一種胃蛋白酶原Ⅱ酶促化學發光檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬免疫檢測分析技術領域，尤其涉及一種胃蛋白酶原II酶促化學發光檢測 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 該測試用于診斷嚴重萎縮性胃體胃炎，以及提示早期胃癌風險。
[0003] 胃蛋白酶原（Pesinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體，由胃體的主細胞 和黏液細胞分泌。大部分分泌到胃腔，少量可在血液中被檢測到。PG II是由胃竇部的幽門 腺和十二指腸近端的Brunner氏腺黏膜的主細胞和頸細胞分泌。血清或血漿中的胃蛋白酶 原I (PGI)與PG II比值的降低與胃體萎縮的嚴重程度呈正相關。中、重度萎縮性胃炎時， 其比值為〈3. 0,其胃癌的發病率顯著增加。因此，聯合測定PG I和PG II比值可起到早期胃 癌風險提示的作用。
[0004] 化學發光技術興起于上個世紀80年代是繼酶聯免疫技術和放免技術后發展起來 的新興技術，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結合物穩定，無放射同 位素損傷和污染等特點，在近些年得到了飛速發展。化學發光的原理是在化學反應中生成 的不穩定的激發態中間體，當其回到基態時，釋放光子。在免疫檢測分析中，使用化學發光 技術，可以使檢測范圍達到6個數量級，而且靈敏度很高，加上標記物穩定，有效期長，使其 受到越來越多的關注與應用。磁微粒分離酶聯免疫檢測技術是一種以磁性微粒為固相分離 載體，將免疫磁微粒分離技術與酶聯免疫技術相結合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳 統ELISA方法，抗原，抗體的結合反應是在固相（ELISA板反應孔）表面進行的，而磁分離酶 聯免疫檢測方法，抗原、抗體的結合反應也在近似液相的條件下進行，因而反應快速，徹底。 與傳統ELISA相比具有自動化程度高、靈敏度高、檢測用時少的優點。但目前市場上檢測PG Π 試劑盒主要以傳統ELISA法為主。

【發明內容】

[0005] 本發明需要解決的技術問題在于提供一種胃蛋白酶原II酶促化學發光檢測試劑 盒，使對人胃蛋白酶原II檢測實現了自動化、高特異性和靈敏度。
[0006] -種胃蛋白酶原II酶促化學發光檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含酶標液、 胃蛋白酶原II標準品、包被胃蛋白酶原II單克隆抗體的免疫磁珠、樣本稀釋液、化學發光底 物液、洗滌液。
[0007] 所述的方法，其特征在于，其將胃蛋白酶原II單克隆抗體包被在磁珠微球表面，經 捕捉樣本中的胃蛋白酶原II以及加入酶標胃蛋白酶原II單克隆抗體試劑后，形成固相-抗 體-抗原-酶標抗體夾心免疫復合物。
[0008] 所述的方法，其特征在于，所述的包被胃蛋白酶原II單克隆抗體的免疫磁珠為含 有標記有抗胃蛋白酶原II單克隆抗體的磁性微球；
[0009] 所述的酶標液中酶標抗體的酶是辣根過氧化物酶；
[0010] 所述的洗滌液是含有吐溫-20的緩沖液；
[0011] 所述的化學發光底物溶液是酶促化學發光底物溶液。
[0012] 任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述包被胃蛋白酶原II單克隆抗體的免疫磁 珠按如下方法制得：
[0013] (1)初洗緩沖液的配制：
[0014] 稱取 0· 1952g 的 MES hygrate 于 100mL 的純水中，調整 pH 至 5. 0 ;
[0015] 加入50 μ 1吐溫-20,配成0· Olmol/L MES緩沖液，調整pH至5. 0 ;
[0016] ⑵偶聯緩沖液的配制：
[0017] 稱取0· 38138g Na2B4O7 · IOH2O溶于40ml純水中，得到0· 05mol/L的硼砂溶液；
[0018] 稱取0· 1237g H3BO3溶于IOml純水中，得到0· 2mol/L的硼酸溶液；
[0019] 取18ml 0. 05mol/L的似也07溶液與2ml 0. 2111〇1/1的!1忑03溶液混合，定容至80ml 得0. 05mol/L硼酸緩沖液；
[0020] (3)終洗液的配制：
[0021] 稱取 2. 78g Na2HPO4溶于 100mL 純水得(λ 2mol/L Na 2ΗΡ04溶液；
[0022] 稱取 I. 2g NaH2PO4溶于 50ml 純水得 0· 2mol/L NaH 2P04溶液；
[0023] 取 81ml 0· 2mol/LNa2HP04溶液與 19ml 0· 2mol/L NaH2PO4溶液混合，得 0· 2mol/L PB緩沖溶液得0. 2mol/LPB緩沖溶液；
[0024] 取 50ml 0· 2mol/L PB 緩沖液，2 倍稀釋到 100ml，加入 0· 9gNaCl, 0· 5g0. 5% -1% BSA、0. 02-0. 03%生物防腐劑、0. 05%吐溫20,充分溶解混勻；
[0025] (4)封閉液的配制：
[0026] 取100ml Tris緩沖液，將溶液的pH調節成8. 5-9. 0之間；
[0027] 向其中加入2% BSA ;
[0028] (5) EDC溶液和NHS溶液的配制：
[0029] 稱取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺，溶解于Iml的初洗緩沖 液中，配制成25mg/ml的EDC溶液；
[0030] 稱取25mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶解于初洗緩沖液中，配置成25mg/ml NHS溶 液；
[0031] (6)磁珠包被過程：
[0032] A、初洗：取100 μ 1磁珠，將其稀釋成10mg/ml的磁珠濃度，從中吸取100 μ 1 ;磁分 離架上分離，去上清；用初洗液250 μ 1洗滌三次，磁分離，去上清；
[0033] B、活化：取初洗完成的磁珠加入150 μ IMES，再加入50 μ I EDC及50 μ 1的NHS溶 液，充分混勻。室溫下25°C活化30min，活化完成磁分離去上清，以250 μ 1偶聯緩沖液重懸 洗滌三次，分離去上清；
[0034] C、稀釋抗G-17單克隆抗體：
[0035] 將抗G-17單克隆抗體從-20°C冰箱中取出，待其融化后取出20 μ 1，用偶聯緩沖液 1:20稀釋到400 μ 1，稀釋后的抗體濃度為0. 0397mg/ml。
[0036] D、偶聯：
[0037] 加入400 μ 1用偶聯緩沖液稀釋的抗G-17單克隆抗體重懸活化后的磁珠，充分混 勾，其磁珠包被比率為Img磁珠：0. 0159mg抗體；
[0038] 37°C偶聯2h，37°C搖床搖晃恒溫混勻；
[0039] E、封閉：
[0040] 將偶聯結束的磁珠于磁分離架上分離，去上清；
[0041] 加入400 μ 1封閉液，37°C搖床封閉Ih ;
[0042] 封閉結束后去除上清；
[0043] F、終洗保存：
[0044] 以400 μ 1終洗液洗滌封閉完成的磁珠，重復三次，最終定容到500 μ 1。
[0045] 本發明的工作原理為雙抗體夾心法化學發光與免疫磁珠技術相結合的一種檢測 方法。在標本中加入定量的包被胃蛋白酶原II單克隆抗體的免疫磁珠和HRP標記抗PG II 單克隆抗體。37°C孵育后，包被胃蛋白酶原II單克隆抗體的免疫磁珠與HRP標記抗PG II單 克隆抗體分別與標本中PG II分子的不同表位結合，形成磁珠-抗體-抗原-抗體復合物。 在外加磁場中直接沉淀，即可分離。棄去上清液，清洗沉淀的復合物，然后加入酶促化學發 光底物。底物在酶的作用下催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基 態時便發出了光子，形成發光反應，即可使用發光儀檢測反應的發光強度，根據標準曲線即 可算出樣品中的PG II含量。在檢測范圍中，發光強度與樣本中的PG II濃度成正比。
[0046] 本發明的特征在于：檢測血清中胃蛋白酶原II的方法使用了以下的試劑：
[0047] 本發明使用酶標液為HRP標記抗PG II單克隆抗體。
[0048] 本發明的胃蛋白酶原II標準品是含有一定量的PG II抗原的BSA蛋白溶液。
[0049] 本發明所含的樣本稀釋液是含有1 % BSA的PBS溶液。
[0050] 本發明的化學發光底物液為酶促化學發光底物溶液。
[0051] 本發明的洗滌液是含有吐溫-20和ProCline-300的緩沖液。
[0052] 本發明所述的胃蛋白酶原II酶促化學發光檢測試劑盒操作方法如下：
[0053] 一、磁珠包被緩沖液配制：
[0054] 1.初洗緩沖液的配制：
[0055] I. 1 稱取 0· 1952g 的 MES hygrate 于 100mL 的純水中，調整 pH 至 5. 0
[0056] L 2加入50 μ 1吐溫-20,配成0· Olmol/L MES緩沖液，調整pH至5. 0。
[0057] 2.偶聯緩沖液的配制：
[0058] 2. 1 稱取 0· 38138g Na2B4O7 · IOH2O 溶于 40ml 純水中，得到 0· 05mol/L 的硼砂溶液。
[0059] 2. 2稱取0· 1237g H3BO3溶于IOml純水中，得到0· 2mol/L的硼酸溶液
[0060] 2. 3 取 18ml 0· 05mol/L 的 Na2B4O7溶液與 2ml 0· 2mol/L 的 H 3B03溶液混合，定容至 80ml得0· 05mol/L硼酸緩沖液
[0061] 3.終洗液的配制：
[0062] 3. 1 稱取 2. 78g Na2HPO4溶于 100mL 純水得 0· 2mol/L Na 2ΗΡ04溶液。
[0063] 3. 2 稱取 I. 2g NaH2PO4溶于 50ml 純水得 0· 2mol/L NaH 2P04溶液。
[0064] 3. 3 取 81ml 0· 2mol/LNa2HP04溶液與 19ml 0· 2mol/L NaH 孑04溶液混合，得 0· 2mol/L PB緩沖溶液得0· 2mol/LPB緩沖溶液。
[0065] 3. 3 取 50ml 0· 2mol/L PB 緩沖液，2 倍稀釋到 100ml，加入 0· 9g NaC