐘；離心所得的細胞優選懸浮在保存液中，保存液優選10%甲醇水溶液。本發明中，上述優選條件在符合本領域常識的基礎上可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明除特別說明之外，所用的百分比都是質量百分比。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。本發明中所述的“室溫”是指試驗操作間的溫度，一般為25V。
相比于現有技術，本發明的有益效果如下本發明采用聚乙酰亞胺(PEI)對高磁性能狗304納米顆粒表面進行氨基化處理，使聚乙酰亞胺上的亞甲基與鐵配位，并通過調節 PH值和溫度，使聚乙酰亞胺牢固與!^e3O4納米顆粒相連接。該材料可以很好的分散于水溶液中，并且具有良好的生物相容性和順磁性。為了提高結合肺癌細胞的能力，又標記了能結合肺癌細胞的復合蛋白，不僅有效地降低了成本，而且明顯地提高了富集肺癌細胞的效率。 該復合I^e3O4納米顆粒具有富集、分離痰液體系中肺癌細胞的功能，集成液基細胞病理學方法，提高了痰液中肺癌細胞檢測的可靠性和準確性。檢測痰液中肺癌細胞的陽性率比常規方法提高了 30%以上。并且增加了檢測樣本量，減少了被測者的往返，檢測效率明顯提高， 而且費用有所降低，適合于體檢、普查。


以下結合

本發明的特征和有益效果。圖1是聚乙烯亞胺包覆的納米四氧化三鐵納米粒子。圖2是復合納米顆粒附著于肺癌脫落細胞表面。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1 Fii3O4納米顆粒的制備1)將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質量比為4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0. 5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質量10倍于鐵離子的環氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經陳化后用乙醇清洗并干燥； 隨后進行400°C下退火處理即制得狗304。2)反應結束后，將制得的!^e3O4依次用去離子水和乙醇交替清洗，至pH值為7。最后在真空條件下進行干燥，即得!^e3O4磁性納米顆粒。3)取5g上述制備的!^e3O4磁性納米顆粒，置于20ml去離子水中，超聲(IOOOkHz) 分散30min后離心(或磁性)分離，得納米!^e3O4沉淀A。4)將沉淀A 5g重置于IOml PBS緩沖溶液中，超聲分散，緩慢加入70mg聚乙酰亞胺(PEI)，慢速200r/min充分攪拌均勻后，移至恒溫水浴上繼續慢速攪拌Mhr，水浴溫度保持 30 0C ο5)用磁分離法將固體從溶液中分離，得沉淀B和上清液。6)將沉淀B依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至pH值為7，然后真空干燥，即得PEI 修飾的!^e3O4納米粒子，存放于干燥皿中備用。透射電鏡和粒度分析結果表明，該PEI修飾的!^e3O4磁性納米顆粒基本呈單分散、 球狀、粒度分布比較窄、平均粒徑約為20nm。其中電鏡圖見圖1。實施例2復合納米磁性顆粒的制備1、取PEI修飾的!^e3O4納米粒子lOOmg，懸浮于IOml 0. OlM pH7. 2TBS之中，得納米粒子溶液，其中PEI修飾的!^e3O4納米粒子的濃度約為3X IO13個/ml。2、制備復合蛋白用:3ml 0. OlM pH7. 2TBS分別溶解蛋白A(SPA)和蛋白B (兔抗人⑶44和CK7)(均購自鈺森生物科技有限公司)，混勻，置4°C反應30分鐘，蛋白A濃度為 10mg/ml，蛋白 B 濃度為 lmg/ml。3、取上述AB復合蛋白溶液0. 5ml與上述納米粒子溶液IOml均勻混合，室溫60分鐘，即得復合納米磁性顆粒溶液。實施例3痰液中肺癌細胞的病理學檢測將850例肺癌患者痰液標本隨機分為2組。患者需連續3天留晨痰，2小時內送到醫院，否則，痰液變質，細胞自溶，無法診斷。采集患者痰液5ml于痰盒內，加入0.5ml堿性裂解液(含1 %蛋白酶K，10% NaOH的水溶液)混勻，室溫保持lOmin，充分液化痰液。實驗組進行肺癌細胞富集和液基細胞病理學檢測。在上述液化痰液中加入1/10 體積實施例2制得的復合納米磁性顆粒溶液，混勻，靜置15分鐘。500rpm離心5分鐘， 取沉淀在保存液(10%甲醇水溶液)中懸浮。然后采用新柏氏液基薄層細胞學檢測系統 (Thinprep cytology test, TCT)將上述懸浮液制片、染色、封片、鏡檢(圖2)。對照組進行常規細胞學方法檢測痰液中的肺癌脫落細胞。用竹簽挑取上述液化痰液，涂片，然后進行染色、封片、鏡檢。結果常規細胞學方法檢測陽性率為6. 4% (54/850)，復合納米微球處理后再行液基細胞學方法檢測陽性率為38. 9% (331/850)。
權利要求
1.一種結合肺癌細胞的復合I^e3O4磁性納米顆粒，其特征在于，其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標記有對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白的I^e3O4磁性納米顆粒，其中，所述的對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。
2.一種如權利要求1所述的結合肺癌細胞的復合!^e3O4磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)制備Fe^3O4磁性納米顆粒；2)在步驟1)所得的!^e3O4磁性納米顆粒表面修飾聚乙酰亞胺；3)在步驟幻所得的聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4磁性納米顆粒表面標記對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白，該復合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述的!^e3O4磁性納米顆粒的平均粒徑范圍是15 50nm。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)包括將硝酸鐵和硝酸亞鐵以摩爾質量比為4 1的比例于乙醇中形成分散均勻的乙醇溶液，其中鐵離子濃度為0.5 1. Omol/L ；在制得的乙醇溶液中加入摩爾質量10倍于鐵離子的環氧氯丙烷形成溶膠，靜置后形成凝膠；制得的凝膠經陳化后用去離子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝膠進行 400°C下退火處理即制得!^e3O4沉淀；將制得的!^e3O4沉淀依次用去離子水和乙醇交替清洗， 至PH值為中性，真空干燥，即得!^e3O4磁性納米顆粒；步驟2、包括將!^e3O4磁性納米顆粒置于PBS緩沖溶液中，超聲分散，緩慢加入聚乙酰亞胺(PEI)，慢速充分攪拌均勻后，移至恒溫水浴上繼續慢速攪拌M小時，水浴溫度保持30°C ；用磁分離法將固體從溶液中分離，將固體依次用蒸餾水和甲醇交替清洗至PH值為中性，真空干燥，即得PEI修飾的!^e3O4納米粒子；步驟幻包括將聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子懸浮于0. OlM pH7. 2TBS之中，得納米粒子溶液，其中聚乙酰亞胺修飾的!^e3O4納米粒子的濃度約為3X IO13個/ml ；用0. OlM pH7. 2TBS分別溶解蛋白A和蛋白B，混勻，4°C反應30分鐘，即得復合蛋白溶液，其中，蛋白A濃度為10mg/ml，蛋白B濃度為lmg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗⑶44 抗體和/或抗CK7抗體；將上述復合蛋白溶液與上述納米粒子溶液均勻混合，室溫60分鐘，即得復合納米磁性顆粒溶液。
5.一種富集痰液中肺癌細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入如權利要求1所述的復合納米磁性顆粒的溶液進行反應；c)將步驟b)的反應液離心富集其中的細胞。
6.一種檢測痰液中肺癌細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟a)采集痰液，充分液化痰液；b)在步驟a)所得的液化痰液中加入如權利要求1所述的復合納米磁性顆粒的溶液進行反應；c)將步驟b)的反應液離心富集其中的細胞，將所得細胞重新懸浮，然后采用液基薄層細胞學檢測系統將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的痰液中加入堿性裂解液以充分液化痰液，所述的堿性裂解液蛋白酶K，10% NaOH的水溶液。
8.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟b)所述的反應是室溫靜置15分鐘。
9.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟c)所述的離心是500rpm，5分鐘； 離心所得的細胞懸浮在保存液中，保存液是10%甲醇水溶液。
全文摘要
本發明公開了一種結合肺癌細胞的復合Fe3O4磁性納米顆粒及其制備方法。其是在表面修飾著聚乙酰亞胺，并標記有對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白的Fe3O4磁性納米顆粒，其中，所述的對肺癌細胞具有結合能力的復合蛋白是由蛋白SPA和選自抗CD44抗體和抗CK7抗體中的一種或兩種組成的復合蛋白。本發明還公開了一種富集和檢測痰液中肺癌細胞的方法，包括a)采集痰液，充分液化痰液；b)加入所述的復合納米磁性顆粒的溶液進行反應；c)將反應液離心富集其中的細胞。將所得細胞重新懸浮，采用液基薄層細胞學檢測系統(TCT)將該懸浮液制片、染色、封片、鏡檢。該方法檢測痰液中肺癌細胞的陽性率比常規方法提高30％以上，檢測效率明顯提高，檢測成本有所下降。
文檔編號G01N1/34GK102344117SQ20101024631
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者嚴彪, 李成魁, 李輝, 陳崗 申請人:同濟大學附屬上海市肺科醫院