專利名稱：犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條及制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種犬體內特異狂犬病毒有效保護性抗體的快速檢測試紙條，特別是提供了犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條及制備工藝，屬于動物疫病檢測技術領域。
背景技術：
狂犬病早在公元前四世紀即有記載，是由狂犬病毒引起的直接接觸性、病毒性傳染病，所有溫血動物均易感，是目前危害人類健康的一種重要人畜共患病。據統計，現全世界每年死于狂犬病的病人達35000-50000例，1950-2005年我國狂犬病死亡總人數約102280例，總的發病和死亡人數僅次于印度，居世界第2位。患有狂犬病的犬、貓和某些野生動物是人畜感染的最主要傳染來源。因此要從根本上控制和消滅狂犬病，必須對犬、貓和野生動物實行綜合的預防控制措施。目前對于犬狂犬病的預防，采用注射狂犬病疫苗的方法，但疫苗接種后犬體內是否產生了有效的抗體，目前還沒有簡便、快速的檢測方法和試劑。
膠體金免疫層析試紙條是新近發展起來的一種診斷方法，具有速度快、結果直觀、靈敏度高等優點。

發明內容
本發明的目的是要提供一種犬狂犬病病毒抗體的膠體金免疫層析試紙條及其制備工藝，能夠簡易、快捷地檢測犬狂犬病病毒抗體。
本發明根據抗原抗體能特異結合的免疫學基本原理，將羊抗犬免疫球蛋白(IgG)用膠體金標記，包被在玻璃纖維膜上作為結合墊，將純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)和兔抗羊IgG分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上作為檢測線和質控線，當被檢樣品中含在狂犬病毒特異抗體時，可在檢測線上形成抗原抗體結合物并在NC膜上出現紫紅色條帶，通過肉眼進行觀察判定。
本發明的解決方案是在NC膜上包被檢測線和質控線，檢測線側貼有金標抗體玻璃纖維膜，質控線側貼有吸水墊，其中檢測線包被的是純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)，質控線包被的是兔抗羊IgG。檢測時，抽取被檢測犬的少量血液，滴在該試紙條的樣品墊上，對比檢測線和質控線的顏色，確定犬體內是否產生了有效的保護性抗體。
此外，本發明也提供了一種狂犬病毒抗體膠體金免疫層析診斷試紙條的制備方法，特別是膠體金標記羊抗犬IgG及狂犬病毒抗原的制備方法。
本發明犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條制備方法主要涉及以下幾個方面的內容
1、羊抗犬IgG的制備利用純化的犬IgG作為抗原免疫羊而制成的羊抗犬IgG，該抗體只針對犬的免疫球蛋白反應。用此抗體標記膠體金制成金標抗體，可與待檢樣品中的犬免疫球蛋白結合，所以用此抗體標記膠體金后噴在結合墊上。
2、兔抗羊IgG的制備這種抗體是用羊的免疫球蛋白作為抗原免疫兔，提取免疫兔血清中的抗體球蛋白制成的。用在NC膜的質控線上，可與金標抗體結合，以此檢測試紙條的有效性。
3、狂犬病毒抗原的制備用狂犬病毒疫苗弱毒ERA株，感染單層非洲綠猴腎細胞(Vero)細胞，病變后收取上清液為一代毒，再以此毒感染單層Vero細胞，在35℃條件下培養24-48小時，以不含血清的培養液洗3次后換無血清培養液，在35℃條件下培養4-5天，收取培養毒液為二代毒，繼而經過5000r/min離心15min處理，取上清液加入1/10000β丙內酯滅活，經醋酸鋅沉淀法和超濾濃縮法處理，采用Seprose4FF層析柱過濾，制得狂犬病毒抗原；或者利用酵母表達系統/哺乳動物細胞表達系統表達狂犬病毒糖蛋白或核蛋白抗原，并進行純化，將該純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)用在試紙條的檢測線上，可與金標抗體-犬抗體復合物結合，形成夾心抗原抗體復合物。
4、該試紙條的生產工藝流程4.1羊抗犬IgG金標抗體的制備(1)膠體金的制備取濃度為0.01％氯金酸(HAuCl4)溶液100mL加熱沸騰后迅速加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，再保持沸騰10-15min，可制得金顆粒大小為20納米的膠體金溶液；(2)膠體金標記羊抗犬IgG在膠體金溶液中用0.1M碳酸鉀(K2CO3)溶液調pH調為8.2，按2-18ug/ml加入羊抗犬IgG，經混合攪拌后再向溶液中按1g/100ml加入牛血清白蛋白(BSA)，4℃靜置2-4小時。將上述膠體金溶液經2000r/min離心20分鐘，去除沉淀物得上清。再將上清液經10000r/min離心40分鐘得沉淀物。將沉淀物按1/10的比例用10mM pH7.0 PBS+1％BSA+1％蔗糖緩沖液重懸浮得金標抗體溶液，該緩沖液中含0.01-0.06％的疊氮鈉；(3)將標記好的金標抗體溶液以最佳的結合量滴加于玻璃纖維膜而形成結合有金標抗體結合墊。
4.2結合墊的處理將結合墊放入緩沖液中浸泡，干燥，結合墊噴標記好的金標羊抗犬IgG，然后干燥。
4.3試紙條板的制備撕去背襯上的不粘膠，分別貼上NC膜、結合墊(已噴有金標抗體)、樣品墊和吸水墊。
4.4NC膜的噴樣 硝酸纖維素膜(NC膜)上設有兩條線檢測線和質控線。檢測線為純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)，按0.8-1.2mg/ml用噴膜機在NC膜中段噴檢測線，線寬0.8mm。質控線為兔抗羊IgG，按1.0-1.5mg/ml用噴膜機在NC膜中段距檢測線0.5cm處噴質控線，線寬也為0.8mm，37℃干燥2小時。再用10mMpH7.0含5％BSA的PBS，在37℃下封閉30分鐘，10mM pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
4.5試紙條板切條及測試盒的組裝將NC膜噴有抗體的試紙條板切成6×0.4cm的試紙條，放入測試盒內，立即放入鋁箔袋內封口。
用本發明的試紙條檢測狂犬病毒抗體的敏感性與酶聯法檢測抗體比較，偏低一個滴度，但特異性好、穩定性高。用參比血清標準標定，血清含中和抗體達0.5IU值時，檢測線出現紫紅色的陽性條帶，如檢測線無此條帶，即為陰性，表明血清中沒有狂犬病抗體或抗體量不足，質控線不管血清中有沒有狂犬病抗體均應出現紫紅色的陽性條帶，表明試紙條有效，如果質控線無反應，說明試紙條已失效。根據WHO規定標準，中和抗體達到0.5IU時，犬體才能達到保護力，否則應及時加強免疫。
本發明與現有的檢測技術相比具有如下優點1、本發明檢測狂犬病毒抗體的方法簡單、快速、經濟、易操作，靈敏度高、特異性強、重復性好、易于判讀，不需要借助其它儀器設備，適合各級獸醫檢測機構進行臨床檢驗、流行病學調查和現場檢疫等。
2、本發明的診斷試劑盒的制備方法簡便、穩定性高、重復性好。本發明具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點。并且價格低廉，無需專門設備，適用于臨床檢測、流行病學調查和現場檢疫等多種場合。


圖1是犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的縱剖面結構示意圖1-樣品墊(由普通濾紙制成)、2-結合墊(由玻璃纖維膜制成，上噴有膠體金標記的羊抗犬IgG)、3-檢測線(為犬狂犬病毒抗原)、4-質控線(為兔抗羊IgG)、5-NC膜、6-吸水墊、7-背襯板具體實施方式
通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。
實施例11、羊抗犬IgG的制備利用純化的犬免疫球蛋白作為抗原免疫羊而制成的羊抗犬IgG，該抗體只針對犬的免疫球蛋白反應。用此抗體標記膠體金制成金標抗體，可與待檢樣品中的犬免疫球蛋白結合，所以用此抗體標記膠體金后噴在結合墊上。
2、兔抗羊IgG的制備這種抗體是用羊的免疫球蛋白作為抗原免疫兔，提取免疫兔血清中的抗體球蛋白制成的。用在NC膜的質控線上，可與金標抗體結合，以此檢測試紙條的有效性。
3、狂犬病毒抗原的制備用狂犬病毒疫苗弱毒ERA株，感染單層Vero細胞，病變后收取上清液為一代毒，再以此毒感染單層Vero細胞，在35℃條件下培養24-48小時，以不含血清的培養液洗3次后換無血清培養液，在35℃條件下培養4-5天，收取培養毒液為二代毒，繼而經過5000r/min離心15min處理，取上清液加入1/10000β丙內酯滅活，經醋酸鋅沉淀法和超濾濃縮法處理，采用seprose4FF層析柱過濾，制得狂犬病毒抗原；或者利用酵母表達系統/哺乳動物細胞表達系統表達狂犬病毒糖蛋白或核蛋白抗原，并進行純化，將該純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)用在試紙條的檢測線上，可與金標抗體-犬抗體復合物結合，形成夾心抗原抗體復合物。
實施例2試紙條的生產工藝流程1、羊抗犬IgG金標抗體的制備(1)膠體金的制備取濃度為0.01％氯金酸(HAuCl4)溶液100mL加熱沸騰后迅速加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，再保持沸騰10-15min，可制得金顆粒大小為20納米的膠體金溶液；(2)膠體金標記羊抗犬IgG在膠體金溶液中用0.1M碳酸鉀(K2CO3)溶液調pH調為8.2，按2-18ug/ml加入羊抗犬IgG，經混合攪拌后再向溶液中按1g/100ml加入牛血清白蛋白(BSA)，4℃靜置2-4小時。將上述膠體金溶液經2000r/min離心20分鐘，去除沉淀物得上清。再將上清液經10000r/min離心40分鐘得沉淀物。將沉淀物按1/10的比例用10mM pH7.0 PBS+1％BSA+1％蔗糖緩沖液重懸浮得金標抗體溶液，該緩沖液中含0.01-0.06％的疊氮鈉；(3)將標記好的金標抗體溶液以最佳的結合量滴加于玻璃纖維膜而形成結合有金標抗體的結合墊。
2、結合墊的處理 將結合墊放入緩沖液中浸泡，干燥，結合墊噴標記好的金標抗體，然后干燥。
3、試紙條板的制 備撕去背襯上的不粘膠，分別貼上NC膜、結合墊(已噴有金標抗體)、樣品墊、吸水墊。
4、NC膜的噴樣 硝酸纖維素膜(NC膜)上設有兩條線檢測線和質控線。檢測線為純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)，按0.8-1.2mg/ml用噴膜機在NC膜中段噴檢測線，線寬0.8mm。質控線為兔抗羊免IgG，按1.0-1.5mg/ml用噴膜機在NC膜中段距檢測線0.5cm處噴質控線，線寬也為0.8mm，37℃干燥2小時。再用10mM pH7.0含5％BSA的PBS，在37℃下封閉30分鐘，10mM pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
5、試紙條板切條及測試盒的組裝將NC膜噴有抗體的試紙條板切成6×0.4cm的試紙條，放入測試盒內，立即放入鋁箔袋內封口。
實施例3(1)結合墊為玻璃纖維膜，由美國Millipore公司生產，用10mMpH8.2 PBS+3％BSA+0.1％Triton X-100+1％PVP-40000預處理液對結合墊進行處理，浸泡30分鐘后37℃真空干燥，噴上膠體金標記的羊抗犬IgG后干燥，結合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接；(2)NC膜是一種專門用于制備膠體金試紙條的材料，由美國Millipore公司生產，NC膜上噴兩條線，一條為檢測線(純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原)，另一條線為質控線(兔抗羊IgG)，NC膜貼在背襯的中間，兩端分別與結合墊和吸水墊連接；(3)樣品墊為一種具有較好吸水能力的厚濾紙，由美國Millipore公司生產，在試紙條中起過濾血細胞等樣品的作用，位于結合墊上，貼在背襯上；
(4)吸水墊為厚濾紙，由美國Millipore公司生產，貼在背襯的末端，起吸水作用(層析作用)；(5)背襯是一個支撐樣品墊、結合墊、NC膜和吸水墊的膠版板材料。
實施例4根據圖1所示，由樣品墊1、結合墊2、吸水墊6、背襯7、硝酸纖維素膜5部分組成犬狂犬病抗體膠體金免疫層析檢測試紙條，樣品墊1由普通濾紙制成，結合墊2由玻璃纖維膜制成，上噴有膠體金標記的羊抗犬IgG，硝酸纖維素膜5為NC膜，其上的質控線4為兔抗羊IgG，檢測線3為狂犬病毒抗原。
權利要求
1.一種犬狂犬病抗體膠體金免疫層析檢測試紙條，由經過處理的樣品墊(1)、結合墊(2)、吸水墊(6)、背襯(7)、硝酸纖維素膜(5)部分組成，其特征在于結合墊(2)中噴有膠體金標記的羊抗犬IgG，硝酸纖維素膜(5)上的質控線(4)為兔抗羊IgG，檢測線(3)為狂犬病毒抗原。
2.根據權利要求1所述犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于所述的結合墊上羊抗犬金標抗體的制備方法包括下述步驟(1)膠體金的制備取濃度為0.01％氯金酸HAuCl4溶液100mL加熱沸騰后迅速加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，再保持沸騰10-15min，可制得金顆粒大小為20納米的膠體金溶液；(2)膠體金標記羊抗犬IgG在膠體金溶液中用0.1M碳酸鉀K2CO3溶液調pH值為8.2，按2-18ug/ml加入羊抗犬IgG，經混合攪拌后再向溶液中按1g/100ml加入牛血清白蛋白BSA，4℃靜置2-4小時；將上述膠體金溶液經2000r/min離心20分鐘，去除沉淀物取上清；再將上清液經10000r/min鐘離心40分鐘得沉淀物；將沉淀物按1/10的比例用10mM pH7.0 PBS+1％BSA+1％蔗糖緩沖液重懸浮得金標抗體溶液，該緩沖液中含0.01-0.06％的疊氮鈉；(3)將標記好的金標抗體溶液以最佳的結合量滴加于玻璃纖維膜而形成結合有金標抗體的結合墊。
3.根據權利要求1所述犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于NC膜上的檢測線為純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的狂犬病毒抗原，其制備方法為用狂犬病毒疫苗弱毒ERA株，感染單層非洲綠猴腎細胞Vero細胞，病變后收取上清液為一代毒，再以此毒感染單層Vero細胞，在35℃條件下培養24-48小時，以不含血清的培養液洗3次后換無血清培養液，在35℃條件下培養4-5天，收取培養毒液為二代毒，繼而經過5000r/min離心15min處理，取上清液加入1/10000β丙內酯滅活，經醋酸鋅沉淀法和超濾濃縮法處理，采用Seprose4FF層析柱過濾，制得狂犬病毒抗原；或者利用酵母表達系統/哺乳動物細胞表達系統表達狂犬病毒糖蛋白或核蛋白抗原，進行純化。
全文摘要
本發明提供一種犬狂犬病病毒抗體的膠體金免疫層析試紙條及其制備工藝，根據抗原抗體能特異結合的免疫學基本原理，將羊抗犬免疫球蛋白(IgG)用膠體金標記，包被在玻璃纖維膜上作為結合墊，將純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達的抗原(酵母表達系統和哺乳動物細胞表達系統如小鼠瘤細胞表達的抗原)和兔抗羊IgG分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上作為檢測線和質控線，當被檢樣品中含在狂犬病毒特異抗體時，可在檢測線上形成抗原抗體結合物并在NC膜上出現紫紅色條帶，通過肉眼能夠簡易、快捷地檢測犬狂犬病病毒抗體。
文檔編號G01N33/558GK101017170SQ20061001696
公開日2007年8月15日 申請日期2006年6月21日 優先權日2006年6月21日
發明者夏咸柱, 黃耕, 楊松濤, 王承宇, 高玉偉, 侯小強, 高明華, 王鐵成, 薛琳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所