專利名稱：提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液的制作方法
技術領域：
本發明涉及環境樣品免疫檢測技術領域中一種提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液。
背景技術：
基質(Matrix)是指一種分析物(Analyte)的環境(Milieu)，即指樣品中除了目標分析物以外的一切成份及其物理、化學性質(例如粘度、pH、溫度等)。
基質效應(Matrix Effect)在醫學上按臨床及實驗室標準化組織的定義是指(1)樣品中除分析物以外的其他成份對分析物測定值的影響；(2)基質對分析方法準確測定分析物的能力的干擾。
環境樣品中的各種基質與其它樣本中(如醫學上的血液樣品)的基質有著較大的不同，這是環境樣品免疫檢測技術非常重要的特點之一。為了能實現對水樣進行直接的免疫檢測，減少或省略預處理步驟，因此，有必要考察水中的各種基質對免疫檢測的影響，做出全面的評價，并對不利的影響和干擾提出解決方案，以保證免疫檢測的穩定性、重復性和可靠性。
目前，環境樣品的免疫檢測研究中，有關環境樣品中復雜基質對免疫檢測的干擾規律以及對干擾的消除方法等尚未開展起來。而這些對保證免疫檢測的穩定性、重復性和可靠性十分關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液。
本發明所提供的緩沖溶液，是在現有的濃度為0.05-0.12mol/L、pH為7.0-8.0的緩沖液中，加入下述a)、b)和c)的物質a)NaCl，使其終濃度為10-100g/L；b)惰性蛋白或明膠，使其終濃度為2-20g/L；所述惰性蛋白是不與免疫反應體系發生反應的蛋白；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2-20g/L。
所述現有的緩沖液具體可為磷酸鹽緩沖液。
所述惰性蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白和兔血清白蛋白。
其中，所述NaCl的濃度優選為50g/L。
所述惰性蛋白或明膠的濃度優選為10g/L。
所述乙二胺四乙酸二鈉的濃度優選為5g/L。
本發明所提供的提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法，是在環境樣品免疫檢測中，將上述任一種環境樣品免疫檢測專用緩沖溶液作為緩沖體系，進行境樣品的免疫檢測。
本發明的提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液可用于各種環境樣品(如水樣)的免疫檢測中，可有效地減小或消除來自環境樣品(如水樣)中各種復雜基質在其自然界存在的邊界范圍內給免疫檢測帶來的干擾，使實際環境樣品免疫檢測的穩定性增強。
本發明的提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液能應用在環境樣品各種免疫檢測技術上，包括環境樣品的酶聯免疫吸附試驗試劑盒(ELISAkit)、環境樣品膠體金試紙檢測、環境樣品免疫傳感器/抗體芯片(免疫芯片，抗體陣列)等檢測技術方面，能顯著提高上述免疫檢測技術的穩定性和一致性。


圖1為添加普通緩沖液的不同pH值條件下的ELISA標準曲線圖2為圖1標準曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖3為添加專用緩沖液1的不同pH值條件下的ELISA標準曲線圖4為圖3標準曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖5為添加普通緩沖液的不同硬度下的ELISA標準曲線圖6為圖5標準曲線的最大吸光度A0和ICX50的比較圖7為添加專用緩沖液1的不同硬度下的ELISA標準曲線圖8為圖7標準曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖9為添加普通緩沖液的不同腐殖酸濃度下的ELISA標準曲線圖10為圖10標準曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖11為添加專用緩沖液1的不同腐殖酸濃度下的ELISA標準曲線圖12為圖11標準曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖13為添加普通緩沖液的不同CuSO4濃度下ELISA標準曲線圖14為添加普通緩沖液的不同CuSO4濃度下A0和IC50值的變化圖15為添加專用緩沖液1的不同CuSO4濃度下ELISA標準曲線圖16為添加專用緩沖液1的不同CuSO4濃度下A0和IC50值的變化圖17為添加專用緩沖液1的不同COD濃度下的ELISA標準曲線圖18為添加專用緩沖液1的不同COD濃度下A0和IC50值的變化圖19為添加專用緩沖液1的不同葉綠素a濃度下的ELISA標準曲線圖20為添加專用緩沖液1的不同葉綠素a濃度下A0和IC50值的變化圖21為添加普通緩沖液的不同甲醇濃度下的ELISA標準曲線圖22為添加普通緩沖液的不同甲醇濃度下A0和IC50值的變化圖23為添加專用緩沖液1的不同甲醇濃度下的ELISA標準曲線圖24為添加專用緩沖液1的不同甲醇濃度下A0和IC50值的變化圖25為添加專用緩沖液1的不同甲苯濃度下的ELISA標準曲線圖26為添加專用緩沖液1的不同甲苯濃度下A0和IC50值的變化圖27為添加專用緩沖液1的不同2，4-D濃度下的ELISA標準曲線圖28為添加專用緩沖液1的不同2，，4-D濃度下A0和IC50值的變化圖29為添加專用緩沖液2的不同pH值條件下ELISA標準曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖30為添加專用緩沖液2的不同硬度條件下ELISA標準曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖31為添加專用緩沖液2的不同腐殖質酸濃度下ELISA標準曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖32為添加專用緩沖液3的不同pH值條件下ELISA標準曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖33為添加專用緩沖液3的不同硬度條件下ELISA標準曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖34為添加專用緩沖液3的不同腐殖質酸濃度下ELISA標準曲線最大吸光度A0和IC50的比較具體實施方式
本發明通過全面分析和系統考察環境中的各種基質對免疫檢測的影響，提出一種免疫檢測反應過程中的緩沖體系。具體方法如下首先將環境樣中有代表性的基質進行分類，以免疫檢測為基礎，綜合分析了各類基質對免疫檢測的影響規律及機理，并提出了相應的干擾減小或消除方案。本發明實驗中選取的可能影響抗體性質或影響抗原抗體反應的代表性基質包括以下幾類(1)水中的環境條件干擾因素pH值、硬度和無機鹽濃度；(2)水體綜合污染指標選取生活污水作為干擾基質；(3)富營養化水體中普遍存在的物質腐殖酸和葉綠素a；(4)水中可能存在的有毒污染物選取甲苯作為有機干擾基質、選取2，4-D作為農藥類干擾基質、選取銅離子作為重金屬干擾基質。
(5)樣品提取或濃縮過程、以及免疫檢測過程可能引入的有機溶劑甲醇、乙酸和表面活性劑。
考察環境樣品中基質效應對免疫檢測的干擾，并提出抗干擾解決方案，基本步驟如下(1)研究上述各基質在不同濃度條件下對免疫檢測的影響規律。即比較干擾基質不同濃度條件下對免疫檢測標準曲線的變化，觀察標準曲線受不同濃度基質影響變化的趨勢和程度，通過對比，定性描述各包括標準曲線的高低、旋轉及偏移等在內的影響規律；同時定量的評價各干擾基質對免疫檢測最低檢測能力和定量檢測區間的影響。
(3)通過配制相應的緩沖溶液用作反應稀釋液，并在稀釋液中添加不同的抗干擾物質來減小或消除這些不利的干擾因素。并重新進行標準曲線的測定，同時評價對不利干擾因素的抑制效果。
(4)最后評價在稀釋液中添加的抗干擾物質本身對免疫檢測的影響。在系統考慮各基質的影響規律及消除方法的基礎上，得出本發明的環境樣品免疫檢測專用緩沖溶液。
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
骨髓瘤細胞SP2/0種子來源于中國協和醫科大學基礎醫學院細胞中心。6周齡的Balb/c純系雌性小鼠購自中國協和醫科大學實驗動物中心。新生牛血清(PAA，LotB00104-0786)，細胞融合用PEG 1500(Roche，11423800)，50×HAT儲液(Sigma，H0262，Lot 093K8931)，50×HT儲液(Sigma H0137，Lot 064K8927)，IMDM培養基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036)，氨芐青霉素鈉(Amresco 0339)，硫酸鏈霉素(Amresco 0382)，8-Azaguanine(Sigma A5284)，DMSO(Amresco 0231)，石蠟油，無水乙醚、異丙醇(北京化學試劑公司)。MC-LR(Alexis公司(Lausen，Switzerland)，產品編號ALX-350-012)。BSA(Sigma，A7638)。OVA(Sigma，A5378)。
實施例1、抗微囊藻毒素-LR的單克隆抗體MC8C10的獲得一、雜交瘤細胞株MC8C10 CGMCC No.2101的獲得1、微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA的合成將微囊藻毒素-LR采用2-巰基乙胺進行化學修飾，在其第七位氨基酸(Mdha)上引入一個活性基團——氨基，再采用戊二醛法將修飾后的微囊藻毒素-LR(MC-LR)與牛血清白蛋白偶聯，經過濾層析后得到完全抗原，經MALDI-TOF/MS確定完全抗原的偶聯比。具體方法如下(1)對微囊藻毒素-LR進行氨基修飾①將2-巰基乙胺和MC-LR按照摩爾比3000∶1充分混和在堿性的碳酸鹽緩沖液中(pH＝8.0)；混合物充分搖勻，在50℃反應1.5小時；②反應完畢，降到室溫，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應停止；③中間產物的純化采用固相萃取技術，得到經氨基修飾的微囊藻毒素-LR。材料為500mg 6mL C18BondElut cartridge(Varian，Walnut Creek，CA)，具體步驟如下
活化用4mL甲醇活化，并用6mL高純水調整，分為2-3次使用；上樣將水樣以5-10mL/min的流速流過固相萃取柱進行富集濃縮。重力過濾；淋洗裝樣完畢后，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以凈化樣品，分為3次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，以4mL甲醇(分為2次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
(2)半抗原多肽與載體蛋白偶聯選擇牛血清白蛋白(BSA)作為載體蛋白，采用戊二醛法將步驟(1)獲得的經氨基修飾的微囊藻毒素-LR與載體蛋白進行偶聯，具體方法包括以下步驟(a)取10mg BSA(1.5×10-7摩爾)，完全溶解于5mL 0.01mol/L PBS(Na2HPO4·12H2O 2.96g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g加水至1000mL，pH7.2)中，再加入4mg步驟(1)獲得的經氨基修飾的微囊藻毒素-LR(4×10-6摩爾)，使其完全溶解；(b)緩慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，與步驟(a)獲得的溶液混合，并在室溫下，攪拌反應2小時；(c)加入0.2mL 1M甘氨酸，在室溫下攪拌1小時，以終止反應；(d)將步驟(c)獲得的溶液用Sephadex G-25凝膠層析柱(Pharmacia)進行過濾層析，得到微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA。MALDI-TOF/MS檢測，結果表明該完全抗原的偶聯比為5.12，符合要求。將純化的完全抗原經-40℃冷凍后，真空濃縮干燥，保存于-20℃冰箱中。
2、免疫動物選取6周齡的雌性Balb/c小鼠，采用低劑量長程免疫法進行免疫，方法為皮下多點注射，30μg MC-LR-BSA/只，共免疫4次，初次免疫加福氏完全佐劑(0.1mL/只)，后三次加強免疫加福氏不完全佐劑(0.1mL/只)，免疫間隔時間為30天。在第三次加強免疫后的第10天，對小鼠進行尾部靜脈取血，用間接ELISA法測定效價，其中，包被的MC-LR-BSA的濃度為5μg/mL。對抗血清效價達到1×105以上的小鼠，進行一次沖擊免疫，即每只小鼠采用10μl MC-LR-BSA+90μl生理鹽水進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行細胞融合。
3、細胞融合1)免疫脾細胞的制備將步驟2沖擊免疫三天后的BALB/c小鼠處死，無菌狀態下取出脾臟，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加GKN溶液(NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000mL水中)制成單細胞懸液，用200目銅網過濾，去除大的細胞團塊后，離心，用GKN溶液洗滌并重懸脾細胞，計活細胞數，約為1×108個/mL。
2)SP2/0骨髓瘤細胞的處理取指數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞，離心，用GKN溶液洗一次并懸浮于其中，計活細胞數，為1×108個/mL。
3)免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合將步驟2)的SP2/0骨髓瘤細胞與步驟1)的免疫脾細胞融合，具體過程包括以下步驟1.聚乙二醇(PEG)的配制(50％PEG)PE6(MW1500，Roche，11423800)10.0g置于30mL容量小燒瓶中，高壓3.6×105Pa 15min，冷卻至50℃后加入完全培養基(IMDM培養基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036))10.0mL，混勻，分裝1.0mL/管，4℃保存。
2.取HAT培養液40mL(50×HAT儲液，Sigma，H0262，Lot 093K8931)，完全培養液(IMDM培養基)15mL和50％PEG分別放入37℃水浴箱中預熱，另將一只盛水的燒杯同時放入水浴箱中備用。
3.分別吸取含7.0×107個骨髓瘤細胞SP2/0和7.0×108個脾細胞的懸液加入50mL離心管中，充分混勻，并加IMDM培養基至40mL。
4.1200rpm離心8min，棄去上清液，用吸管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使兩種細胞充分混勻，直至成糊狀。
5.將離心管置于預溫的燒杯中，用1mL已用7.5％NaHCO3調整pH值至8.0(7.8-8.2均可)的PEG 0.8mL，將吸管插入管底，繼而輕輕攪動沉淀，并緩緩滴加PEG，1min內加完，再在水浴中靜置90s。
6.立即滴加37℃預溫的完全培養液(IMDM培養基)15mL，使PEG稀釋而失去作用。滴加的方法是在30s內加1mL，次30s加3mL，接下來1min加完。注意，當PEG溶液加入后，即可見細胞凝集成小團塊狀，此時操作宜輕柔，以免干擾細胞融合過程。
7.補加完全培養液(IMDM培養基)至40mL，1000rpm離心10min，棄上清。
8.將細胞沉淀輕懸于預溫的HAT培養液40mL中，加到4塊已有飼養細胞層(小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔板內，每孔加100μl。繼而將培養板移至37℃、5％CO2飽和濕度恒溫箱中培養。
4、融合細胞的篩選及克隆化培養約3天后，當雜交瘤細胞長滿孔底1/4-1/2時，培養基變黃，此時用常用的ELISA法檢測培養基上清液中的抗體，具體方法包括以下步驟1.吸取96孔板每孔的一半上清，采用ELISA法進行陽性雜交瘤細胞篩選(一篩)，具體方法為用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)稀釋包被抗原至2mg/L，加入到96孔酶聯板中進行包被，每孔100μl，4℃包被12-24小時，無需封閉；每孔加入各個克隆孔上清液100μL，37℃溫育1h，充分洗滌后加入100μL 1∶10000的酶標二抗(HRP-羊抗鼠IgG)，37℃溫育1h后，加入底物顯色，10min后終止，讀取A450nm，A450nm值為陰性對照2.1倍的為陽性雜交瘤細胞。對于一篩呈陽性的克隆株，進一步培養后，按照同樣方法進行第二次篩選。
其中，包被抗原為MC-LR-OVA，它按照下述方法制備取3mL OVA，加入0.3mg上述氨基修飾后的MC-LR，加入0.1mL 1.25％戊二醛充分混合，室溫反應24h。
2.吸取檢測結果呈陽性的孔中的剩余上清，加入新鮮HT培養基(50×HT儲液(Sigma H0137，Lot 064K8927))做進一步培養；3.第二天用與步驟1相同的ELISA法復測第一次呈陽性的上清及吸取的剩余上清(二篩)；4.將2次ELISA檢測均為陽性的克隆細胞吸出，轉移至含BALB/c小鼠腹腔細胞的HT培養基制成的24孔(每孔0.9mL HT培養基)營養板的3-4個孔內，進行再克隆。然后吸取上清，采用與步驟1相同的ELISA法對陽性克隆株進行再次確定(三篩)。
對于三篩后的陽性克隆株，采用MC-LR單體、BSA及OVA再進行一次篩選，包被濃度分別為5μg/mL，2μg/mL及2μg/mL，4℃包被過夜，其它條件同上。選取對OVA及BSA均為陰性、對MC-LR檢測結果為陽性的克隆株。結果得到4株陽性克隆株。將其中一株陽性克隆株，名稱為能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC8C10，于2007年06月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市海淀區中關村北一條13號)，保藏編號為CGMCC No.2101。
二、單克隆抗體MC8C10的獲得及亞型鑒定1、獲取抗體腹水選取10周齡BALB/C小鼠，接種細胞前7-10天，預先腹腔注射液體石蠟0.5mL/只。用生理鹽水調整雜交瘤細胞株MC8C10 CGMCC No.2101濃度至2×106個/mL，腹腔接種雜交瘤細胞，接種細胞數為1×106個/只，7-10天后采集腹水。
2、腹水的純化采用HiTrap rProtein A FF 1mL免疫親和層析柱(Bio-Science AB，Sweden.LotNo.309591)來純化步驟1獲得的小鼠單克隆抗體腹水，得到MC8C10。該層析柱所含的1mL介質最多能結合23mg由小鼠產生的IgG2b型單克隆抗體，并且對于IgG2b型抗體的結合能力是最高的，而對于小鼠產生的其它抗體亞類(如IgG1、IgG2a、IgG3等)的結合能力較弱。偶聯緩沖液為0.2mol/L、pH 7的磷酸鹽緩沖液(將NaH2PO4·2H2O1.216g，Na2HPO4·12H2O 4.369g溶解于100mL雙蒸水中)。洗脫緩沖液采用0.1M檸檬酸鈉溶液(pH3.5)。結果得到3mg固態的MC8C10。將純化的抗體分裝，-20℃保存。
3、抗體亞型鑒定采用單克隆抗體亞型檢測試盒(ImmunoTypeTM Kit，Sigma)對步驟2獲得的抗體進行免疫球蛋白亞型的鑒定，具體方法為用PBS以1∶1000比例稀釋各類抗體(小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)，然后用稀釋抗體包被96孔酶聯板(每孔0.1mL，每類抗體兩個孔)，37℃溫育1小時后，棄包被液，洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入步驟2純化的抗體，室溫溫育1小時后洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(購自邦定生物公司)，室溫溫育30分鐘后，洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過氧化物酶底物反應液(1mg/mL TMB)，室溫10-15分鐘，出現褐色即為陽性結果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2SO4終止反應。結果表明雜交瘤細胞MC8C10分泌的抗體為IgG2b亞類。
這里配制緩沖液均使用雙蒸水，化學試劑純度為分析純或更高。最后配制的緩沖液采用0.45μm的濾器過濾。
實施例2、利用專用緩沖溶液1提高環境樣品免疫檢測抗基質效應所用的專用緩沖液1是在0.1mol/L、pH為7.4的PBS(配置方法KCl 2.0g；KH2PO42.4g；Na2HPO4·12H2O 29g；雙蒸水加至1000mL。)中，加入下述a)、b)和c)的物質a)NaCl，使其終濃度為50g/L；b)牛血清白蛋白，使其終濃度為10g/L；b)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為5g/L。
一、消除水中酸堿度給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗設兩個處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。
所用的試劑和酶標板按照如下方法制備1、待測水樣的配制a.濃鹽酸中HCl含量為36％-38％，用純水稀釋10倍配制成1mol/L的標準溶液，pH＝0.0；b.稱取4g NaOH，溶于100mL純水中，配制成濃度為1mol/L的標準溶液，pH＝14.0；c.利用a和b的兩種標準溶液的不同配比，配制如下pH梯度溶液3，4，5，6，7，8，9，10共8個梯度。利用pH計校正。
d.用c中的溶液配制pH分別為3、4、5、6、7、8、9和10，以及濃度(單位μg/L)分別為1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0.219、0.0656、0.020、0.006、0的MC-LR標準溶液，共96個待測水樣。每個pH的待測水樣采用2個平行，測定不同pH條件下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
2、抗體溶液配制A、抗體溶液1的配制單克隆抗體MC8C10的稀釋采用0.01mol/L pH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液(配置方法NaCl 8g；KCl 0.2g；KH2P040.24g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；蒸餾水加至1000mL。)，即普通緩沖液，稀釋度1∶6000。
B、抗體溶液2的配制將單克隆抗體MC8C10改用專用緩沖液1進行稀釋，稀釋度1∶6000。重復試驗，以確定本發明的專用緩沖液對pH值干擾的抑制效果。
3、酶標二抗溶液配制辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG原液，灌裝入試劑瓶中，使用時用洗滌液按1∶10000配制成工作濃度。
4、洗滌液配制(10×PBST)含0.5％(體積百分含量)吐溫-20和80g/L氯化鈉的0.1mol/L pH＝7.5磷酸鹽緩沖液，灌裝入試劑瓶中。使用時，將該溶液用純水稀釋10倍再用。
5、底物溶液配制使用0.1mol/L pH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液，每1ml緩沖液中加入50μL 0.1％的H2O2溶液，灌裝入試劑瓶中。
6、顯色劑溶液配制用丙酮配制成10mg/mL的四甲基聯苯胺溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0.2mg/mL的四甲基聯苯胺溶液，灌裝入試劑瓶中。
7、終止液配制2mol/L H2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
8、酶標板是包被了包被抗原的96孔聚苯乙烯微量反應板。
酶標板的包被包被抗原采用實施例1的MC-LR-BSA，包被濃度0.25μg/mL，取120μL包被抗原加入反應板孔中，4℃冰箱中過夜，倒出孔內液體，用洗滌液1×PBST洗滌3-5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在已包被抗原的酶標板小孔中加入150μL 1％的BSA(質量百分含量)封閉，37℃溫育1h，用洗滌液1×PBST洗滌3-5次，用吸水紙吸干，真空封裝。
具體測定方法如下將待測水樣與抗體溶液同時加入酶標板小孔中，同時設置空白孔(將添加的抗體換成高純水，其它一致)和陰性對照孔(待測水樣用高純水代替，即不含MC-LR，其它-致)，37℃溫育0.5h，倒出孔內液體，重復用洗滌液(10×PBST)洗滌2-5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打；加入酶標二抗溶液于酶標板小孔中，37℃溫育0.5h，用洗滌液重復洗3-5次，吸干；加入底物溶液和顯色溶液到酶標板小孔中，室溫下反應10-15min，用酶標儀在波長450m處測定吸光度A，以不加抗體的小孔作為空白調零。以各濃度的吸光度A為縱坐標，以對應MC-LR濃度的log10值為橫坐標，繪制半對數標準曲線圖。
對各標準曲線進行模型擬合及評價，采用4參數Logistic模型A=A2+A1-A21+(xx0)p]]>(4參數Logistic模型)其中x未標記抗原濃度(質量濃度或物質的量濃度)，自變量；Ax對應的吸光度(Absorbance)，因變量；A1上端漸近線(x＝0)，常數；A2下端漸近線(x→∞)，常數；p與曲線的斜率有關，常數；
x0曲線的中點，或稱拐點，常數；(1)半抑制濃度IC50是競爭ELISA一個很重要的評價指標。在競爭ELISA中，IC50≡x0。
(2)在競爭ELISA中，依據上述Logistic模型，定義最大吸光度A0如下式。
A0＝A1添加普通緩沖液的不同pH值條件下的標準曲線如圖1所示，各標準曲線的最大吸光度A0和IC50的比較如圖2所示。表明酸性條件對免疫反應有強烈的影響，而在堿性條件下則有利于反應的進行；隨著pH值的增大，最大吸光度有所增加，但幅度不大；pH值對IC50的值影響比較大，因此而直接影響ELISA的靈敏度。pH值在7-8之間時，IC50值達到最小值，隨著酸度或堿度的增加，IC50都會增加，靈敏度下降。抗原抗體之間的氫鍵結合力以及離子化抗體配位受體受pH值影響較大，pH值同時又可能影響抗原和抗體的分子結構。說明pH值接近中性或動物體液環境時(pH＝7.4)，最利于抗原抗體的結合反應。
為了消除pH值對抗原抗體反應的影響，采用本發明的專用緩沖液1，加大對酸堿度的緩沖能力。添加專用緩沖液1的各標準曲線如圖3所示，進一步結合圖4表明，該方法是有效的。各標準曲線一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都沒有明顯變化，說明pH值的影響已經消除。結果表明，采用專用緩沖液1作為抗體稀釋液，該緩沖液pH值為7.4左右，最有利于抗原抗體的反應，并且還能消除樣品中的酸或堿(pH＝3-10)帶來的干擾。
二、消除水中硬度給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗設兩個處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.稱取1.11g無水CaCl2，溶解于10mL純水中，配制1mmol/L的Ca2+溶液。
2.稱取2.03g MgCl2·6H2O，溶解于10mL純水中，配制1mmol/L的Mg2+溶液。
3.用純水配制如下濃度梯度的Ca2+和Mg2+混合液(摩爾比1∶1，單位mmol/L)20、15、10、8、6、4、2、0，對應的硬度梯度為(單位德國度HGo)112、84、56、44.8、33.6、22.4、11.2、0。
4.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，用步驟3的溶液分別配制不同硬度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個硬度條件下采用2個平行，測定不同硬度下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加普通緩沖液的硬度對ELISA反應有一定的影響，實驗結果如圖5及6所示。結果表明，當鈣鎂離子濃度大于等于8mmol/L時(對應的硬度為44.8HGo)，會較大程度上影響間接競爭ELISA的抗原抗體結合反應，標準曲線部分變形，本底值升高，重復性降低，標準偏差增大，無法進行定量計算。
為了降低樣品中的硬度帶來的影響，抗體稀釋液采用本發明的專用緩沖液1，實驗結果如圖7及8所示。結果表明，此時硬度對免疫檢測的影響明顯地被消除。當鈣鎂離子濃度小于等于20mmol/L(對應的硬度為112HGo)時，各標準曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒有明顯的變化。
三、消除水中腐殖質酸給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗設兩個處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.用純水配制0.3倍濃度梯度的腐殖酸(HA)(北京化學試劑公司)溶液如下(單位mg/L)1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，分別用步驟1的溶液配制不同腐殖酸濃度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個腐殖酸濃度采用2個平行，測定不同硬度下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加普通緩沖液的不同濃度的腐殖酸溶液條件下ELISA標準曲線如圖9所示，各標準曲線的空白樣品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制濃度IC50的比較如圖10所示。實驗結果表明，HA濃度大于1g/L時，便明顯地影響間接競爭ELISA反應，致使反應沒有梯度產生。腐殖酸的溶解度隨著pH升高而增加，實驗觀察發現，腐殖酸溶解度在純水中較難溶解，當配制濃度為1g/L時，仍然可見沉淀。當有沉淀存在時，可能因為沒有溶解的腐殖酸能吸附微囊藻毒素或者抗體，并一起吸附到酶標板上，導致免疫反應失敗。當腐殖酸濃度大于等于27mg/L時，會較大程度上影響間接競爭ELISA的抗原抗體結合反應，標準曲線部分變形，重復性降低，標準偏差增大，曲線變得不可預測，也無法擬合，因而無法進行定量計算。另外，隨著腐殖酸濃度的升高，空白樣品的吸光度(A0)下降，而非特異性吸附并沒有明顯的提高；IC50值也不斷增加。
腐殖酸的影響不僅是其酸性帶來的影響，結果表明，即使采用10×PBS也未能徹底消除其酸度的影響，可見腐殖酸還有其它的影響途徑。進一步分析得出，腐殖酸分子量由數千到數萬，分子結構非常復雜，屬于大分子聚合物。其分子上存在很多不同直徑的空間或洞穴，這些空隙中可以容納吸收有機污染物和重金屬離子等。有可能MC-LR分子被其吸附，而無法與抗體結合，即競爭性的有利半抗原濃度降低，會導致ELISA吸光度下降和半抑制濃度的升高。
為了消除腐殖酸帶來的影響，采用本發明的專用緩沖液1來稀釋抗體，并進行間接競爭ELISA實驗，結果如圖11及12所示。結果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸帶來的影響。但當腐殖酸濃度為1000mg/L時，IC50略有上升，達到了6.6μg/L。說明對于腐殖質適用的邊界條件為0-300mg/L。
四、消除水中重金屬給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗設兩個處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.用純水配制CuSO4·5H2O(北京化學試劑公司)溶液如下(單位mg/L)5000、1000、200、40、8、1.6、0.32。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，分別用步驟1的溶液配制不同硫酸銅濃度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個硫酸銅濃度采用2個平行，測定不同硫酸銅濃度下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加普通緩沖液的不同濃度的硫酸銅溶液條件下ELISA標準曲線如圖13所示，各標準曲線的空白樣品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制濃度IC50的比較如圖14所示。實驗表明，當CuSO4濃度為5g/L時，加入一抗后溶液即變藍，出現混濁，并有藍色沉淀；顯色后，該濃度條件下的吸光度比其它濃度條件下高許多，梯度不明顯，數據不可擬合。可能原因是抗體被銅離子沉淀下來并吸附到酶標板上，3次洗滌液沒有將其洗脫下來。
另外，隨著銅離子濃度的升高，本底值也有升高趨勢，表明部分抗體被銅離子沉淀下來；并且，標準曲線變形嚴重，說明抗原抗體反應受到了明顯地影響。
為了降低樣品中銅離子帶來的影響，采用本發明的專用緩沖液1來稀釋抗體，并進行間接競爭ELISA實驗，結果如圖15及16所示。結果表明，此時銅離子對免疫檢測的影響明顯地受到抑制。當硫酸銅濃度小于等于1000mg/L時，各標準曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒有明顯的跳躍；當樣品中的硫酸銅濃度為5000mg/L時，由于濃度太高，對免疫反應的影響仍然很嚴重。所以對于硫酸銅適用的邊界條件為0-1000mg/L。
五、消除水中綜合污染物給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗只設抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.生活污水取自清華大學學生宿舍1號樓下水道，水樣采集后采用普通濾紙過濾，濾液CODCr測定結果為469mg/L。用純水梯度稀釋生活污水如下100％、80％、60％、50％、40％、20％、10％、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同生活污水濃度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個樣品采用2個平行，測定不同生活污水濃度條件下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加專用緩沖液1的不同污染程度的生活污水對ELISA檢測的影響結果如圖17及圖18所示，可以看出，生活污水對ELISA的影響比較明顯，隨著污水濃度的升高，其中的基質會明顯地影響ELISA的吸光度，使吸光度整體下降。而且標準曲線的IC50值也會有起伏的變化。當CODCr濃度高于200mg/L時，A0值有明顯的下降，曲線的上平臺吸光度從0.6下降到0.45左右。當CODCr濃度高于375mg/L時，曲線的形狀與標準的反S型相差較大，變得不規則，因而不能進行定量檢測。綜上所述，本研究確定的CODCr邊界條件為0-200mg/L。
六、消除水中葉綠素給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗只設抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.用純水配制0.3倍梯度稀釋的葉綠素a(Fluka 44014，分離自Cyanobacteriasp.，純度≥96.0％)溶液如下(mg/L)1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同葉綠素a濃度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個樣品采用2個平行，測定不同葉綠素a濃度條件下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加專用緩沖液1的葉綠素a對MC-LR免疫檢測的影響結果如圖19及圖20所示，由圖可知，采用本發明的專用緩沖液，葉綠素a對ELISA的影響不明顯。即使葉綠素a濃度達到了1000mg/L時，標準曲線的形狀仍然符合標準的反S型，并且各條標準曲線一致性良好。進一步分析A0和IC50值的變化趨勢，結果表明，葉綠素a濃度達到了1000mg/L后，各標準曲線的最大吸光度和半抑制濃度都沒有明顯的變化。因此，本研究確定的葉綠素a的邊界條件為0-1000mg/L。
七、消除水中有機溶劑給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗設兩個處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.用純水配制梯度濃度的甲醇(北京化學試劑公司)溶液如下(體積百分比)50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，分別用步驟1的溶液配制不同甲醇濃度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個甲醇濃度采用2個平行，測定不同甲醇濃度下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加普通緩沖液的不同濃度的甲醇溶液條件下ELISA標準曲線如圖21所示，各標準曲線的空白樣品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制濃度IC50的比較如圖22所示。由圖可以看出，甲醇對于免疫反應的影響是明顯的。隨著甲醇濃度的提高，最大吸光度下降，IC50值降低，ELISA的靈敏度降低。當樣品中甲醇的濃度超過40％(v/v)時，曲線發生明顯地變形，ELISA被明顯地干擾。研究表明，若不采取其它措施，樣品中甲醇的允許濃度最高為15％。
有機溶劑主要來自于固體樣品的提取過程，有機溶劑可能破壞抗原-抗體之間的范德華鍵和疏水作用力，使抗原-抗體復合物解離，可大大降低檢測的靈敏度。
為了降低樣品中甲醇帶來的影響，采用本發明的專用緩沖液1來稀釋抗體，實驗結果如圖23及24所示。結果表明，此時甲醇對免疫檢測的影響明顯地受到抑制。即使樣品中的甲醇濃度為50％時，盡管最大吸光度略有上升，但IC50值沒有明顯變化，方法的靈敏度因而也沒有很大變化。綜合分析，甲醇的邊界條件為體積百分比0-20％。
八、消除水中有毒有機污染物給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗只設抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.用純水配制0.3倍梯度稀釋的甲苯(北京化學試劑公司)溶液如下(單位mg/L)500、150、45、13.5、4.05、1.215、0.36、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同甲苯條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個樣品采用2個平行，測定不同甲苯濃度條件下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加專用緩沖液1的甲苯對MC-LR免疫檢測的影響結果如圖25及26所示，盡管在抗體緩沖液中已經加入惰性蛋白即1％BSA，但當甲苯濃度超過1mg/L時，免疫反應仍然受到明顯的影響，即最大吸光度隨著甲苯濃度的升高而降低；IC50值隨著甲苯濃度的升高而升高，但幅度都不是很大，IC50值最高可達10μg/L。綜上所述，本研究提出的甲苯邊界條件為0-1mg/L。
九、消除水中農藥給免疫檢測帶來的影響采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。實驗只設抗體溶液2處理。除了待測水樣外，實驗方法和實驗材料同步驟一。
(一)待測水樣的配制1.用純水配制0.3倍梯度稀釋的2，4-D(北京化學試劑公司)溶液如下(單位mg/L)2000、600、180、54、16.2、4.86、1.46、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同2，4-D濃度條件下的MC-LR標準溶液，作為待測水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個待測水樣。每個樣品采用2個平行，測定不同2，4-D濃度條件下MC-LR間接競爭ELISA標準曲線。
(二)結果分析添加專用緩沖液1的不同2，4-D濃度對免疫檢測的影響如圖27及圖28所示。可以看出，2，4-D的影響不是很明顯，當2，4-D濃度超過100mg/L時，IC50值有緩慢增加的趨勢，而最大吸光度沒有明顯的變化，研究得出2，4-D的邊界條件為0-100mg/L。
本發明針對環境樣品中各種基質條件所適合的邊界如下pH3-10；硬度0-112HGo；腐殖酸0-300mg/L；重金屬離子以CuSO4·5H2O作為研究對象，濃度范圍0-1000mg/L；綜合污染指標以CODcr為指標，濃度范圍0-200mg/L；葉綠素a0-1000mg/L；有機溶劑以甲醇為例，體積百分比范圍0-20％；有毒有機污染物以甲苯為例，邊界為0-1mg/L；農藥以2，4-D為例濃度范圍0-100mg/L。
實施例3、利用專用緩沖溶液2提高環境樣品免疫檢測抗基質效應所用的專用緩沖液2是在0.05mol/L、pH為7.0的PBS(配置方法KCl 1.0g；KH2PO41.4g；Na2HPO4·12H2O 13g；雙蒸水加至1000mL)中，加入下述a)、b)和c)的物質a)NaCl，使其終濃度為10g/L；a)牛血清白蛋白，使其終濃度為2g/L；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2g/L。
采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。除了專用緩沖溶液替換為專用緩沖溶液2外，實驗方法和實驗材料同實施例2的步驟一、二和三。
一、消除水中酸堿度給免疫檢測帶來的影響添加普通緩沖液的實驗結果同實施例2的步驟一。
添加專用緩沖溶液2的實驗結果如圖29所示，結果表明該方法是有效的。各標準曲線一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都沒有明顯變化，說明pH值的影響已經消除。結果表明，采用專用緩沖液2作為抗體稀釋液，能消除樣品中的酸或堿(pH＝4-10)帶來的干擾。
二、消除水中硬度給免疫檢測帶來的影響添加普通緩沖液的實驗結果同實施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實驗結果如圖30所示。結果表明，此時硬度對免疫檢測的影響明顯地被消除。當硬度為112HGo時，各標準曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒有明顯的變化。
三、消除水中腐殖質酸給免疫檢測帶來的影響添加普通緩沖液的實驗結果同實施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實驗結果如圖31所示。結果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸帶來的影響。但當腐殖酸濃度為300mg/L時，IC50有較大變化實施例4、利用專用緩沖溶液3提高環境樣品免疫檢測抗基質效應所用的專用緩沖液3是在0.12mol/L、pH為8.0的PBS(配置方法KCl 2.4g；KH2PO42.5g；Na2HPO4·12H2O 38g；雙蒸水加至1000mL。)中，加入下述a)、b)和c)的物質a)NaCl，使其終濃度為100g/L；a)牛血清白蛋白，使其終濃度為20g/L；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為20g/L。
采用競爭ELISA方法檢測待測水樣中的微囊藻毒素-LR。除了專用緩沖溶液替換為專用緩沖溶液2外，實驗方法和實驗材料同實施例2的步驟一、二和三。
一、消除水中酸堿度給免疫檢測帶來的影響添加普通緩沖液的實驗結果同實施例2的步驟一。
添加專用緩沖溶液2的實驗結果如圖32所示，結果表明，該方法是有效的。各標準曲線一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都沒有明顯變化，說明pH值的影響已經消除。結果表明，采用專用緩沖液2作為抗體稀釋液，能消除樣品中的酸或堿(pH＝4-9)帶來的干擾。
二、消除水中硬度給免疫檢測帶來的影響添加普通緩沖液的實驗結果同實施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實驗結果如圖33所示。結果表明，此時硬度對免疫檢測的影響明顯地被消除。當水中的硬度為112HGo時，各標準曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒有明顯的變化。
三、消除水中腐殖質酸給免疫檢測帶來的影響添加普通緩沖液的實驗結果同實施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實驗結果如圖34所示。結果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸帶來的影響。即使當腐殖酸濃度為1000mg/L時，IC50變化很小。
權利要求
1.一種緩沖溶液，是在現有的濃度為0.05-0.12mol/L、pH為7.0-8.0的緩沖液中，加入下述a)、b)和c)的物質a)NaCl，使其終濃度為10-100g/L；b)惰性蛋白或明膠，使其終濃度為2-20g/L；所述惰性蛋白是不與免疫反應體系發生反應的蛋白；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2-20g/L。
2.根據權利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述現有的緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
3.根據權利要求2所述的緩沖溶液，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液包括KH2PO4、Na2HPO4·12H2O和KCl。
4.根據權利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述NaCl的濃度為50g/L。
5.根據權利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述惰性蛋白或明膠的濃度為10g/L。
6.根據權利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述乙二胺四乙酸二鈉的濃度為5g/L。
7.根據權利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述惰性蛋白為牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白或兔血清白蛋白。
8.權利要求1至7中任一權利要求所述的緩沖溶液在環境樣品免疫檢測中的應用。
9.一種提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法，是在環境樣品免疫檢測中，將權利要求1至7中任一權利要求所述的緩沖溶液作為緩沖體系，進行境樣品的免疫檢測。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述基質效應由環境樣品的酸堿度和/或水中硬度和/或腐殖質酸和/或重金屬和/或有毒有機污染物和/或農藥和/或葉綠素引起。
全文摘要
本發明公開了一種提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液。本發明所提供的環境樣品免疫檢測專用緩沖溶液，是在現有的濃度為0.05－0.12mol/L、pH為7.0－8.0的緩沖液中，加入下述a)、b)和c)的物質a)NaCl，使其終濃度為10－100g/L；b)惰性蛋白或明膠，使其終濃度為2－20g/L；所述惰性蛋白是不與免疫反應體系發生反應的蛋白；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2－20g/L。本發明的提高環境樣品免疫檢測抗基質效應的方法及其專用緩沖溶液可用于各種環境樣品(如水樣)的免疫檢測中，可有效地減小或消除來自環境樣品(如水樣)中各種復雜基質在其自然界存在的邊界范圍內給免疫檢測帶來的干擾，使實際環境樣品免疫檢測的穩定性增強。
文檔編號G01N1/28GK101093223SQ200710119210
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月18日 優先權日2007年7月18日
發明者何苗, 盛建武, 施漢昌 申請人:清華大學