專利名稱：定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法
定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法技術領域 本發明涉及定量測定中草藥提取成分中生化成分的方法，具體地說是一種定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法。
背景技術：
沙棘葉中含有總黃酮，目前據相關文獻報道，對于沙棘葉中總黃 酮的方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法及熒光分析法。經發明人的研究得知，沙棘葉中具有較高含量的雌二醇，這對應用沙棘葉 的提取物制作補充雌激素的藥品與保健品具有重大意義。那么，研究分析不同 產地、不同采摘季節、不同批次等沙棘葉的雌二醇含量，對沙棘葉的開發利用 具有重要意義。沙棘葉中含有較高量的雌二醇，是發明人的發現，目前，尚處于未公知狀 態，人們對沙棘葉的分析還處在對總黃酮的分析階段，沒有深入到分析沙棘葉 中雌二醇的含量階段。雌二醇定量測定試劑盒(磁分離酶聯免疫法)，用于定量測定人血清和血漿 中雌二醇的含量。磁分離酶聯免疫法是酶聯免疫系統與磁性微粒分離技術相結 合的一種測定法，并使用一種高親和力的多克隆抗體。標本、質控品和標準品中的E2與限量的熒光素標多克隆抗體結合，隨后加入定量的酶標E2衍生物與E2競爭結合；直接測定總E2的含量。雌二醇定量測定試劑盒的批準文號為國藥準字S20060022。截止目前，還沒有發現將磁分離酶聯免疫法用于測量中草藥中的雌二醇含量的相關報導。發明人成功地應用雌二醇定量測定試劑盒說明書所提供的方法，將磁分離 酶聯免疫法用于測量中草藥中的雌二醇含量。
發明內容
本發明的目的在于提供一種測量數據準確、操作簡便易行的定量 測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法。定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法，應用雌二醇定量測定 試劑盒所提供的試劑，使用該試劑盒的使用說明書所提供磁分離酶聯免疫法，4其特征是將植物中草藥提取液作為標本，按該試劑盒的使用說明書的步驟進 行操作。具體按下述三步驟a、第一次孵育一免疫反應，b、第二次孵育一酶反應， C、讀取吸光值；a、 第一次孵育一免疫反應a. 1、吸取45ul各濃度標準品、質控品、標本，加之標記好的相應試管的底部；a.2、加60ulE2抗試劑至各試管，混勻；a.3、試管連架置37。C水浴20分鐘；a.4、加60ul E2衍生物至各試管，混勻；a.5、試管連架置37。C水浴20分鐘；a.6、加60ul磁分離試劑至各試管，混勻；a.7、試管連架置37'C水浴5分鐘；a.8、試管連架放入磁分離器，磁場中沉淀2分鐘，確保每支試管底部都與分離 器表面接觸；a.9、用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管放在濾 紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； a. 10、放正分離器，加150ul稀釋后的清洗液至各試管； a. 11、放至渦旋機，激烈振蕩，徹底混勻；a. 12、試管連架放人磁分離器，磁場中沉淀2分鐘；確保每支試管底部都與分 離器表面接觸；a.13、用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管放在 濾紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a. 14、重復a. lO — a. 13步驟兩次；b、 第二次孵育一酶反應b. 1、為磁分離免疫測定儀校零，準備l支空白試管，做好標記，放置試管架上; b.2、從分離器取出試管架，加90ul基質至各試管，包括空白管；徹底混勻； b.3、試管連架置37。C水浴30分鐘；b.4、加300ul終止液至各試管，包括空白管，其順序與加基質順序相同；b.5、把試管架放人磁分離器，沉淀時間不少于10分鐘； C、讀取吸光值用空白管在550nm校零；在550nm、 492nm讀取標準品、質控品、標本的吸 光值。本發明是將現有的用于定量測定人血清和血漿中雌二醇含量的雌二醇定量 測定試劑盒用于定量測定植物中草藥提取成分中的雌二醇含量，只要將植物中 草藥提取成分作為被測標本即可，操作步驟中所應用的E2抗試劑、E2衍生物、 E2標準品、磁分離試劑、稀釋清洗液、基質、終止液、質控品、標準品由雌二 醇定量測定試劑盒提供，其中稀釋清洗液由使用者將雌二醇定量測定試劑盒提 供的濃縮清洗液稀釋，得稀釋清洗液。依據各被測中草藥中所含有的雌二醇量的不同，被測標本是用水提法或是 其它提取方法所提取的中草藥汁液、或濃縮汁、或濃縮汁制作400倍稀釋液、 200倍稀釋液、IOO倍等稀釋液。本發明用于測取植物中草藥提取成分中的雌二醇含量，對指導植物中草藥 的開發利用具有重要意義。目前已知葛根提取物中含有較高量的雌二醇，發明 人發現沙棘葉提取物中含有高量的雌二醇。所以本發明尤其適用于測取沙棘葉 提取物、葛根提取物中的雌二醇含量，對研究分析不同產地、不同采摘季節、 不同批次等沙棘葉、葛根的雌二醇含量，指導沙棘葉、葛根作為補充雌激素產 品的開發利用具有重要意義。
具體實施方式
各實施例所使用的雌二醇定量測定試劑盒通過商業途徑得到、由北京倍愛康生物技術有限公司生產。實施例l1、 準備沙棘葉提取物將8月中旬采集的沙棘葉陰晾干，加水清洗干凈去除粉塵，烘干，粉碎80目，稱取10克用水提法提取汁液，濃縮至20ml得沙棘 葉提取物，備用。2、 將上述沙棘葉提取物制作400倍稀釋液、200倍稀釋液、IOO倍稀釋液。3、 應用雌二醇定量測定試劑盒所提供的試劑，將沙棘葉提取物的400倍稀 釋液、200倍稀釋液、IOO倍稀釋液作為標本，按該試劑盒的使用說明書的步進行操作；a、 第一次孵育一免疫反應a. 1、吸取45ul各濃度標準品、質控品、標本，加之標記好的相應試管的底部；a. 2、加60ulE2抗試劑至各試管，混勻；a.3、試管連架置37。C水浴20分鐘；a.4、加60ul E2衍生物至各試管，混勻；a.5、試管連架置37。C水浴20分鐘；a.6、加60ul磁分離試劑至各試管，混勻；a. 7、試管連架置37。C水浴5分鐘；a.8、試管連架放入磁分離器，磁場中沉淀2分鐘，確保每支試管底部都與分離 器表面接觸；a.9、用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管放在濾 紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； a. 10、放正分離器，加150ul稀釋后的清洗液至各試管； a. 11、放至渦旋機，激烈振蕩，徹底混勻；a. 12、試管連架放人磁分離器，磁場中沉淀2分鐘；確保每支試管底部都與分 離器表面接觸；a. 13、用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管放在 濾紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a. 14、重復a. 10—a. 13步驟兩次；b、 第二次孵育一酶反應b. 1、為磁分離免疫測定儀校零，準備l支空白試管，做好標記，放置試管架上； b.2、從分離器取出試管架，加90ul基質至各試管，包括空白管；徹底混勻； b.3、試管連架置37。C水浴30分鐘；b.4、加300ul終止液至各試管，包括空白管，其順序與加基質順序相同；b.5、把試管架放人磁分離器，沉淀時間不少于10分鐘；c、 讀取吸光值用空白管在550nm校零；在550nm、 492nm讀取標準品、質控品、標本的吸光值。沙棘葉提取物的400倍稀釋液、200倍稀釋液、IOO倍稀釋液的雌二醇含 量見表l。表1沙棘葉提取物的400倍稀釋液、200倍稀釋液、100倍稀釋液的雌二醇含量沙棘葉提取物稀釋倍數測定值(雌二醇pg/ml)100倍392.5200倍127.8400倍87. 47實施例21、 準備葛根提取物葛根加水清洗干凈去除粉塵，烘干，粉碎80目，稱取10克用水提法提取汁液，濃縮至20ml得葛根提取物，備用。2、 將上述葛根提取物制作400倍稀釋液、200倍稀釋液、IOO倍稀釋液。3、 標本是葛根提取物的400倍稀釋液、200倍稀釋液、100倍稀釋液，其它同實施例1。表2葛根提取物的400倍稀釋液、200倍稀釋液、100倍稀釋液的雌二醇含量沙棘葉提取物稀釋倍數測定值(雌二醇pg/ml)10061.8420047. 5840038.51實施例31、 準備益木草提取物加水清洗干凈去除粉塵，烘干，粉碎80目，稱取IO克用水提法提取汁液，濃縮至20ml ，得益木草提取物，備用。2、 應用雌二醇定量測定試劑盒所提供的試劑，將益木草提取物作為標本， 按該試劑盒的使用說明書的步驟進行操作；檢測雌二醇，結果56 Pg/ml。 實施例41、準備甘草提取物加水清洗干凈去除粉塵，烘干，粉碎80目，稱取IO8克用水提法提取汁液，濃縮至20ml ，得甘草提取物，備用。2、應用雌二醇定量測定試劑盒所提供的試劑，將甘草提取物作為標本，按 該試劑盒的使用說明書的步驟進行操作；檢測雌二醇，結果2. 1 Pg/ml 實施例51、準備虎杖提取物加水清洗干凈去除粉塵，烘干，粉碎80目，稱取IO克用水提法提取汁液，濃縮至20ml ，得虎杖提取物，備用。2、應用雌二醇定量測定試劑盒所提供的試劑，將虎杖提取物作為標本，按該試劑盒的使用說明書的步驟進行操作；檢測雌二醇，結果0.46Pg/ml
權利要求
1、定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法，應用雌二醇定量測定試劑盒所提供的試劑，使用該試劑盒的使用說明書所提供磁分離酶聯免疫法，其特征是將植物中草藥提取液作為標本，按該試劑盒的使用說明書的步驟進行操作；具體按下述三步驟a、第一次孵育-免疫反應，b、第二次孵育-酶反應，c、讀取吸光值；a、第一次孵育-免疫反應a.1、吸取45ul各濃度標準品、質控品、標本，加之標記好的相應試管的底部；a.2、加60ulE2抗試劑至各試管，混勻；a.3、試管連架置37℃水浴20分鐘；a.4、加60ul E2衍生物至各試管，混勻；a.5、試管連架置37℃水浴20分鐘；a.6、加60ul磁分離試劑至各試管，混勻；a.7、試管連架置37℃水浴5分鐘；a.8、試管連架放入磁分離器，磁場中沉淀2分鐘，確保每支試管底部都與分離器表面接觸；a.9、用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管放在濾紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a.10、放正分離器，加150ul稀釋后的清洗液至各試管；a.11、放至渦旋機，激烈振蕩，徹底混勻；a.12、試管連架放人磁分離器，磁場中沉淀2分鐘；確保每支試管底部都與分離器表面接觸；a.13、用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管放在濾紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；a.14、重復a.10-a.13步驟兩次；b、第二次孵育-酶反應b.1、為磁分離免疫測定儀校零，準備1支空白試管，做好標記，放置試管架上；b.2、從分離器取出試管架，加90ul基質至各試管，包括空白管；徹底混勻；b.3、試管連架置37℃水浴30分鐘；b.4、加300ul終止液至各試管，包括空白管，其順序與加基質順序相同；b.5、把試管架放人磁分離器，沉淀時間不少于10分鐘；c、讀取吸光值用空白管在550nm校零；在550nm、492nm讀取標準品、質控品、標本的吸光值。
2、 根據權利要求1所述的定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法，其特征是植物中草藥提取液是沙棘葉提取物。
3、 根據權利要求1所述的定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法，其特征是植物中草藥提取液是葛根提取物。
全文摘要
本發明涉及定量測定中草藥提取成分中生化成分的方法，具體地說是一種定量測定植物中草藥提取成分中雌二醇含量的方法。該方法應用雌二醇定量測定試劑盒所提供的試劑，使用該試劑盒的使用說明書所提供磁分離酶聯免疫法，其特征是將植物中草藥提取液作為標本，按該試劑盒的使用說明書的步驟進行操作。本發明尤其適用于測取沙棘葉提取物、葛根提取物中的雌二醇含量，對研究分析不同產地、不同采摘季節、不同批次等沙棘葉、葛根的雌二醇含量，指導沙棘葉、葛根作為補充雌激素產品的開發利用具有重要意義。
文檔編號G01N21/25GK101592668SQ200810110028
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月31日 優先權日2008年5月31日
發明者劉秀梅 申請人:劉秀梅