專利名稱：一種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其編碼的酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種經過改造的來源于墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其編碼的酶，以及含有該基因的工程菌，屬于植物基因工程和酶工程領域。
背景技術：
墊狀卷柏(Selaginella pulvinata Maxim)為卷柏科卷柏屬植物,俗稱“九死還魂草”。它一般多生長在荒山禿嶺及干旱的巖石縫中，極耐干旱，也耐寒。在天氣干旱的時候，小枝就卷起來，縮成一團，以保住體內的水分。一旦得到雨水，氣溫升高，卷縮的小枝會平展開來。有研究表明墊狀卷柏這類復蘇植物體內含有大量的應激代謝物一一海藻糖。海藻糖又稱酵母糖，是由兩個吡喃環葡萄糖分子通過a-1，I糖苷鍵連結而成的非還原性糖，其理化性質十分穩定，能夠在高溫、高寒、高鹽和干燥失水等惡劣條件下對生物細胞起到保護作用。海藻糖作為滲透調節物質通過滲透調節來維持高的細胞質滲透壓，保證在干旱脅迫下細胞的正常生理功能；在缺水情況下，可以保持細胞膜的液體流動相，防止細胞膜通透性增加，出現融合現象；可以替代水分子通過氫鍵作用參與肽鏈折疊，維持在缺水情況下蛋白質的空間結構和功能。在逆境條件下對蛋白質、核酸和生物膜等生物活性物質和細胞結構的保護均起到非常重要的作用，并且海藻糖在糖代謝途徑中起著信號轉導的作用，可通過抑制己糖激酶的活性從而調節葡萄糖進入糖酵解。在生物體內，海藻糖的生物合成過程為先由海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP)和 6_ 磷酸葡萄糖反應生成6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphatephosphatase, TPP)的作用下脫磷酸,最終生成海藻糖。其中，海藻糖_6_磷酸合成酶是該合成途徑中的一個關鍵酶；不同生物體內的海藻糖-6-磷酸合成酶具有各自不同的特點，如在編碼基因和結構等方面即存在著明顯的差異。目前人們研究海藻糖的主要策略之一，是通過對海藻糖上述合成途徑相關基因的克隆與表達研究，增強其合成途徑的代謝，從而實現海藻糖在生物體內的富集。其中海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)成為主要關注對象之一。本申請的申請人通過同源擴增的方法成功地從墊狀卷柏中克隆出TPS基因的全長序列(SEQID NO. 3所示的序列)，經過轉化相應的酵母突變體證明所克隆的序列為功能性的TPS基因。但是許多研究發現植物來源的TPS基因和微生物來源的TPS基因相比，在其5’端發現有一段冗余的堿基序列，該序列對TPS酶活有一定的影響。為了獲得酶活性更高的TPS，需要對已克隆出來的TPS基因進行相應的修飾改造，并對其功能進行驗證，以期為轉基因技術獲得更優良的外源基因。

發明內容
針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因及其編碼的酶，以及含有該基因的工程菌，通過功能驗證，SpTPSl A編碼的TPS酶活性更高。
本發明是通過以下技術方案實現的一種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，記為SpTPSl A，其核苷酸序列如下列之(I)序列表SEQID NO. I所示的序列；(2)編碼序列表SEQID NO. 2所示的蛋白質序列的多核苷酸；(3)與序列表SEQID NO. I所示的序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。一種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶，其氨基酸序列如下列之一(I)序列表SEQID NO. 2所示的序列；(2)序列表SEQID NO. 2所示的序列的一個或者幾個氨基酸殘基進行取代、缺失或者添加的序列，其活性與序列表SEQID NO. 2所不的序列的蛋白質相同。一種含有上述改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的工程菌，所述工程菌為含有插入該基因的特定表達載體的大腸桿菌、酵母菌等常用工程菌。通過分子克隆方法得到的SpTPSl A，要插入所述表達載體，所述表達載體按照分子生物學領域的常規來構建，例如，可使用質粒DNA和適當的起始密碼子、啟動子、增強子以及其它元件，將它們以正確的方向連接后具有調控功能，以便實現蛋白的表達。適當的載體對本領域技術人員來說是已知的。所述SpTPSl A基因的獲得方法如下(I)墊狀卷柏總RNA的提取從植物墊狀卷柏葉片中提取得到墊狀卷柏葉片總RNA，提取方法選自如下方法中的任一種試劑盒法(Trizol法)、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法，優選試劑盒法(Trizol法)。(2) SpTPSl A 的擴增將步驟⑴提取得到的RNA作為模板，以oligo(dT)18為逆轉錄引物，采用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (TakaRa China)按照 SMART PCR cDNA SynthesisKit (Clontech USA)操作說明進行cDNA合成。然后將cDNA作為模板，以下述上游引物0RF7和下游引物0RF5進行PCR擴增0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGGCGGCTGCTCGTTGTAGC3’ ；0RF5 :5’ CGCGGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC3’ ；如 SEQID NO. 4、5 所示；擴增得到的產物即為SpTPSl A片段，通過克隆測序，即得其基因序列。本發明還提供了對克隆得到的SpTPSl A基因進行酵母異源功能互補驗證的方法，包括下述步驟(I)將 TPSl 酶基因缺失(tpsl A)的酵母突變菌株 YSH290 (W303-1A，ggsl/tpsl A : :TRP1,Katholieke 大學 Johan M. Thevelein 教授惠贈,Hohmann S et al. 1993)轉接到含2%半乳糖的YH)培養基(I%酵母提取物、2%蛋白胨、2%半乳糖、2%瓊脂，pH5. 8)上，30°C培養，醋酸鋰法制備感受態細胞；(2)分別用SpTPSl A基因真核表達載體0pRS6和陽性對照質粒pRS6/AtTPSl醋酸鋰法轉化缺失突變菌株YSH290，在含2%半乳糖的組氨酸缺失培養基(0. 67%去氨基酸酵母氮堿、2%半乳糖、0.077%-His Do Supplement、2%瓊脂，pH5. 8)上篩選，挑選陽性轉化 子提取酵母質粒DNA，以反轉錄的cDNA為陽性對照，用上述特異引物(上游引物0RF7和下游引物0RF5)擴增SpTPSl A基因序列；(3)驗證轉化成功后，將轉化子轉接在含2%葡萄糖的組氨酸缺失培養基(0. 67%去氨基酸酵母氮堿、2 %葡萄糖、0. 077 %-His Do Supplement、2 %瓊脂，pH5. 8)上，同時轉接酵母野生菌株 W303-lA(Mataleu2-3,112ura3_l，trpl-1，his3_ll，15ade2_l，canl-lOOGAL, SUC2, Katholieke 大學 Johan M. Thevelein 教授惠贈，Thomas BJ andRothstein RJ. 1989)作陽性對照，以未轉化的TPSl酶基因缺失(tpsl A)酵母突變菌株YSH290作陰性對照，30°C培養3_5d，驗證轉化的墊狀卷柏修飾改造SpTPSl A酶基因能否恢復TPSl酶基因缺失(tpslA)酵母突變菌株的生長缺陷。為了對SpTPSl A表達酶活性進行測定，進一步證明修飾改造后的SpTPSl A基因具有更好的表達活性，本發明還提供了 SpTPSlA酶活性測定方法，測定海藻糖-6-磷酸合成酶的酶活力是根據Hottiger et al (J Bacteriol，169 :5518-5522 (1987))所述的雙酶活反應進行測定。
與現有技術相比，本發明的有益效果是(I)通過對申請人已克隆出來的墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因進行修飾改造，獲得了截短后的SpTPSl A編碼基因。(2)獲得了 SpTPSl A編碼的酶的氨基酸序列。(3)對獲得的修飾改造后的SpTPSl A基因及其編碼的酶進行了功能驗證采用酵母異源功能互補法對該基因進行功能驗證，該方法不僅可以在植物中克隆具有特定功能的未知基因，也可以根據序列相似性，或用植物基因與相應的酵母功能缺陷突變體互補，確定某一基因的生物功能。很多植物蛋白能夠和酵母突變體進行功能上的互補，從而為未知功能基因的研究提供試驗依據，酵母的互補試驗是闡述這些基因功能的一個有效手段；通過酶活測定進一步驗證截短修飾改造的基因SpTPSl A是一個比SpTPSl全長序列更優良的基因。(4)根據該SpTPSl A基因在墊狀卷柏植物體內催化合成的海藻糖所表現出的優良的抗旱、耐鹽等性能，可以預料如果將其通過轉基因技術導入玉米等其他植物中，將可培育出具有相應的優良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。


圖I為SpTPSl A基因擴增電泳檢測結果圖。圖2為表達載體pRS6/AtTPSl圖。圖3為構建真核表達載體圖。圖4為酵母異源功能互補結果圖，其中，(a)代表轉化子在組氨酸缺陷的半乳糖培養基上的生長狀況，(b)代表轉化子在組氨酸缺陷的葡萄糖培養基上的生長狀況，(C)代表每個三角形所圖的菌株。圖5為陽性轉化子的檢測結果圖。
圖6為PCR擴增反應程序
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本 發明技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發明的范圍內。在下述各實施例中，將墊狀卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶修飾改造基因簡稱為A NTPS。以下實施例中使用的材料來源如下試劑PrimeScriptTMReverse Transcriptase、oligo (dT) 18、RNase Inhibitor、DTT> dNTP Mixture、RNase free ddH20、Taq DNA Polymerase、LaTaq DNA Polymerase、GC Buffer I、Trypton、Yeast Extract、DNA marker、pMD19_T 載體購自大連寶生物公司(Takara)。DEPC和DEPC處理水購于上海生物工程公司。Trizol、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、通用型產物純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購于北京天根(TIANGEN)生化科技有限公司。氯仿、異丙醇、無水乙醇和無水氯化鈣等常規試劑為國產分析純，購自雅安試劑公司。限制性內切酶購于寶生物大連公司；鮭魚精DNA購自大連寶生物公司；半乳糖(galactose,Gal)購于 Sigma 公司；Yeast Nitrogen Base ff/0 Amino acids (YNB)、-His Do Supplement 均購于Clontech公司。植物材料墊狀卷柏采于四川省漢源山區，種植于盆土中，置于陰暗潮濕處(該植物材料采集于四川省漢源縣九襄鎮的越野之地，由蔣偉采集，聯系方式，采集時間為2009年6月，采集者聯系地址為四川省成都市溫江區惠民路211號)。菌株本實驗采用大腸桿菌E. coli DH5 a菌株作為亞克隆菌株，酵母(S. cerevisiae)表達載體 pRS6_AtTPSl 和酵母菌株 W303-1A (Mat a leu2_3,112 ura3-l,trpl-1, his3_ll ;15ade2_l, canl-lOOGAL, SUC2)(Thomas BJ and Rothstein RJ. 1989)、TPSl 突變株 YSH290 (W303-1A, ggsl/tpsl A TRP1) (Hohmann S et al. 1993)。實施例I墊狀卷柏葉片總RNA的提取步驟如下(I)取墊狀卷柏幼嫩葉片放入液氮預冷過的研缽，立即加入液氮，盡可能的研磨碎樣品，趁液氮尚未揮發將樣品按每管0. Ig分裝入用液氮預冷過的I. 5mL離心管中，立即向每管加入ImL Trizol (購自Invitrogen公司)，劇烈振蕩后，室溫放置5min ；(2) 4°C、12000r/min離心2min,將上清液轉入新的無RNase的離心管中；(3)向每管加入0. ImL 5mol/L的NaCl，混合均勻，再向每管加入0. 3mL氯仿，劇烈振蕩15s后,室溫放置3min, 4°C、12000r/min離心15min,在盡可能不吸入中間層的情況下，吸出上清液轉入另一干凈的I. 5mL離心管中；(4)向每管加入與所得上清液相等體積的異丙醇，輕輕混勻后，室溫放置lOmin，4°C、12000r/min離心IOmin,小心倒掉管中液體,保留沉淀,加入ImL 75%乙醇洗漆沉淀；(5)4°C、7500r/min離心5min,小心倒掉管中液體,保留沉淀，再加入ImL 75%乙醇洗滌沉淀，4°C、7500r/min離心5min，，所得沉淀即為墊狀卷柏葉片總RNA，-20°C保存。實施例2 SpTPSl A基因的擴增步驟如下以上述實施例I所得純化的墊狀卷柏葉片總RNA作為模板，以oligo (dT) 18為逆轉錄引物，米用 PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (TakaRa China)按照 SMART PCRcDNA Synthesis Kit (Clontech USA)操作說明進行cDNA合成。反應體系總體積為20 ii L。
先通過比對5個已知的海藻糖-6-磷酸合成酶氨基酸序列復活卷柏TPSl (Selaginella Iepidophylla),墊狀卷柏(Selaginella pulvinata Maxim),擬南芥TPSl (Arabidopsis thaliana TPS1),釀酒酵母 TPSl (Saccharomyces cerevisiae)大腸桿菌TPSl (E. coli E. coli)進行氨基酸序列比對，與大腸桿菌和酵母TPS相比，植物來源的TPS基因在其氨基酸序列的N端都有幾十個氨基酸殘基的延長部分，設計相應的引物對N端的進行截短擴增SpTPSl A基因，設計一對引物如下0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGCGGCTGCTCGTTGTAGCG 3’ ；0RF5 :5’ CGC GGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC 3’。擴增體系為
權利要求
1.ー種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，其特征在于其核苷酸序列如下列之一 (1)序列表SEQIDNO. I所不的序列； (2)編碼序列表SEQIDNO. 2所示的蛋白質序列的多核苷酸； (3)與序列表SEQIDNO. I所示的序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2.權利要求I所述的改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的制備方法，其特征在于步驟如下 (1)墊狀卷柏總RNA的提取從植物墊狀卷柏葉片中提取得到墊狀卷柏葉片總RNA； (2)SpTPSl A 的擴增 將步驟(I)提取得到的RNA作為模板，以oligo (dT) 18為逆轉錄引物，進行cDNA合成； 然后，將cDNA作為模板，以下述上游引物0RF7和下游引物0RF5進行PCR擴增0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGGCGGCTGCTCGTTGTAGC3’ ；0RF5 :5’ CGCGGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC3’ ； 擴增得到的產物即為改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在干所述步驟(I)中提取方法選自如下方法中的任ー種試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法。
4.ー種擴增權利要求I所述的改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的引物，其特征在于包括上游引物0RF7和下游引物0RF5，其序列為0RF7 :5’ ACCCTCGAGATGGCGGCTGCTCGTTGTAGC3’ ；0RF5 :5’ CGCGGATCCATTAATTATCGACAGCGACAACC3’。
5.ー種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶，其特征在于其氨基酸序列如下列之一 (1)序列表SEQIDNO. 2所不的序列； (2)序列表SEQIDNO. 2所示的序列的一個或者幾個氨基酸殘基進行取代、缺失或者添加的序列，其活性與序列表SEQID NO. 2所示的序列的蛋白質相同。
6.含有權利要求I所述的改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的工程菌。
全文摘要
本發明公開了一種改造的海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其編碼的酶，該基因具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO.1；2)編碼序列表SEQID NO.2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表SEQID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。上述基因編碼的TPS酶，具有SEQID NO.2所述的氨基酸的序列，或者將SEQID NO.2的一個或者幾個氨基酸殘基進行取代、缺失或者添加且具有與SEQID NO.2相同活性的由SEQID NO.2衍生的蛋白質。通過功能驗證截短修飾改造的基因SpTPS1Δ是一個比SpTPS1全長序列更優良的基因。本發明為培育出具有相應的優良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種提供了優良的外源基因。
文檔編號C12N1/21GK102649964SQ201210120649
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月24日 優先權日2012年4月24日
發明者于好強, 付鳳玲, 周樹峰, 周濟, 李晚忱, 趙生美, 鄧龍群 申請人:四川農業大學