專利名稱：：一種纖維蛋白封閉劑的質量控制方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物藥品或器械質量分析方法，具體是涉及一種測定以豬血為原料制備的纖維蛋白封閉劑中豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白的含量的方法，屬生物
技術領域：
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背景技術：
：纖維蛋白封閉劑(Fibrinsealant,FS)即纖維蛋白膠(FibrinGlue,簡稱FG)也叫生物膠，是一種生物蛋白制劑，最早應用于傷口止血。1909年Bergel首次報道了纖維蛋白粉的止血功能。以后纖蛋白封閉劑被廣泛地在臨床上使用，不僅用于出血控制，而且用于各種手術場合的手術室輔助物。近20年來，纖維蛋白膠逐漸應用于促進傷口愈合、封閉組織缺損、防止組織粘連,尤其作為某些藥物的緩釋載體,其作用日益受到人們重視。隨著研究的深入，其作用機制也逐步被人們認識。FS是模擬人體自身凝血反應最后階段，其成分組成及作用原理現今生產的纖維蛋白封閉劑，含A、B兩種蛋白組份，組份A:包括纖維蛋白封閉劑主體膠及主體膠溶解液兩部分，主要含高濃度的纖維蛋白原、白蛋白、凝血因子XIII;組份B則包括纖維蛋白封閉劑催化劑及催化劑溶解液，主要含白蛋白、凝血酶原和氯化鈣。當B試劑的溶解液和催化劑混合后，Ca2+便將凝血酶原激活轉化為凝血酶，凝血酶能水解纖維蛋白原，使之轉化為纖維蛋白單體。單體由于負電荷減少，自發聚合成不穩定的可溶性纖維蛋白多聚體。同時，在Ca2+存在的條件下,凝血酶能激活因子XIII。因子xm能催化某些肽鏈間的殘基共價結合,最后形成穩定的不溶性纖維蛋白多聚體。多聚體形成后，通過以下機理發揮止血、封閉、粘合作用(l)多聚體交織成網狀，能網住紅細胞及血小板，形成血凝塊，發揮止血作用；(2)不溶性纖維蛋白多聚體形成后,其機械強度顯著增強,可粘合組織及封閉缺損，同時能剌激毛細血管內皮細胞及成纖維細胞生長，并以纖維蛋白網為支架形成肉芽組織，從而促進傷口愈合；(3)纖維蛋白膠在創面形成的膜狀凝膠能防止壞死組織細胞內溶酶體酶向細胞外泄漏,避免周圍組織進一步受損，同時因減少創面出血，減輕機化程度,能防止組織粘連。此外，纖維蛋白膠還具有緩釋作用的特性，可用纖維蛋白膠對藥物進行緩釋作用。纖維蛋白膠是模擬人體自身凝血反應最后階段形成具有穩定三維結構的纖維蛋白多聚體，其三維網狀結構也提供了較大的承載藥物的表面積，其網眼間隙使藥物按一定速率恒定釋放,其吸收時間大約在2周左右，提供了足夠長的藥物局部支持時間,提高局部藥物濃度，減少進入血液循環的藥量。纖維蛋白封閉劑是一種從血液中提取的新型生物止血材料。目前，國外同類產品以人血為原料，本申請人首創開發出以豬血為原料的產品，避免了人血制品所帶來的艾滋病、肝炎等血液傳染病傳播的危險。同時豬血資源豐富，豬的基因序列同人的基因序列極為相似，而攜帶人類的傳染性疾病傳播風險極小，極大的降低了成本，使產品具有很強的市場競爭力。但纖維蛋白封閉劑為蛋白質、多肽及無機鹽組成，而該類產品目前質量控制在蛋白含量及純度等技術指標方面水平較低，產品的蛋白含量多為以總氮量測定來反映總蛋白含量，對具體蛋白分子的含量不清楚，產品缺乏較為準確的量化數據。
發明內容本發明的目的在于提供一種新的纖維蛋體膠白封閉劑制劑的有效成分的含量測定方法。本發明的目的通過以下技術方案來實現的一種纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，是通過高效液相色譜法測定纖維蛋白封閉劑的主體膠制劑、催化劑制劑中豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白的含量。上述方法包括以下步驟進行一、供試品溶液的制備(l)纖維蛋白封閉劑的主體膠制劑供試品溶液的制備取580mg纖維蛋白封閉劑主體膠制劑，以每1mg加0.12.0ml量流動相溶解并定溶，搖勻即得；(2)纖維蛋白封閉劑催化劑供試品溶液的制備取360mg纖維蛋白封閉劑催化劑制劑，以每lmg加O.12.0ml量流動相溶解并定溶，搖勻，即得；二、對照品溶液的制備取豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白對照品，加流動相溶解并定溶，搖勻，配成每lml分別含0.32.Omg、0.11.5mg的豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白或每lml含0.32.Omg的豬血纖維蛋白原或每lml含0.11.5mg的豬血白蛋白的溶液為對照品溶液；三、測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，計算，即得主體膠制劑、催化劑制劑中豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白的含量。所述的高效液相色譜測定法中色譜條件為以二醇鍵合相硅膠為填充劑；理論板數按豬血纖維蛋白原或豬血白蛋白峰計算，均不低于2000;以紫外光200-280nm檢測，或差示折光率檢測器檢測；柱溫為2040。C，流動相的流速0.21.0ml/min，最佳柱溫25°C,最佳流動相的流速0.4ml/min。所述的步驟一至三中，流動相采用磷酸鹽水溶液或磷酸鹽緩沖水溶液，以20raraol/L磷酸鈉水溶液作流動相為最佳條件。由上述方法確定得到每lg纖維蛋白封閉劑主體膠制劑中豬血纖維蛋白原與豬血白蛋白的標準含量分別為195.88416.33mg、84.24103.38mg;每lg纖維蛋白封閉劑催化劑制劑中豬血白蛋白的標準含量為225.82432.21mg。含量低于此標準含量的產品，在其他性狀方面會出現質量問題。本發明的有益效果該含量測定方法能準確的測定原料、中間品、半成品及成品中的豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白的含量或二者之一的含量，可作為該產品質量控制的方法和依據，方法簡便，可操作性強，重現性高，是控制纖維蛋白封閉劑主體膠與催化劑質量的有效方法。圖l是豬纖維蛋白原、豬血白蛋白對照品HPLC色譜圖2是生物纖維蛋白膠主體膠HPLC色譜圖；圖3是豬血白蛋白對照品HPLC色譜圖；圖4是生物纖維蛋白膠催化劑HPLC色譜圖。具體實施例方式為了更加有效地控產品質量，本發明是對以豬血為原料制備的纖維蛋白封閉劑產品，用高效液相色譜法對產品中含量較高的成分豬血纖維蛋白原與豬血白蛋白的含量進行了測定研究，并且建立含量測定方法，用于控制產品質量。有關生物纖維蛋白封閉劑的質量研究報導不多，特別是用高效液相色譜法測定豬血為原料的纖維蛋白封閉劑中蛋白類成分的含量未見報導。為了有效地控制纖維蛋白封閉劑質量，本發明對纖維蛋白封閉劑中蛋白類成分的含量的HPLC測定方法進行了研究，并制定了其含量范圍。豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白是纖維蛋白封閉劑產品中含量較高的二種成分，特別是豬血纖維蛋白原的含量可直接影響產品的成膠性能。所以建立纖維蛋白封閉劑制劑中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白或其中之一的含量測定方法是控制其質量的一種有效方法。下面通過實施例進一步說明本發明的技術方案，但本發明并不限于此特定例子。實施例1高效液相色譜法測定纖維蛋白封閉劑的主體膠中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白含量的方法的研究(1)儀器與試藥儀器LC-IOAT高效液相色譜議(日本島津公司)；色譜柱Protein-Pak頂300SW分子排阻色譜柱(美國Waters公司)；SPD-10A紫外檢測器(日本島津公司)；試藥豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白對照品(廣州倍繡生物技術有限公司制備提供)，純度大于98%;蒸餾水(自制)，磷酸鈉(分析純，廣東光華化學廠有限公司)；纖維蛋白封閉劑主體膠，編號081101、081103、081115、081213，廣州倍繡生物技術有限公司制備提供，其它試劑均為分析純。(2)對照品溶液與供試品溶液的制備對照品溶液的制備精密稱取對照品豬血纖維蛋白原29.458mg、對照品豬血白蛋白9.825mg,置25ml的量瓶中，加流動相20nimol/L磷酸鈉的水溶液溶解并定溶至刻度，搖勻，0.48um濾膜濾過，取續濾液，即得對照品溶液。供試品溶液制備精密稱取50.421mg纖維蛋白封閉劑主體膠，置25ml的量瓶中，加流動相20mmol/L磷酸鈉的水溶液溶解并定溶至刻度，搖勻，0.48ym濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液；(3)色譜條件測定波長的選擇取含量分別為0.1%的豬血纖維蛋白原與豬血白蛋白對照品溶液，分別置紫外光譜儀中，在200400nm范圍內掃描，結果豬血纖維蛋白原與豬血白蛋白均在200280nm處有吸收，在220nm附近有較大吸收，考濾避免溶劑千擾作用，故選擇220nm作為最佳檢測波長。色譜柱Protein-Pak300SW，7.5X300mm，10ym(美國Waters公司)；流動相為20mraol/L磷酸鈉的水溶液；流速0.4ml/min;紫外光220nm檢測。圖l是豬纖維蛋白原、豬血白蛋白對照品HPLC色譜圖，其中A峰為豬血纖維蛋白原峰，B峰為豬血白蛋白峰；圖2是生物纖維蛋白膠主體膠HPLC色譜圖。(4)線性關系考察精密量取含豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白對照品溶液(1.178mg/ml、0.393mg/ml)，5、10、15、20、25ul,分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以進樣量(yg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果見表l。表l豬血纖維蛋白原線性關系實驗數據(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>A:Y=1848139.9X-2468082.5,R=0.9991B:Y=1300368.2X-161697.8，R=0.9996以上結果表明豬血纖維蛋白原在5.892Pg29.458ug范圍內、豬血白蛋白在1.965lig9.825ug范圍內，呈良好的線性關系。(5)精密度試驗精密吸取豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白對照品溶液(1.178mg/ml、0.393mg/ml)20yl，重復進樣6次，豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白峰面積值的RSD<2%，結果見表2。表2精密度試驗數據(n=6)試驗次數豬血纖維蛋白原平均值x豬血白蛋白平均值x537586654240973974546329648461RSD=0.09%RSD二O.32%試驗證明，精密度良好。(6)穩定性試驗取樣品供試液分別于0小時，1小時，4小時，8小時，12小時，24小時，分別進樣20ul，測得樣品中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白12小時內穩定，樣品中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白峰面積的RSD〈2M，結果見表3。表3穩定性試驗數據(n=6)測定時間豬血纖維蛋白原平均值X豬血白蛋白平均值X064597078585354005494055512387RSD=1.53%RSD=0.69%試驗結果表明，樣品供試液在12小時內穩定性良好。(7)重現性試驗照含量測定方法項下操作，對同一批樣品(批號081101)6份進行測定，求得豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白的RSD分別為0.20%、0.19%。見表4表4重現性試驗數據<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>24.492.5222.5885.139101.79試驗結果表明豬血纖維蛋白原回收率在99.47—104.20%之間、豬血白蛋白回收率在95.03—102.12%之間，加樣回收良好。(9)纖維蛋白封閉劑主體膠中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白含量測定照上述含量測定的方法操作，測定了3批纖維蛋白封閉劑主體膠中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白的含量，結果見表7。表7樣品中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白的含量測定結果(n=2)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>測得三批纖維蛋白封閉劑主體膠中每lg含豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白的含量分別在195.88416.33mg、84.24103.38mg之間。實施例2纖維蛋白封閉劑催化劑中豬血白蛋白的含量測定方法的研究(1)儀器與試藥儀器LC-IOAT高效液相色譜議(日本島津公司)；色譜柱Protein-PakTM300SW分子排阻色譜柱(美國Waters公司)；SPD-10A紫外檢測器(日本島津公司)；試藥豬血白蛋白對照品(廣州倍繡生物技術有限公司制備提供)，純度大于98%;蒸餾水(自制)，磷酸鈉(分析純，廣東光華化學廠有限公司)；纖維蛋白封閉劑催化劑，編號081101、081103、081115、081123、081213，廣州倍繡生物技術有限公司制備提供，其它試劑均為分析純。(2)對照品溶液與供試品溶液的制備-對照品溶液的制備精密稱取對照品豬血白蛋白12.288mg,置25ml的量瓶中，加流動相20mmol/L磷酸鈉的水溶液溶解并定溶至刻度，搖勻，0.48wm濾膜濾過，取續濾液，即得對照品溶液。供試品溶液制備精密稱取20.520mg纖維蛋白封閉劑催化劑，置25ml的量瓶中，加流動相20mmol/L磷酸鈉的水溶液溶解并定溶至刻度，搖勻，0.48um濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。(3)色譜條件測定波長的選擇取含量為0.1%的豬血白蛋白對照品溶液，置紫外光譜儀中，在200400nm范圍內掃描，結果豬血白蛋白在200280nm處有吸收，在220nm附近有較大吸收，考慮避免溶劑干擾作用，故選擇220mn作為最佳檢測波長。色譜柱Protein-Pak300SW，7.5X300面，10Pm(美國Waters公司)；流動相為20mmo1磷酸鈉的水溶液；紫外光220ran檢測；流速0.4ml/min。圖3是豬血白蛋白對照品HPLC色譜圖，B峰為豬血白蛋白峰；圖4是生物纖維蛋白膠催化劑HPLC色譜圖。(4)線性關系考察精密量取豬血白蛋白對照品溶液(0.4915mg/ml)，5、10、15、20、25nl，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以進樣量(wg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果見表8。表8豬血白蛋白線性關系實驗數據(n=5)豬血白蛋進樣量(Ug)2.4584.9157.3739.83012.288白峰面積295679253202852C:Y=1316056.4X-58345.4，R=0.9993以上結果表明豬血白蛋白在2.458ng12.288ug范圍內呈良好的線性關系。(5)精密度試驗精密吸取豬血白蛋白對照品溶液(0.4915mg/ml)20ul，重復進樣6次，豬血白蛋白峰面積值的RSD〈2M,結果見表9。表9精密度試驗數據(n=6)試驗次數豬血白蛋白平均值X28032883034584806329612798461RSD=0.33%試驗證明，精密度良好。(6)穩定性試驗:取樣品(081101)供試液分別于0小時，1小時，2小時，4小時，8小時，12小時，24小時，分別進樣20ul，測得樣品中豬血白蛋白12小時內穩定，豬血白蛋白峰面積的RSD〈2呢，結果見表IO。表10穩定性試驗數據(n=6)10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>20.496.9506.65313.46297.88試驗結果表明豬血白蛋白回收率在97.41—101.34%之間，加樣回收良好。(9)纖維蛋白封閉劑催化劑中豬血白蛋白含量測定照上述含量測定的方法操作，測定了3批纖維蛋白封閉劑催化劑中豬血白蛋白的含量，結果見表13。表13樣品中豬血白蛋白的含量測定結果(n=2)(mg/g)樣品0881123豬血白蛋白含量(mg/g)225.82432.21339.66測得三批纖維蛋白封閉劑催化劑中每lg含豬血白蛋白的含量在225.82432.21mg之間。實施例3纖維蛋白封閉劑主體膠中豬血纖維蛋白原含量測定用高效液相色譜法測定色譜條件用二醇鍵合相硅膠為填充劑；色譜柱Protein-Pak300SW，7.5X300mm，10um;柱溫25°C;流動相20咖ol/L磷酸鈉的水溶液；流速0.4ml/min，紫外光220nm檢測；理論板數按豬血纖維蛋白原峰計算，大于2000;對照品溶液的制備:取豬血纖維蛋白原對照品28.04mg,置25ml的量瓶中，加20mmol/L磷酸鈉的水溶液溶解并稀釋至刻度，0.48um濾膜濾過，取續濾液，制成每lml分別含1.122mg的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的制備精密稱取纖維蛋白封閉劑主體膠(批號081213)45.32mg，置25ml量瓶中，加流動相20mmol/L磷酸鈉的水溶液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，0.48nm濾膜濾過，取續濾液即得供試品溶液；測定結果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入高效液相色譜儀，測定，計算，即得。每lg纖維蛋白封閉劑主體膠中含豬血纖維蛋白原387.93mg。實施例4纖維蛋白封閉劑催化劑中豬血白蛋白含量測定色譜條件用二醇鍵合相硅膠為填充劑；色譜柱Protein-PakTM300SW，7.5X300mm，10nm;柱溫30。C;流動相20mraol/L磷酸鈉的水溶液；流速0.4ml/min，紫外光220nm檢測；理論板數按豬血纖維蛋白原峰計算，大于2000;對照品溶液的制備精密稱取豬血白蛋白對照品11.49mg，置25ml的量瓶中，加流12動相20Miiol/L磷酸鈉的水溶液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，0.48um濾膜濾過，取續濾液，即得每lml含0.460mg、的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的制備精密稱取纖維蛋白封閉劑催化劑(批號081213)12.72mg，置25ml量瓶中，加流動相流動相20mmol/L磷酸鈉的水溶液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，0.48ym濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液；測定結果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入高效液相色譜儀，測定，計算，即得。每lg纖維蛋白封閉劑催化劑中含豬血白蛋白347.57mg。權利要求1.一種纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是通過高效液相色譜法測定纖維蛋白封閉劑的主體膠制劑、催化劑制劑中豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白的含量。2.根據權利要求1纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是包括以下步驟-(一)供試品溶液的制備(1)纖維蛋白封閉劑的主體膠制劑供試品溶液的制備取纖維蛋白封閉劑主體膠制劑，以每lmg加O.12.0ml量流動相溶解并定溶，搖勻即得；(2)纖維蛋白封閉劑催化劑供試品溶液的制備取纖維蛋白封閉劑催化劑制劑，以每lmg加O.12.0ml量流動相溶解并定溶,搖勻，即得；(二)對照品溶液的制備取豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白對照品，加流動相溶解并定溶，搖勻，配成每lml分別含0.32.Omg、0.11.5mg的豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白或每lml含0.32.Omg的豬血纖維蛋白原或每lml含0.11.5呢的豬血白蛋白的溶液為對照品溶液；(三)測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，計算，即得主體膠制劑、催化劑制劑中豬血纖維蛋白原和/或豬血白蛋白的含量。3.根據權利要求2纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是所述步驟(三)的高效液相色譜測定法中，以二醇鍵合相硅膠為填充劑。4.根據權利要求2纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是所述步驟(三)的高效液相色譜測定法中，理論板數按豬血纖維蛋白原或豬血白蛋白峰計算，均不低于2000。5.根據權利要求2纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是所述步驟(三)的高效液相色譜測定法中，以紫外光200-280nm檢測，或差示折光率檢測器檢測。6.根據權利要求2纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是所述步驟(三)的高效液相色譜測定法中，柱溫為204(TC，流動相的流速0.21.0ml/min。7.根據權利要求2纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是所述的步驟(一)至(三)中，流動相采用磷酸鹽水溶液或磷酸鹽緩沖水溶液。8.根據權利要求1-7中任一權利要求所述的纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其特征是由上述方法測得每lg纖維蛋白封閉劑主體膠制劑中豬血纖維蛋白原與豬血白蛋白的標準含量分別為195.88416.33mg、84.24103.38mg;每lg纖維蛋白封閉劑催化劑制劑中豬血白蛋白的標準含量為225.82432.21mg。全文摘要本發明公開了一種纖維蛋白封閉劑的質量控制方法，其是用高效液相色譜法測定纖維蛋白封閉劑產品中豬血纖維蛋白原、豬血白蛋白或其中之一含量。本發明的含量測定方法可準確控制產品的質量，可操作性強，重現性高，特異性強。文檔編號G01N33/68GK101576538SQ20091004001公開日2009年11月11日申請日期2009年6月5日優先權日2009年6月5日發明者春向,李吉來,江彩霞,潘小寧,肖尚志,星黃申請人:廣州倍繡生物技術有限公司