專利名稱：鎘離子間接競爭elisa的檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及水產類肉食品的重金屬殘留的一種快速診斷方法，具體是利用抗重金屬鎘離子的單克隆抗體對鎘離子進行檢測的間接競爭ELISA方法。

背景技術：
鎘(Cdmium)原子序數48，是嚴重危害人類健康的重金屬之一，主要來源于鎘礦、鎘冶煉廠。因鎘與鋅同族，常與鋅共生，所以冶煉鋅的排放物中必有ZnO，CdO，它們揮發性強，以污染源為中心可波及數千米遠。隨著我國工農業的迅速發展，環境中重金屬的污染越來越嚴重。重金屬污染引起的毒害持久存在，會隨土壤、水體再次循環而進入食物鏈，對食品安全構成威脅，危害人類生命和健康。鎘中毒能使腎功能受到破壞，鎘進入呼吸道可引起肺炎、肺氣腫作用于消化系統則引起腸胃炎。鎘中毒者常常伴有貧血，骨骼中有過量鎘積累會使骨骼軟化、變形、骨折、萎縮，還會引起癌癥。我國各類食品中重金屬的國家限量衛生標準，農產品安全質量無公害水產品安全要求(2001)中對鎘含量都有限定≤0.1mg/kg。歐盟，美國，日本，韓國等我國水產品的主要出口國對水產品的重金屬含量的限定也越來越嚴格，法規和標準也越來越苛刻。
目前重金屬鎘的檢測方法主要有 物理和化學的方法原子吸收分光光度法(AAS)，電感耦合等離子體-原子發射光譜法(ICP-AES)，電感耦合等離子體質譜分析(ICP-MS)，原子熒光光譜分析(AFS)等。這些方法的特點是靈敏、準確，但是需要復雜的儀器設備，專門的分析技術人員，且標準品價格昂貴，前處理麻煩，不能同時檢測大量樣品，不適合現場及大規模的推廣應用。
免疫學檢測技術目前較多應用于重金屬鎘檢測的是酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)，其檢測的原理是將鎘離子與載體蛋白偶聯免疫動物，獲得針對鎘的抗體，利用樣品中的鎘離子與標準品中鎘離子競爭結合抗體并以此對樣品中的鎘進行定性或定量分析。該法簡便、快速，可同時分析大批量樣品。
目前國外已開展重金屬的免疫學檢測技術，成功地制備出In(III)、Pb(II)、Ni(II)、Cd(II)、Hg(II)等特異性重金屬抗體，部分抗體已應用于環境檢測，研制出重金屬的酶聯檢測試劑盒。國內尚未有重金屬的免疫學檢測的報道，國外文獻報道不充分，依據其不能重復合成人工抗原，因此開發具自主知識產權的重金屬的酶聯檢測方法有重要意義。


發明內容
為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種利用重金屬鎘單克隆抗體檢測鎘離子的間接競爭ELISA方法，該方法可以大規模地對海洋魚貝類食品中殘留的重金屬鎘進行快速、靈敏的檢測，保障我國海產品食用安全及維護我國在相關國際貿易領域中的利益。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，包括如下步驟分別將魚貝類樣品提取液和系列濃度的鎘離子(Cd2+)標準液加入到抗原預包被條的微孔中，再加入抗鎘離子的單克隆抗體到每個微孔，混勻孵育，在每個微孔中加入HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，孵育；經底物顯色后終止反應，用酶標儀測定各孔的吸光度(OD)，對照標準品所得的曲線回歸方程，計算樣品中鎘離子(Cd2+)的含量。
上述鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，包括如下步驟 (1)在抗原預包被條的每個微孔內分別均加入10μl的100mM EDTA(乙二銨四乙酸)，然后在上述每個微孔中再分別加入80μL魚貝類樣品提取液及80μl系列濃度的Cd2+標準液，混勻；然后每個微孔加入10μL 1∶32000倍稀釋的抗鎘離子的單克隆抗體；混勻，37℃孵育0.5～2h；然后用洗滌液洗滌微孔； (2)每個微孔加入100μL用稀釋液1∶4000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育0.5～1h；然后用洗滌液洗滌微孔； (3)每個微孔加入100μL顯色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)底物工作液，反應10～20min； (4)每個微孔加入50μL 2M H2SO4(終止液)終止反應，并振蕩混勻； (5)用酶聯讀數儀測定在450nm波長下的OD(吸光度)值； (6)將所得標準液和樣品吸光度值除以0標準(0濃度(ng/mL)的標準液)的吸光度值再乘以100％，以此標準液計算值為縱坐標，鎘離子濃度(μg/kg)的對數為橫坐標繪制標準曲線；根據每個樣品的B/B0值從標準曲線上讀出對應的鎘離子濃度，再乘以相應的稀釋倍數，計算出樣品中實際的鎘離子濃度。所述稀釋液及洗滌液均為PBS-T即含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液。
為了更好地實現本發明，魚貝類樣品提取液按下述方法預處理每克魚肉或貝肉樣品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎勻質；4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹干樣品；以等體積環己烷和蒸餾水混合提取渦漩1min，取環己烷層，每克樣品加入12.5μL 1M HCl，再渦漩1min，靜置30min；加入2倍HCl體積量的蒸餾水，8000rpm/min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N NaOH調整到pH7.0～8.0，用稀釋液稀釋10倍后，即得魚貝類樣品提取液。
所述抗原預包被條是按下述方法制備的 (1)包被用包被緩沖液即pH9.6的0.05M碳酸鈉緩沖液將Cd-iEDTA-BSA稀釋至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板孔中，4℃包被過夜或37℃包被2～3h；所述Cd-iEDTA-BSA是用iEDTA將鎘離子偶聯到載體蛋白BSA上獲得的； (2)洗滌倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將200μl洗滌液加入每個微孔中；3～5分鐘后再次倒出孔中的液體，完全除去微孔中的液體；所述洗滌液為含0.05％(質量百分比)吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(KH2PO4 0.2g，Na2PO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐溫-20)； (3)封閉在微孔板每微孔加入150～200μL含0.5％～3％(W/V)BSA(牛血清白蛋白)的0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，37℃封閉0.5h～1.5h； (4)按步驟(2)洗滌微孔3～5次； (5)加入20％(W/V)蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時； (6)干燥微孔板干燥后，即得到抗原預包被條。
所述抗鎘離子的單克隆抗體按下述方法制備而成用iEDTA(即1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸)將鎘離子偶聯到血藍蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體(MAb-Cd)的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。
上述鎘離子進行檢測的間接競爭ELISA方法可應用于檢測海洋魚貝類食品等。
本發明是將Cd-iEDTA-BSA包被96孔酶標板，加入鎘離子標準液(Cd-EDTA)及待測魚貝類樣品提取液(X-EDTA)，再加入抗鎘離子的單克隆抗體，包被抗原Cd-iEDTA-BSA與游離的Cd-EDTA競爭抗鎘離子單克隆抗體，洗去游離的Cd-EDTA與MAb-Cd-EDTA的復合物，與包被抗原Cd-iEDTA-BSA結合的MAb再與酶標記的羊抗小鼠IgG抗體結合，經底物顯色后終止反應，用酶標儀測定各孔的吸光度(OD)，OD值越大，樣品中自由的Cd-EDTA含量越少，對照標準品所得的曲線回歸方程，計算樣品中Cd2+的含量。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果 本發明利用得到的分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞可大量制得抗鎘離子的單克隆抗體，所建立的方法成本低廉，可快速、簡便、靈敏地測定樣品中Cd2+的含量。整個檢測過程大約只需2h，不需大型儀器設備且靈敏度可達到國家檢測標準100μg/kg樣品。該方法可以大規模地對海洋貝類食品中殘留的重金屬鎘進行快速、靈敏的檢測，保障我國海產品食用安全及維護我國在相關國際貿易領域中的利益。



圖1為標準抑制曲線圖。
圖2為抑制曲線線性回歸圖。

具體實施例方式 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
試劑的配制 稀釋液及洗滌液均為PBS-T即含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(KH2PO4 0.2g，Na2PO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐溫-20)；顯色液為TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)底物工作液；終止液為2M硫酸溶液即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。
實施例1 利用抗鎘離子單克隆抗體檢測鎘離子的間接競爭ELISA方法，包括如下步驟 (A)用iEDTA(即1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸)將鎘離子偶聯到血藍蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體(MAb-Cd)的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。
(B)用iEDTA將鎘離子偶聯到載體蛋白BSA上獲得檢測抗原Cd-iEDTA-BSA。
(C)抗原預包被條的制備 (1)包被用包被緩沖液(0.05M碳酸鈉緩沖液，pH9.6)將Cd-iEDTA-BSA稀釋至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜。
(2)洗滌倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將微孔板倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去微孔中的液體。用洗瓶將200μl洗滌液加入孔中。3分鐘后再次倒出微孔中的液體，完全除去微孔中的液體。
(3)封閉每微孔加入160μL含2％(W/V)BSA(Bovine serum album，牛血清白蛋白)的0.01M PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，37℃封閉1.5h； (4)按步驟(2)洗滌微孔3～5次； (5)加入20％(W/V)蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時； (6)干燥置干燥室干燥后，得到抗原預包被條，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
(D)樣品預處理(魚肉樣品提取液) 取剪碎的魚肉樣品置于離心管中，按每克樣品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎勻質；4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹干樣品；以等體積環己烷和蒸餾水混合提取渦漩1min，取環己烷層，按每克樣品加入12.5μL 1M HCl，渦漩1min，靜置30min；加入2倍HCl體積量的蒸餾水，8000rpm/min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N NaOH調整到pH7.0～8.0，用稀釋液10倍稀釋后，取80μL進行分析。
(E)重金屬鎘離子的檢測 (1)每微孔分別加入10μL100mM EDTA溶液，然后再分別加入80μL系列濃度(0、10、50、125、250、500、2000、5000ng/mL)的鎘離子標準液及80μL上述處理好的魚肉樣品提取液到微孔中； (2)加入10μL用稀釋液1∶32000稀釋的抗鎘離子的單克隆抗體到已有標準液和魚肉樣品提取液的微孔中，輕輕混合，37℃孵育2h； (3)用洗滌液洗滌微孔3～5次； (4)每個微孔加入100μL用稀釋液1∶4000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育1h； (5)用洗滌液洗滌微孔3～5次； (6)每微孔加入100μL顯色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)底物工作液，反應10～20min； (7)每微孔加入50μL 2M H2SO4(終止液)終止反應，并輕輕振蕩混勻； (8)在15分鐘內用酶聯讀數儀測定在450nm波長下的OD(吸光度)值。標準液讀數依次為1.785，1.645，1.431，1.147，0.958，0.663，0.362，0.120，樣品讀數為1.250。
(F)結果判定標準 將所得標準液和樣品吸光度值除以0標準(0濃度的標準液)的吸光度值再乘以100％，以此標準液計算值為縱坐標，鎘離子濃度(μg/kg)的對數為橫坐標繪制標準曲線。

根據每個樣品的B/B0值就可以從上述標準曲線上讀出對應的鎘離子濃度92.826ppb，再乘以相應的稀釋倍數，最終計算出樣品中實際的鎘離子濃度為928.26μg/kg。
實施例2 利用抗鎘離子單克隆抗體檢測鎘離子的間接競爭ELISA方法，包括如下步驟 (A)用iEDTA將鎘離子偶聯到血藍蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體(MAb-Cd)的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。
(B)用iEDTA將鎘離子偶聯到載體蛋白BSA上獲得檢測抗原Cd-iEDTA-BSA。
(C)抗原預包被條的制備 (1)包被用包被緩沖液(0.05M碳酸鈉緩沖液，pH9.6)將Cd-iEDTA-BSA稀釋至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板的微孔中，4℃包被過夜。
(2)洗滌倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將微孔板倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去微孔中的液體。用多通道移液器將200μl洗滌液加入微孔中。5分鐘后再次倒出微孔中的液體，完全除去微孔中的液體。
(3)封閉每微孔加入150μL含3％(W/V)BSA(Bovine serum album，牛血清白蛋白)的0.01M PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，37℃封閉1h； (4)按步驟(2)用洗滌液洗滌微孔5次； (5)加入20％(W/V)蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時； (6)干燥置干燥室干燥后，得到抗原預包被條，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
(D)樣品預處理(貝肉樣品提取液) 取剪碎的貝肉樣品置于離心管中，按每克樣品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎勻質；4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹干樣品；以等體積環己烷和蒸餾水混合提取渦漩1min，取環己烷層，按每克樣品加入12.5μL 1M HCl，渦漩1min，靜置30min；加入2倍HCl體積量的蒸餾水，8000rpm/min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N NaOH調整到pH7.0～8.0，用稀釋液10倍稀釋后，取80μL進行分析。
(E)重金屬鎘離子的檢測 (1)每微孔分別加入10μL100mM EDTA溶液，然后再分別加入80μL系列濃度的鎘離子標準液和80μL上述處理好的貝肉樣品提取液到微孔中； (2)加入10μL1∶32000稀釋的抗鎘離子的單克隆抗體到已有標準液和貝肉樣品提取液的微孔中，輕輕混合，37℃孵育0.5h； (3)用洗滌液洗滌微孔3～5次； (4)每個微孔加入100μL1∶4000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育0.5h； (5)用洗滌液洗滌微孔3～5次； (6)每微孔加入100μL顯色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺)底物工作液，反應10～20min； (7)每微孔加入50μL 2M H2SO4(終止液)終止反應，并輕輕振蕩混勻； (8)在15分鐘內用酶聯讀數儀測定在450nm波長下的OD(吸光度)值。標準液讀數依次為1.757，1.684，1.419，1.128，0.955，0.659，0.344，0.126，樣品讀數為1.404。
(F)結果判定標準 將所得標準液和樣品吸光度值除以0標準(0濃度的標準液)的吸光度值再乘以100％，以此標準液計算值為縱坐標，鎘離子濃度(μg/kg)的對數為橫坐標繪制標準曲線。

根據每個樣品的B/B0值就可以從上述標準曲線上讀出對應的鎘離子濃度58.288ppb，再乘以相應的稀釋倍數，最終計算出樣品中實際的鎘離子濃度582.88μg/kg。
為驗證本發明效果得可靠性，進行以下鑒定 取已經封閉好的酶標板，每微孔加入10μL 100mM EDTA溶液，加入80μL配好的Cd2+標準溶液(0、10、50、125、250、500、2000、5000ng/mL)混勻作為競爭抗原，再加入10μL最佳稀釋的單抗工作液(1∶32000倍)，混勻，在一孔中加入100μL洗滌液作為不加單抗的空白對照孔；37℃溫育1.5h，洗板)加入用稀釋液1∶4000稀釋的HRP酶標羊抗小鼠二抗，37℃溫育1h，加入100μL TMB底物液顯色10分鐘，用50μL2M H2SO4終止，用酶標儀于450nm波長下判讀。以Cd2+濃度對數為橫坐標，B/B0(％)為縱坐標，繪制標準抑制曲線。
從圖1、圖2可以看到0.050-2μg/ml范圍內(B/B0)與Cd2+濃度的對數值呈良好線性關系，相關系數為r＝0.9978，以10％抑制率時Cd2+濃度為最低檢測限，達0.010μg/ml。
(2)結果再現性 針對Cd2+檢測的精密度測試，批間重復5次，所得不同濃度標準溶液的吸光值變異系數(CV％)如表1所示，顯示本發明方法具有很高的再現性。
表1競爭ELISA的批間變異系數 (3)回收率計算 取10g空白魚肉樣品中加入Cd2+標樣，提取液稀釋(稀釋到約在標準曲線的濃度范圍之內)后，進行ELISA測定。根據OD值及B/B0值從標準曲線查得Cd2+含量再乘以稀釋倍數即為樣品中Cd2+的含量，然后計算回收率，見表2。
表2測定樣品的回收率 從表中可以看出回收率93～101％。
(4)結果特異性 針對以下重金屬運用競爭ELISA進行特異性交叉反應測試，結果如下 表3重金屬鎘其他幾種的交叉反應 結果顯示，抗體除對Cd2+以外，對Hg2+有明顯的交叉，對其他幾種金屬則交叉反應很小，因此，此單抗可以用來同時檢測Cd2+和Hg2+兩種重金屬，擴大了應用范圍。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于包括如下步驟分別將魚貝類樣品提取液和系列濃度的鎘離子標準液加入到抗原預包被條的微孔中，再加入抗鎘離子的單克隆抗體到每個微孔，混勻孵育，在每個微孔中加入HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，孵育；經底物顯色后終止反應，用酶標儀測定各微孔的吸光度，對照標準品所得的曲線回歸方程，計算樣品中鎘離子的含量。
2.根據權利要求1所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于包括如下步驟
(1)在抗原預包被條的每個微孔內分別均加入10μl的100mM EDTA，然后在上述每個微孔中再分別加入80μl魚貝類樣品提取液及80μL系列濃度的Cd2+標準液，混勻；然后每個微孔加入10μL 1∶32000倍稀釋的抗鎘離子的單克隆抗體；混勻，37℃孵育0.5～2h；然后用洗滌液洗滌微孔；
(2)每個微孔加入100μL用稀釋液1∶4000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育0.5～1h；然后用洗滌液洗滌微孔；
(3)每個微孔加入100μL顯色液TMB底物工作液，反應10～20min；
(4)每個微孔加入50μL終止液2M H2SO4終止反應，并振蕩混勻；
(5)用酶聯讀數儀測定在450nm波長下的吸光度；
(6)將所得標準液和樣品吸光度值除以0標準的吸光度值再乘以100％，以此標準液計算值為縱坐標，鎘離子濃度的對數為橫坐標繪制標準曲線；根據每個樣品的B/B0值從標準曲線上讀出對應的鎘離子濃度，再乘以相應的稀釋倍數，計算出樣品中實際的鎘離子濃度；所述稀釋液及洗滌液均為PBS-T即含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液。
3.根據權利要求2所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于所述魚貝類樣品提取液按下述方法預處理每克魚肉或貝肉樣品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎勻質；4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹干樣品；以等體積環己烷和蒸餾水混合提取渦漩1min，取環己烷層，每克樣品加入12.5μL 1M HCl，再渦漩1min，靜置30min；加入2倍HCl體積量的蒸餾水，8000rpm/min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N NaOH調整到pH7.0～8.0，用稀釋液稀釋10倍后，即得魚貝類樣品提取液。
4.根據權利要求2所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于所述抗原預包被條是按下述方法制備的
(1)包被用包被緩沖液即pH9.6的0.05M碳酸鈉緩沖液將Cd-iEDTA-BSA稀釋至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板孔中，4℃包被過夜或37℃包被2～3h；所述Cd-iEDTA-BSA是用iEDTA將鎘離子偶聯到載體蛋白BSA上獲得的；
(2)洗滌倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將200μl洗滌液加入每個微孔中；3～5分鐘后再次倒出孔中的液體，完全除去微孔中的液體；所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液；
(3)封閉在微孔板每微孔加入150～200μL含0.5％～3％BSA的0.01MPBS，37℃封閉0.5h～1.5h；
(4)按步驟(2)洗滌微孔3～5次；
(5)加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時；
(6)干燥微孔板干燥后，即得到抗原預包被條。
5.根據權利要求2所述的一種鎘離子間接競爭ELISA的檢測方法，其特征在于所述抗鎘離子的單克隆抗體按下述方法制備而成用iEDTA將鎘離子偶聯到血藍蛋白上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種鎘離子檢測的間接競爭ELISA方法，該方法分別將魚貝類樣品提取液和系列濃度的鎘離子標準液加入到抗原預包被條的微孔中，再加入抗鎘離子的單克隆抗體到每個微孔，混勻孵育，在每個微孔中加入HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，孵育；經底物顯色后終止反應，用酶標儀測定各微孔的吸光度，對照標準品所得的曲線回歸方程，計算樣品中鎘離子的含量。本發明利用得到的可分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞可大量制得抗鎘離子的單克隆抗體，所建立的方法成本低廉，可快速、簡便、靈敏地測定樣品中鎘離子的含量。本發明可以大規模地對海洋魚貝類食品中殘留的重金屬鎘進行快速、靈敏的檢測。
文檔編號G01N33/577GK101196521SQ20071003291
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者向軍儉, 王建華, 勇 唐, 峙 黃, 寧 鄧, 宏 王, 楊紅宇 申請人:暨南大學