專利名稱：測定染料、抗體、藥物和藥物前體分子在多肽分子上相對吸附常數的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學技術領域，具體地說，本發明涉及一種利用掃描隧道顯微技 術Scanning Tunneling Microscopy, STM)測定染料、抗體、藥物和藥物前體等分子在多肽 上相對吸附常數的方法。
背景技術：
在藥物設計和開發研究中，解析靶標蛋白與藥物相互作用的模式和結合本質是 極其重要的，一般可以用高通量的蛋白質結晶和高分辨的X射線晶體衍射技術、二維核磁 共振技術來進行研究(可參考 Daniel Picot, Patrick J. Lollet al.，Nature 1994，367， 243. R Aneta Τ. Petkova, Yoshitaka Ishii et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 2002, 99，16742.)。現在X射線晶體衍射技術已經很成熟，但由于一些重要的蛋白(例如膜蛋白，淀粉 樣蛋白)分子本身的難結晶性，很難獲得高質量的晶體學數據來研究藥物分子與蛋白的相 互作用。另外，即使獲得了蛋白和藥物分子的共結晶，藥物在靶標蛋白上的結合位點也很難 保證具有周期性，所以解析藥物分子與蛋白的相互作用仍然困難重重。核磁共振技術可以 精確解析溶液中的分子結構，避開了結晶的困難，但能解析的分子質量有限制。現也有大量研究基于超級計算機，進行分子模擬并實現可視化，得以模擬蛋白與 蛋白或蛋白與小分子相互作用的動態過程，解析藥物作用的結構基礎，并設計新的藥物分 子。但是計算機模擬與實驗研究之間不可避免的存在著一些差距。所以急需發展實驗研究 方法獲得藥物分子與蛋白或多肽相互作用的作用位點和直觀圖像，在分子尺度上研究藥物 分子在蛋白或多肽上的吸附能力。本發明發展了一種新方法，利用掃描隧道顯微技術測定 染料、抗體、藥物和藥物前體等待測分子在多肽上的相對吸附常數。

發明內容
本發明的目的在于，提供一種測定待測分子在多肽分子上相對吸附常數的方法， 該方法包括如下步驟1)將多肽分子和標記分子進行組裝，獲得多肽分子與標記分子的組裝體的掃描隧 道顯微鏡圖像；2)將多肽分子、標記分子和待測分子進行組裝，形成組裝體，以獲得所述待測分子 在多肽分子和標記分子上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像；3)對比步驟1)和步驟2)中獲得的掃描隧道顯微鏡圖像，統計待測分子吸附在多 肽分子以及標記分子上的吸附數量；4)將步驟幻獲得的待測分子在標記分子上的吸附數量歸一化為單位1，確定待測 分子在多肽分子上的相對吸附常數。優選地，在所述步驟1)中，所述組裝體的制備方法包括如下步驟
i)將所述多肽分子與所述標記分子充分混合，形成混合液；ii)將步驟i)得到的混合液滴加到導電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基 底以及硅等半導體基底表面，以形成組裝體。其中，多肽分子與標記分子形成組裝體，可以除去溶劑在固/氣界面獲得組裝體 的掃描隧道顯微鏡圖像，也可保留溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖 像。優選地，在所述步驟2、中，所述組裝體的制備方法包括如下步驟i)將所述多肽分子、所述標記分子以及所述待測分子充分混合，形成混合液；ii)將步驟i)得到的混合液滴加到導電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基 底以及硅等半導體基底表面，以形成組裝體。其中，多肽分子、標記分子以及待測分子形成組裝體，可以除去溶劑在固/氣界面 獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像，也可保留溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧 道顯微鏡圖像。優選地，在制備組裝體中，采用超聲來充分混合。優選地，在制備組裝體中，所述導電性基底為石墨，所述石墨優選為新解理的高定 向石墨。高定向石墨具有原子級平整的表面，而且在很多環境中都很穩定，適于掃描隧道顯 微鏡的研究。優選地，在制備組裝體中，還包括除去所述基底表面殘留液的步驟，優選地，可以 采用吹惰性氣體(例如氮氣)的方式來除去所述基底表面的殘留液。其中，可以除去溶劑在固/氣界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像，也可保留 溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像。優選地，所述待測分子為染料、抗體、藥物或藥物前體分子等。優選地，所述染料為酞菁、嚇啉類分子及其衍生物，剛果紅、硫磺素、姜黃素及其衍 生物；所述抗體為淀粉質多肽分子抗體；所述藥物為吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯等氮雜環 類分子及其衍生物，例如4’ 4-聯吡啶，乙烯吡啶，三吡啶，剛果紅，姜黃素；所述藥物前體為 硫磺素。優選地，所述多肽分子為五聚丙氨酸、八聚苯丙氨酸和八聚組氨酸。本發明以五聚 丙氨酸、八聚苯丙氨酸和八聚組氨酸為例，其他多肽也可以，例如beta淀粉樣多肽及其片 段、胰淀素多肽及其片段、prion片段多肽、寡聚多肽、嵌段寡聚多肽、人工序列多肽等。優選地，所述標記分子為吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯類氮雜環分子及其衍生物， 例如4’ 4-聯吡啶、乙烯吡啶，三吡啶、嘧啶等，優選地，所述標記分子為4’ 4-聯吡啶。綜上所述，本發明的目的在于發展一種基于掃描隧道顯微鏡的新方法，在分子水 平上研究蛋白或多肽與小分子的相互作用，測定染料、抗體、藥物和藥物前體等待測分子在 多肽上的相對吸附常數。在利用掃描隧道顯微鏡來測定染料、抗體、藥物和藥物前體等待測分子在多肽上 相對吸附常數的方法中，獲得多肽分子自組裝結構的STM圖像之后，或通過與標記分子的 共吸附獲得多肽-標記分子的共組裝結構的STM圖像之后，加入染料、抗體、藥物和藥物前 體等待測分子，得到待測分子在多肽上的結合位點和吸附數量，并在分子水平上研究多肽 和待測分子的相互作用，測定待測分子在多肽上相對吸附常數的方法。
本發明的一個實施方案通過識別多肽分子組裝特征，來測定染料、抗體、藥物和藥 物前體等待測分子在多肽上相對吸附常數，包括如下步驟1)制備多肽分子(或與標記分子共混)溶液，超聲10分鐘；2)在多肽分子的溶液中，或多肽分子與標記分子的混合溶液中，加入染料、抗體、 藥物或藥物前體等待測分子溶液，使其充分混合；3)混合之后，取15微升溶液滴在新解理的高定向石墨表面，靜置10分鐘；4)用高純氮氣把殘留在石墨表面的溶液吹走；5)用掃描隧道顯微鏡來進行測定，統計出高分辨掃描隧道顯微鏡圖像中染料、抗 體、藥物或藥物前體等待測分子在多肽分子上的結合位點和吸附數量，并得到吸附常數的 相對關系。本發明至少具有以下有益效果本發明利用掃描隧道顯微鏡對染料、抗體、藥物或藥物前體等分子在多肽上的相 對吸附常數進行測定，能清楚地識別多肽分子二維組裝的方向性，并在此基礎上，通過加入 染料、抗體、藥物或藥物前體分子后得到分子在多肽上的結合位點和吸附數量，并由此得到 不同多肽對于分子的相對吸附能力，即分子在多肽上的相對吸附常數。本發明利用掃描隧道顯微技術，可在分子水平上研究藥物分子與蛋白質分子的相 互作用，藥物分子在蛋白分子上的作用位點和吸附能力，不受蛋白結晶性的影響，也不受結 合信號強弱的影響。本發明采用多肽分子與標記分子形成組裝體，或者采用多肽分子、標記分子以及 待測分子形成組裝體，可以除去溶劑在固/氣界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像，也 可保留溶劑在基底/溶液界面獲得組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像。本發明采用的高定向石墨具有原子級平整的表面，在很多環境中都很穩定，適于 掃描隧道顯微鏡的研究。本發明對于解析靶標蛋白與藥物相互作用的模式和結合本質具有 非常重要的意義。本發明可以用于在新藥早期研究階段中標靶的確定，不同序列蛋白對于藥物分子 的吸附能力等的測試。特別在治療神經退行性疾病中，研究淀粉樣蛋白的聚集機理及其與 藥物分子的相互作用機理，利用分子水平的證據來尋找可能的藥物靶點，從而對尋找和設 計有效的調節劑分子、藥物分子等提供指導。


圖1是三個模型多肽，五聚丙氨酸(5Ala)、八聚苯丙氨酸(SWie)和八聚組氨酸 (SHis)與4，4’ -聯吡啶分子GBpy)的共同組裝體的掃描隧道顯微鏡圖像；圖2是染料分子磺酸基酞菁在三種多肽-標記分子組裝體上吸附的掃描隧道顯微 鏡圖像，其中，A和B表示在5Ala-4Bpy組裝體中，C和D表示在8Wie_4Bpy組裝體中，E表 示在8His-4Bpy組裝體中；圖3是從圖1和圖2的掃描隧道顯微鏡圖像中統計得到的染料分子磺酸基酞菁在 三種組裝體中的吸附數量；圖4是三種多肽組裝體對于染料分子磺酸基酞菁的不同吸附能力，即染料分子在 多肽分子上的相對吸附常數。將SPhe多肽分子對于染料分子的吸附能力歸一化為1時，SHis和5Ala多肽分子對于染料分子的吸附能力分別為10. 2和41. 8 ；圖5是藥物分子剛果紅在5Ala-4Bpy組裝體上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像；圖6是從圖5的掃描隧道顯微鏡圖像中統計得到的剛果紅在多肽和4Bpy上的吸 附數量；圖7是藥物前體分子ThT在5Ala-4Bpy組裝體上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細的描述。實施例1基于掃描隧道顯微鏡來測定染料分子在多肽上相對吸附常數1、所使用物質的化學結構多肽分子(5Ala、8Phe和8His)，吡啶類分子GBpy)和染料分子磺酸基酞菁的化學
結構，如下所示
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權利要求
1.一種測定待測分子在多肽分子上的相對吸附常數的方法，該方法包括如下步驟1)將多肽分子和標記分子進行組裝，獲得多肽分子與標記分子的組裝體的掃描隧道顯 微鏡圖像；2)將多肽分子、標記分子和待測分子進行組裝，形成組裝體，以獲得所述待測分子在多 肽分子和標記分子上吸附的掃描隧道顯微鏡圖像；3)對比步驟1)和步驟2)中獲得的掃描隧道顯微鏡圖像，統計待測分子吸附在多肽分 子以及標記分子上的吸附數量；4)將步驟幻獲得的待測分子在標記分子上的吸附數量歸一化為單位1，確定待測分子 在多肽分子上的相對吸附常數。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟1)中，所述組裝體的制備方法 包括如下步驟i)將所述多肽分子與所述標記分子充分混合，形成混合液； )將步驟i)得到的混合液滴加到導電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基底以 及硅等半導體基底表面，以形成組裝體。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟幻中，所述組裝體的制備方法 包括如下步驟i)將所述多肽分子、所述標記分子以及所述待測分子充分混合，形成混合液； )將步驟i)得到的混合液滴加到導電性基底，例如石墨，金、銀、銅、鉬等金屬基底以 及硅等半導體基底表面，以形成組裝體。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步驟i)中，采用超聲來充分混I=I ο
5.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步驟ii)中，所述導電性基底 為石墨，所述石墨優選為新解理的高定向石墨。
6.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步驟ii)中，還包括除去所述 基底表面殘留液的步驟，優選地，采用吹惰性氣體，例如氮氣的方式來除去所述基底表面的 殘留液。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測分子為染料、抗體、藥物或藥物 前體分子。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述染料為酞菁、嚇啉類分子及其衍生 物，剛果紅、硫磺素、姜黃素及其衍生物；所述抗體為淀粉質多肽分子抗體；所述藥物為吡 啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯等氮雜環類分子及其衍生物，例如4’ 4-聯吡啶，乙烯吡啶，三吡 啶，剛果紅，姜黃素；所述藥物前體為硫磺素。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽分子包括五聚丙氨酸、八聚苯丙 氨酸、八聚組氨酸、beta淀粉樣多肽及其片段、胰淀素多肽及其片段、prion片段多肽、寡聚 多肽、嵌段寡聚多肽和人工序列多肽，優選地，所述多肽分子為五聚丙氨酸、八聚苯丙氨酸 和八聚組氨酸。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標記分子為吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、 吡咯類氮雜環分子及其衍生物，例如4’ 4-聯吡啶、乙烯吡唆，三吡啶、嘧啶等，優選地，所述 標記分子為4’ 4-聯吡啶。
全文摘要
本發明涉及一種利用掃描隧道顯微技術來測定染料、抗體、藥物和藥物前體等待測分子在多肽分子上的相對吸附常數的新方法。該方法涉及如下過程獲得多肽分子自組裝結構的STM圖像之后，或通過與標記分子的共吸附獲得多肽-標記分子的共組裝結構的STM圖像之后，加入染料、抗體、藥物和藥物前體等待測分子，得到待測分子在多肽上的結合位點和吸附數量，并在分子水平上研究多肽和待測分子的相互作用，測定待測分子在多肽上相對吸附常數的方法。本發明的方法對于解析靶標蛋白與藥物的相互作用的模式和結合本質具有非常重要的意義。
文檔編號G01N13/00GK102062718SQ20091023816
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者楊延蓮, 毛曉波, 王琛 申請人:國家納米科學中心