專利名稱：一種類固醇類環境內分泌干擾物羥基酮基同步衍生化方法
技術領域：
本發明屬環境分析化學領域，是一種涉及類固醇類環境內分泌干擾物(雌酮、 17 3 -雌二醇、雌三醇、17 a -乙炔基雌二醇和孕酮)的羥基酮基同步衍生化方法，是氣相色 譜_質譜聯用儀用于分析此類物質的樣品前處理方法和核心技術。
背景技術：
環境內分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)又稱環境激素 (Environmental Hormones)，是指環境中天然存在或人為排放的，能夠通過模擬動物或人 體內的生理生化作用，起到干擾或抑制內分泌系統，并對生殖、神經和免疫系統功能產生影 響的一大類外源性化合物。EDCs具有很強的毒性和生物蓄積性，可通過飲用水和食物鏈富 集來干擾動物和人類的內分泌系統，在極低濃度下即對生物體產生嚴重危害。類固醇類環 境內分泌干擾物(Steroids Endocrine Disrupting Chemicals)是EDCs 的一種，是由膽固 醇合成的一種生物活性物質。這類物質化學性質穩定，難以分解，易于在生物體內富集，相 對其他EDCs，有更強的內分泌干擾作用。所以，類固醇類環境內分泌干擾物的研究已成為國 際環境分析化學領域的前沿和熱點課題之一。現今，涉及類固醇類環境內分泌干擾物的分析檢測方法很多，但就世界范圍來 說還處于起步階段，沒有現成的標準分析方法。在實際工作中，氣相色譜-質譜聯用法 (GC-MS)以其良好的檢測靈敏度，避免過多的溶劑浪費，相對快速的分析過程和較低的運行 成本而受到環境痕量分析工作者的青睞。但是由于類固醇類環境內分泌干擾物本身的弱揮 發性和熱不穩定性，加之含有羥基，酮基等極性官能團，直接用GC-MS分析，在氣相色譜柱 內容易產生吸附，從而使檢出值偏低，靈敏度下降，不利于痕量分析。GC-MS分析此類物質通 常需通過衍生化技術，將其轉化成極性較低，更易揮發且熱穩定性好的衍生化產物，從而提 高檢測靈敏度和改善色譜峰形，達到痕量分析的要求。在衍生化技術研究領域中，類固醇類環境內分泌干擾物單羥基衍生化技術已經取 得一定成果，主要采用三甲基硅烷化(TMS)衍生化技術，研究內容全面，基本滿足應用要 求。相比之下，類固醇類環境內分泌干擾物的酮基以其自身的性質決定其衍生化難度高于 羥基，研究酮基衍生化的工作開展較少。因為酮基衍生化研究的匱乏，導致一次性分析含 有羥基與酮基的多組分的工作難于開展。目前，國際上羥基酮基同步衍生化技術發展也有 研究，但其開發極不完善，反應條件差別很大，應用試劑種類繁多。在國內外論文報道的各 種能夠同步衍生化羥基酮基的試劑中，以硅烷化試劑N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 (N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroa-cetamide, MSTFA)為基質，加入催化劑(三 甲基碘硅烷(Trimethyliodosilane, TMIS)或碘化銨(Ammonium iodide, NH4I))與還原劑 (二硫赤蘚糖醇(DithioerythreitoLDTE)或乙硫醇(ethanethiol))為最常用的衍生化試 劑，但此類方法研究主要集中在臨床醫學與興奮劑檢測領域，檢測物質也很少涉及類固醇 類環境內分泌干擾物，絕大多數檢測的物質在結構上與類固醇類內分泌干擾物結構相近， 有一定的參考價值。如Hartman (Hartmann S，Steinhart H. Journal of ChromatographyB，1997,704(1/2) :105 117)應用 MSTFA/TMIS/DTE(1000 2 2，v/v/w)為衍生化試 劑，在反應條件60°C持續15min，檢測肉類中雄激素、雌激素、孕激素及其代謝產物時指出， GC-MS檢測的靈敏性明顯高于單羥基硅烷化法；Magnisali(MagnisaliP，Dracopoulou M， Mataragas M, Dacou—Voutetakis A, Moutsatsou P. Journal of Chromatography A,2008, 1206(2) :166 177)也采用MSTFA/TMIS/DTE，在80°C，35min條件下對類固醇類物質進 行衍生化。目前，關于類固醇類環境內分泌干擾物的羥基酮基同步衍生化在國內尚無專 利。國際上，羥基酮基同步衍生化技術近年也開始應用于環境領域，如Aerni(H.R.Aerni， B. Kobler, B. V. Rutishauser, et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2004, 378(7) 1873 1873)禾口 Rutishauser(B. V. Rutishauser，M. Pesonen, B. I. Escher, et al.Environmental Toxicology and Chemistry，2004，23(4)857 864)以 MSTFA/TMIS/ DTE (1000 2 2, v/v/w)檢測污水中類固醇類環境內分泌干擾物，但以上應用對反應條 件要求較高，實驗過程比較繁瑣。通過對食品安全，興奮劑檢測以及環境領域的綜合研究發現，羥基酮基同步衍生 化法存在的不足主要是目前所應用的羥基酮基衍生化法過程過于繁瑣，至今對衍生化方 法缺乏系統研究。缺乏針對典型類固醇類環境內分泌干擾物的羥基酮基衍生化法。衍生化 反應需要在加熱的條件下進行，加熱溫度為60 80°C，加熱時間為15min lh，催化劑加 入量差別較大，這都使得衍生化實驗能耗和成本上升，實驗時間較長，在實際環境樣品檢測 中，加大了樣品流失，降低了檢測準確度。所以，本發明以環境中貢獻量較大且極具危害的五種典型類固醇類環境內分泌干 擾物作為研究對象，包括生物體內天然存在的雌酮(Estrone，El)、17 0-雌二醇(強力求偶 素)(17 0 -Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和孕酮(progesterone，PROG)以及人工 合成的用于口服避孕藥物的17 a-乙炔基雌二醇(na-ethynylestradoil，EE2)，研究羥 基酮基同步衍生化方法，使之適用于痕量類固醇類環境內分泌干擾物的檢測要求。

發明內容
本發明的目的在于針對目前類固醇類環境內分泌干擾物羥基酮基同步衍生化中 存在的不足，提出一種衍生化新方法。該方法具有實驗操作簡便、省時、衍生化效果好的優
點o本發明類固醇類環境內分泌干擾物羥基酮基同步衍生化方法，其特征在于包括如 下步驟(1)在酮基同步衍生化步驟中，將固體狀類固醇類環境內分泌干擾物雌酮、17 3 雌二醇、17 a -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及內標5 a -雄烷分別溶于甲醇中，振蕩60s， 配成濃度為1 P g/y L標準儲備液，密封后置于-20 -40°C保存；(2)根據需要，用甲醇以及所說的標準儲備液配成含有濃度為5pg/L long/的雌 酮、17 0 -雌二醇、17 a -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮并含有濃度為100pg/ u L內標的標準 混合溶液；(3)取100yL步驟⑵所制備的標準混合溶液于1.5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入 氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干；(4)加入以N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷與二硫赤蘚糖醇配成的、其比例為1000 uL 5mg 10 ii L 5mg的衍生化試劑，振蕩混合30s后，在20 60°C下反應5 lOmin，以得到雌酮羥基酮基衍生化產物、17 ^ -雌二醇雙羥基衍生化產物、 17 a-乙炔基雌二醇雙羥基衍生化產物、雌三醇三羥基衍生化產物、孕酮雙酮基衍生化產 物；(5)將反應后的樣品取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入氣相色譜-質 譜聯用儀分析。在所述步驟(1)中類固醇類環境內分泌干擾物雌酮、170-雌二醇、17a-乙炔基 雌二醇、雌三醇、孕酮以及內標5a -雄烷均分別用E1、E2、EE2、E3、PROG和I. S.表示。在所述步驟(3)中，高純氮氣純度為99. 99%以上；在氮吹儀中吹干時無需加熱， 常溫條件下即可。在所述步驟(4)中，N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷與二硫赤 蘚糖醇分別用MSTFA，TMIS與DTE表示，其配成的衍生化試劑MSTFA，TMIS與DTE分配比為 1000 u L 5 lOilL 5mg，以 MSTFA/TMIS/DTE (即 1000 5 10 5，v/v/w)表示，配 成的衍生化試劑固定用量為100 yL。在所述步驟(4)中，雌酮羥基酮基衍生化產物、17 雌二醇雙羥基衍生化產物、 17 a -乙炔基雌二醇雙羥基衍生化產物、雌三醇三羥基衍生化產物、孕酮雙酮基衍生化產物 分別以 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3 和 di_TMS-PR0G 表示。在所述步驟(5)中，氣相色譜-質譜聯用儀所用色譜柱為Supelco SpB -5或者 J&W Scientific DB-5MS毛細管柱；氣相色譜儀以氦氣為載氣，流速為lmL/min ；不分流方 式進樣，進樣口溫度為280°C，進樣體積ly L，升溫程序如下
12°C/ min3。C/ min
50°C (2 min) ^ 260°C (8min) ^ 280°C (5min)0在所述步驟(5)中，質譜儀接口溫度為280°C，傳輸線溫度為300°C，離子源溫度為 250°C，電離方式為電子轟擊電離，即EI，電子轟擊能量為70eV，溶劑延遲時間為12min。在所述步驟(5)中，氣相色譜_質譜聯用儀以全掃描模式定性，掃描范圍m/z50 600，定量采用選擇離子掃描模式，即SIM模式；在SIM模式下，di-TMS-El、di-TMS_E2、 di-TMS-EE2、tri-TMS-E3、di-TMS-PR0G 分別選取 m/z 414、399、309，m/z 416、285、232，m/z 440、425、300，m/z 504、345、311，m/z 458、443、156 作為特征碎片離子，掃描時間為 0. 5 0. 7s。和現有技術相比，本發明具有以下優點或積極效果1、本發明實現了類固醇類環境內分泌干擾物的羥基酮基同步衍生化，極大減小了 因羥基酮基這兩類最常出現的官能團所產生的極性問題，適用于含有羥基酮基的類固醇類 環境內分泌干擾物的同步測定。2、確定了理想的催化劑用量，在不影響實驗結果的前提下，節約了試劑，降低了實 驗成本。3、衍生化反應溫度比較低且較為寬泛，常溫條件下(20°C )亦可，由于可省去加熱 步驟，使衍生化實驗變得簡便，降低了能耗和成本。
4、衍生化反應時間較短，為5min lOmin，整個衍生化實驗操作可在12min內完成。5、所選擇的衍生化試劑可作為進樣溶劑，簡化了實驗操作減少了樣品流失，提高 了檢測效率和準確度。6、在上述條件下，本發明可以將五種類固醇類環境內分泌干擾物E1、E2、EE2、 E3、PROG的羥基酮基同步衍生化，衍生化產物分別為di-TMS-El、di-TMS_E2、di-TMS_EE2、 tri-TMS-E3和di_TMS-PROG。同時EE2并無副產物生成。各衍生化產物的線性相關性良好， 為 0. 99481 0. 99730，線性范圍 di-TMS-El、di-TMS-EE2、tri-TMS-E3 為 lpg/ii L 500pg/ U L, di-TMS-E2 為 0. lpg/ ii L 500pg/ u L, di-TMS-PROG 為 5pg/ ii L 500pg/ u L。儀器 檢出限可達0. 01 lpg/uLo本發明可以應用于水體、底泥、生物等樣品中類固醇類環境內分泌干擾物El、E2、 EE2、E3、PROG 的 GC—MS 檢測。


圖1是類固醇類環境內分泌干擾物E1、E2、EE2、E3、PR0G及其衍生化產物的化學
結構圖。圖2是類固醇類環境內分泌干擾物￡1』2、￡￡2、￡3、？1 ( 濃度為lng/yL以及內 標濃度為lOOpg/yL未衍生化時GC-MS檢測的選擇離子掃描模式(SIM)色譜圖。圖3是類固醇類環境內分泌干擾物El、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lng/ u L的衍生 化產物 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG,以及含有濃度為 lOOpg/yL內標經GC-MS檢測的選擇離子掃描模式(SIM)色譜圖。
具體實施例方式下面用實施例并結合附圖對本發明作進一步說明。在下述實施例中，所用類固 醇類環境內分泌干擾物雌酮、170雌二醇、17a乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及內標 5 a -雄烷的純度均為99%，所用甲醇均為色譜純。實施例1羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并含有濃度為 100pg/uL內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF分別為 0. 0759,0. 2326,0. 0670,0. 1143,0. 0491。實施例2羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_30°C保 存待用；用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并含有濃度為 100pg/uL內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0760,0.2320,0.0692,0.1145,0.0493。實施例3羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并含有濃度為 100pg/uL內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 30°C恒溫干燥加熱環境中反應7min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0757,0.2323,0.0694,0.1147,0.0489。實施例4羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并含有濃度為 100pg/uL內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；
3、加入 lOOiiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0759,0.2323,0.0693,0.1142,0.0489。實施例5羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_30°C保 存待用；用甲醇以及標準儲備液配成含有El、E2、EE2、1E3、PR0G濃度為5pg/L并含有濃度 為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG，EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0755,0.2322,0.0691,0.1143,0.0488。實施例6羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并含有濃度為 100pg/uL內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C 反應 5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0757,0.2322,0.0693,0.1145,0.0490。實施例7羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為
1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0756,0.2321,0.0694,0.1147,0.0490。實施例8羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0755,0.2322,0.0694,0.1144,0.0490。實施例9羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_30°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5pg/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。
經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成， RRF(相對響應因子Relative Response Factor，待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別 為 0.0759,0.2322,0.0693,0.1143,0.0491。實施例10羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取100i! L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C常溫環境中反應8min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 501,65. 067、19. 999、15. 149、18. 780。實施例11羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C 恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 503,65. 065,20. 001,15. 151,18. 782。實施例12羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 lOOiiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C常溫環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，E1、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 500,65. 067、19. 996、15. 152、18. 779。實施例13羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_30°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C常溫環境中反應8min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，E1、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 498,65. 066、19. 998、15. 153、18. 777。實施例14羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C常溫環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 503,65. 067、19. 997、15. 150、18. 779。實施例15羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 P g/ P L的標準儲備液，密封后置于_20保存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取100 y L驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹 儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 lOOiiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C常溫環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 504,65. 065,20. 002、15. 151、18. 776。實施例16羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C常溫環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 504,65. 069、19. 995、15. 146、18. 776。實施例17羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C常溫環境中反應8min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 546,65. 070,19. 996,15. 151,18. 781。實施例18
羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為5000pg/L 并含有濃度為lOOpg/y L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的度99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 8 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C常溫環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 24. 500,65. 070、19. 995、15. 145、18. 783。實施例19羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_40°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 002、130. 135,39. 998,30. 299,37. 566。實施例20羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 005、130. 133,39. 996,30. 300,37. 562。實施例21羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應8min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 001、130. 137,40. 001,30. 296,37. 568。實施例22羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 48. 997、130. 136,39. 997,30. 301,37. 567。實施例23羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 10 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于40°C恒溫干燥加熱環境中反應lOmin ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PROG羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 003、130. 132,40. 002,30. 295,37. 569。實施例24羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/ y L的標準儲備液，密封后置于_20保存 待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并含 有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C 恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 ii L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 006、130. 139,39. 995,30. 302,37. 569。實施例25羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100iiL MSTFA/TMIS/DTE(1000 5 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 40°C恒溫干燥加熱環境中反應8min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 006、130. 132,39. 995,30. 303,37. 563。實施例26羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；
2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 lOOii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 20°C 恒溫干燥加熱環境中反應5min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG, EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 006、130. 136,40. 003,30. 301,37. 562。實施例27羥基酮基同步衍生化方法的具體步驟為1、首先，準確稱取￡1、￡2、￡￡2、￡3、冊06以及內標10mg分別置于10mL色譜瓶中， 分別加入10mL甲醇，振蕩60s，配成濃度各為1 y g/y L的標準儲備液，密封后置于_20°C保 存待用；根據需要，用甲醇以及標準儲備液配成含有E1、E2、EE2、E3、PR0G濃度為lOng/L并 含有濃度為100pg/ii L內標的標準混合溶液；2、取lOOy L步驟(1)所制備的標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮 吹儀，通入純度99. 99%的氮氣緩慢吹干；3、加入 100ii LMSTFA/TMIS/DTE(1000 7 5，v/v/w)，振蕩 30s 混合后，置于 60°C 恒溫干燥加熱環境中反應8min ；4、取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1 y L注入GC-MS以SIM模式分析。經檢測，El、E2、EE2、E3、PR0G羥基酮基均同步衍生化，衍生化產物分別為 di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、tri_TMS_E3、di-TMS-PROG，EE2 也無副產物生成，RRF 分別為 49. 005、130. 138,39. 994,30. 293,37. 566。
1權利要求
一種類固醇類環境內分泌干擾物羥基酮基同步衍生化方法，其特征在于包括如下步驟(1)在羥基酮基同步衍生化步驟中，將固體狀類固醇類環境內分泌干擾物雌酮、17β雌二醇、17α 乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及內標5α 雄烷分別溶于甲醇中，振蕩60s，配成濃度為1μg/μL標準儲備液，密封后置于 20～ 40℃保存；(2)根據需要，用甲醇以及步驟(1)所制備的標準儲備液配成含有濃度為5pg/L～10ng/L的雌酮、17β 雌二醇、17α 乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮并含有濃度為100pg/μL內標的標準混合溶液；(3)取100μL步驟(2)所制備的標準混合溶液于1.5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干；(4)加入以N 甲基 N 三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷與二硫赤蘚糖醇配成的、其比例為1000μL∶5mg～10μL∶5mg的衍生化試劑，振蕩混合30s后，在20～60℃條件下反應5～10min，以得到雌酮羥基酮基衍生化產物、17β 雌二醇雙羥基衍生化產物、17α 乙炔基雌二醇雙羥基衍生化產物、雌三醇三羥基衍生化產物、孕酮雙酮基衍生化產物；(5)將反應后的樣品取出冷卻至室溫，振蕩混合30s后，取1μL注入氣相色譜 質譜聯用儀分析。
2.根據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟(1)中類固醇類環境內 分泌干擾物雌酮、17 β -雌二醇、17 α -乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮以及內標5 α -雄烷均分 別用 El、E2、EE2、E3、ra0G 和 I. S.表示。
3.根據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟(3)中，高純氮氣純度為 99. 99%以上；在氮吹儀中吹干時無需加熱，常溫條件下即可。
4.根據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟⑷中，N-甲基-N-三甲 基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷與二硫赤蘚糖醇分別用MSTFA，TMIS與DTE表示，其配成 的衍生化試劑 MSTFA, TMIS 與 DTE 分配比為 1000 μ L 5 10 μ L 5mg,以 MSTFA/TMIS/ DTE (即1000 5 10 5，v/v/W)表示，配成的衍生化試劑固定用量為100 μ L。
5.根據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟(4)中，雌酮羥基酮基衍 生化產物、17 β -雌二醇雙羥基衍生化產物、17 α -乙炔基雌二醇雙羥基衍生化產物、雌三 醇三羥基衍生化產物、孕酮雙酮基衍生化產物分別以di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS_EE2、 tri-TMS-E3 和 di-TMS-PROG 表示。
6.根據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟(5)中，氣相色譜-質譜 聯用儀所用色譜柱為Supelco SPB -5或者J&W Scientific DB-5MS毛細管柱；氣相色譜儀 以氦氣為載氣，流速為lmL/min ；不分流方式進樣，進樣口溫度為280°C，進樣體積1 μ L，升 溫程序如下
7.據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟(5)中，質譜儀接口溫度為 280°C，傳輸線溫度為300°C，離子源溫度為250°C，電離方式為電子轟擊電離，即EI，電子轟擊能量為70eV，溶劑延遲時間為12min。
8.根據權利要求1的同步衍生化方法，其特征在于所述步驟(5)中，氣相色譜-質譜 聯用儀以全掃描模式定性，掃描范圍m/z 50 600，定量采用選擇離子掃描模式，即SIM模 式；在 SIM 模式下，di-TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS-EE2、tri-TMS-E3、di-TMS-PR0G 分別選取 m/z 414、399、309，m/z 416、285、232，m/z 440、425、300，m/z 504、345、311，m/z 458、443、 156作為特征碎片離子，掃描時間為0. 5 0. 7s。
全文摘要
一種類固醇類環境內分泌干擾物(雌酮、17β-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、雌三醇、孕酮)的羥基酮基同步衍生化方法，其步驟為首先取含有類固醇類環境內分泌干擾物以及內標的標準混合溶液于常溫下通入高純氮氣吹干，加入以N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，三甲基碘硅烷與二硫赤蘚糖醇配成的比例為1000μL∶5～10μL∶5mg衍生化試劑，在20～60℃下反應5～10min，以得到衍生化產物，如附圖。該方法具有操作簡便、省時、能耗和成本低等優點。可將羥基酮基同步衍生化，各衍生化產物線性相關性良好，儀器檢出限可達0.01～1pg/μL，可應用于水體、底泥、生物等樣品中類固醇類環境內分泌干擾物的GC-MS檢測。
文檔編號G01N30/06GK101942006SQ201010223719
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月12日 優先權日2010年7月12日
發明者劉晶靚, 方鍇, 潘學軍, 王宇, 高建培, 黃斌 申請人:昆明理工大學