專利名稱：肌酐診斷/測定試劑(盒)及肌酐濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種肌酐診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定肌酐濃度的方
法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
測定肌酐主要有化學測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細管電泳法 等。 化學測定法成本低廉，操作簡便，是目前國內測定肌酐最常用的方法之一。標本中 的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復合物。此法的缺點是特異性不高，維生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質和一些抗生素如青霉素G、頭孢 西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應生成紅色。 高效液相層析法(HPLC)，肌酐在弱酸性環境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱 可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法 不適于大批量臨床標本分析，通常作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試 劑盒和某些科研目的。檢索發現，申請號為90106198. 0、申請日為1990. 12. 18的中國專利 申請公開了用高效液相色譜直接測定人尿中假尿嘧啶核苷(簡稱假尿苷)，再通過分光光 度法同時測出肌酐，分別用假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標志物。(這個專利 和我們的無關) 毛細管電泳法，血清標本用高速離心作預處理，尿液標本可用低速離心，除去有形 成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操
作較為簡便，但需用特殊設備和進行血清標本的預處理，臨床常規使用困難。 酶學測定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)兩大類。 檢索發現，申請號為02139298. 6、申請日為2002. 11. 15的專利申請公開了應用 酶反應產物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發明所指的酶法測定試劑并不加入測 定反應所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應產物氧化型煙酰胺輔酶或其類 似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統，通過在試劑內形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反應系統，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環還原為還原型煙 酰胺輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發 明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發明的特點在于為丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨 基轉移酶試劑、尿素養試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內源合成 丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素養試劑、氨試劑、肌酐試劑和二 氧化碳試劑等反應所需要的底物-還原型煙酰胺輔酶。其缺點之一為，這個系統在生成反 應所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基 轉移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產生足夠的還原型煙酰氨輔酶， 這樣一來就造成了緩不濟急的結果，給測試帶來很大的不便。 據申請號為02139298. 6、申請日為2002. 11. 15的專利介紹，該系統由于不斷生成 測定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的穩定性，并大大降低試劑的生產成本。其 實在試劑中加入NADH或NADra的穩定劑已經不是困難或增加成本的問題，反而比在試劑中 增加一個反應系統要經濟得多。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定肌酐濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現 該方法的肌酐診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行肌酐濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推 廣應用。 本發明肌酐濃度測定方法如下 肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨 氨+2水+6高鐵細胞色素c亞硝酸還原酶/Ca21亞硝酸+ 6亞鐵細胞色素c 亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶 這種方法應用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶(偶) 聯亞石肖酸還原醇(nitrite reductase ;EC 1. 7. 2. 2)、石肖酸還原醇(nitrate reductase ; ECl. 7. 1. 1 ;EC 1. 7. 1. 2 ;EC 1. 7. 99. 4)酶促反應比色終點法。肌酐脫亞胺酶酶解肌酐反應 產生氨，再通過(偶)聯合亞硝酸還原酶、硝酸還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有 吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算肌酐的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明肌酐診斷/測定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩定劑500,1/L輔酶3mmol/L肌酐脫亞胺酶10000U/L亞硝酸還原酶12000U/L硝酸還原酶12000U/L高鐵細胞色素c12mmol/L氯化鈣5mmol/L本發明的肌酐診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣。 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
4直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩定劑、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。 輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣在試劑l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。
試劑3 緩沖液、穩定劑、肌酐脫亞胺酶。 輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定肌酐濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的肌酐診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
肌酐脫亞胺酶 10000U/L
亞硝酸還原酶 12000U/L
硝酸還原酶 12000U/L
高鐵細胞色素c 12mmol/L
氯化f丐 5mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。
實施例二 本實施例的肌酐診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
高鐵細胞色素c 12,1/L
氯化牽丐 5,1/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩定劑 50mmol/L 肌酐脫亞胺酶 10000U/L 亞硝酸還原酶 12000U/L 硝酸還原酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，
反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。實施例三本實施例的肌酐診斷/領lJ定試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩定劑50mmol/L輔酶3mmol/L高鐵細胞色素c12mmol/L氯化鈣5mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩定劑500,1/L亞硝酸還原酶12000U/L硝酸還原酶12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩定劑500,1/L肌酐脫亞胺酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定肌酐濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達1. 5mmol/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±4% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2% ;試劑的靈敏度可達O. 2±0. 1 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩定一年；——本發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種酶比色法及酶聯法的肌酐的濃度測定方法，其方法如下肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨氨+2水+6高鐵細胞色素c亞硝酸還原酶/Ca2+亞硝酸+6亞鐵細胞色素c亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出肌酐的濃度大小測定結果。
2. —種肌酐診斷 緩沖液 穩定劑 輔酶肌酐脫亞胺酶 亞硝酸還原酶 硝酸還原酶 高鐵細胞色素c 氯化f丐 1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。鈣離子是亞硝酸還原酶的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣組成；試劑 2，由緩沖液、穩定劑、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成。輔酶、肌酐脫亞胺酶、 亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣組成；試劑 2，由緩沖液、穩定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、肌酐脫亞 胺酶組成。輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的肌酐診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定肌酐濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、高鐵細胞色素c、氯化鈣、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101762499SQ200810235698
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司