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黃曲霉毒素的檢測方法

文檔序號:5860307閱讀:763來源:國知局
專利名稱:黃曲霉毒素的檢測方法
技術領域
本發明涉及一種黃曲霉毒素的檢測方法,更確切的說它是利用黃曲霉毒素單克隆抗體制備的免疫親和柱及熒光光度計來檢測食品和飼料中黃曲霉毒素的方法,屬生物細胞學及微生物菌類毒性代謝產物檢測方法技術領域。
背景技術
黃曲霉毒素(Aflatoxin)是常見霉菌黃曲霉(Aspergillus flarus)和寄生曲霉(A.parasiticus)的一組化學結構類似的次級代謝毒性產物。已分離鑒定出AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,AFM1等12種。黃曲霉毒素常存在于各種堅果如花生、核桃中,在大豆、玉米、稻谷、牛奶、奶制品、食用油及糧油制品中也經常被發現,尤其在空氣濕潤的熱帶和亞熱帶地區,AFT污染比較嚴重。
黃曲霉毒素(AFT)對人及動物肝臟組織有很強的破壞作用,可導致肝癌,甚至死亡,此外還具有致畸、致基因突變等作用,對人類健康構成極大危害。因此,我國正在加大對糧油食品的監督抽查力度,同時食品中玉米、花生及其制品中AFT含量成為歐盟各國對我國檢驗檢疫的重點之一。為適應國內和國際形勢要求,選擇適當可行的方法檢驗AFT成為當務之急。
我國目前檢測AFT的方法主要有薄層色譜(TLC)法,高效液色譜(HPLC)法,酶聯免疫吸附(ELISA)法。TLC雖然具有簡便經濟的特點,但操作步驟多,靈敏度低。HPLC靈敏度高,但樣品處理煩瑣,操作復雜,儀器昂貴。ELISA重復性差,試劑壽命短。另外,這些測定方法在操作過程中需要使用劇毒AFT作標準物,預處理時需要用到有毒、異味有機溶劑,這些物質不僅毒害操作人員,而且污染環境。我國目前對AFT進行檢測所用到的ELISA試劑盒依賴進口,價格昂貴,檢測成本相當高,所以絕大部分企業在經濟上負擔較重因素影響下,不重視AFT的監督和檢測工作。因此尋找一種經濟、快捷、準確并且易于普及推廣的AFT檢測方法是當務之急。

發明內容
本發明的目的在于提供一種經濟、快捷、精確、安全的食品中黃曲霉毒素的檢測方法。本發明的另一個目的是提供一種利用黃曲霉毒素單克隆抗體得免疫親和柱熒光光度計來檢測食品中黃曲霉毒素的方法。
為達到上述目的,本發明采用如下技術方案1.一種黃曲霉毒素的檢測方法,它是以單克隆抗體免疫親和柱為分離裝置,用熒光光度計為檢測工具的檢測方法,該方法的特征是具有以下檢測過程和步驟A.親和柱的準備和制備a.制備單克隆抗體,單克隆抗體的制備要通過小鼠免疫、細胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株、采集單克隆抗體等步驟來獲得,其步驟為(a).小鼠免疫以黃曲霉毒素B1,(簡稱AFB1)和牛血清蛋白BSA的偶聯復合物為免疫原(抗原)免疫小鼠;用50ug/50ul抗原AFB1-BSA與50ul弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射每只10周齡BALB/C雄性小鼠,一個月后作最后一次免疫,腹腔注射50ug/50ul抗原與弗氏不完全佐劑乳化后的抗原,再經過2個月后加強免疫,采用尾靜脈注射劑量為50ug/50ul抗原,4天后取出小鼠的脾臟細胞,進行下一步的細胞融合;(b).細胞融合免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞X63-Ag8.653以10∶1混勻,借助50%聚乙二醇(PEG1500)進行融合,融合細胞用HAT選擇培養基于5%CO2,37℃培養箱中培養;7天后更換HT培養液,第10天進行陽性孔篩選;(c).雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株進行陽性孔篩選采用間接非競爭酶聯免疫吸附法與排除法結合的方法;將篩選得到的強陽性細胞進行有限稀釋克隆化,反復克隆多次,獲得多株能穩定分泌抗黃曲霉毒素AFT抗體的雜交瘤細胞株,對其中的2A12進行系統鑒定后待用;(d).采集單克隆抗體將上述2A12雜交瘤細胞株擴大培養后,注入預先注射有降植烷的小鼠腹腔內,使其生長腹水瘤;10天后采集腹水,該腹水中含有大量單克隆抗體;保存好該單克隆抗體備用;b.利用上述的單克隆抗體來制備免疫親和柱,其步驟如下(a).稱取適量溴化氰活化的的瓊脂糖干粉用1毫升1M的稀鹽酸使其溶脹,然后在燒結玻璃濾器上沖洗以除去雜質;(b).將溶脹后的瓊脂糖凝膠在偶聯緩沖液中與上述制備得到得單克隆抗體均勻混合,并在室溫下震蕩充分反應1小時,偶聯緩沖液由0.1M NaHCO3和0.5M NaCL配成,PH值為8.3;(c).除去未與瓊脂糖凝膠結合的游離抗體;(d).封閉瓊脂糖凝膠珠上殘余的活性基團,用0.1MPH值為8.0的Tris-HCl處理偶聯復合物,并靜置2小時;(e).用含有0..5MNaCl,PH值為4.0的0.1M的乙酸緩沖液淋洗偶聯復合物一次,再用含有0.5MNaCl,PH值為8.0的0.1MTris-HCl緩沖液淋洗一次,如此循環反復清洗3次;(f).最后將瓊脂糖—抗體復合物填充入55×6mm層析柱中,即制成免疫親和柱。平衡備用;B.食品中黃曲霉毒素的分離與檢測方法稱取適量樣品,用一定比例的甲醇/水提取其中的AFT,經過過濾步驟并進行適當稀釋之后,將液體樣品流經親和柱達到凈化的目的,再用甲醇將親和柱上的AFT洗脫下來,在洗脫液中加入溴溶液衍生,提高檢測靈敏度,然后用熒光分光光度計測定樣液中黃曲霉毒素的含量。
同現有技術相比,本發明方法具有如下顯而易見的特點和突出的優點本發明方法具有快捷、經濟、精確度高等并且易于推廣普及。本發明方法操作簡單,能直接讀取測試結果,能實現現場檢測。因此,能有效地對食品的生產、運輸、儲存和銷售實現對黃曲霉毒素的監控和檢測。
本發明方法可以進行黃曲霉毒素總量的測定,其檢測限度可達1ug/kg,測量范圍為1-300ug/kg.
具體實施例方式實施例一一、免疫親和柱的準備和制備1.制備單克隆抗體,單克隆抗體的制備要通過小鼠免疫、細胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株、采集單克隆抗體等步驟來獲得,其步驟為(1).小鼠免疫以黃曲霉毒素B1(簡稱AFB1)和牛血清蛋白BSA的偶聯復合物為免疫原免疫小鼠;用50ug/50ul抗原AFB1-BSA與50ul弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射每只10周齡BALB/C雄性小鼠,一個月后進行加強免疫,腹腔注射50ug/50ul抗原與弗氏不完全佐劑乳化后的抗原,再經過2個月后加強免疫,采用尾靜脈注射劑量為50ug/50ul抗原,4天后取出小鼠的脾臟細胞,進行下一步的細胞融合;
(b).細胞融合免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞X63-Ag8.653以10∶1混勻,借助50%聚乙二醇(PEG1500)進行融合,融合細胞用HAT選擇培養基于5%CO2,37℃培養箱中培養;7天后更換HT培養液,第10天進行陽性孔篩選;(c).雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株進行陽性孔篩選采用間接非競爭酶聯免疫吸附法與排除法結合的方法;將篩選得到的強陽性細胞進行有限稀釋克隆化,反復克隆多次,獲得多株能穩定分泌抗黃曲霉毒素AFT抗體的雜交瘤細胞株,對其中的2A12進行系統鑒定后待用;(d).采集單克隆抗體將上述2A12雜交瘤細胞株擴大培養后,注入預先注射有降植烷的小鼠腹腔內,使其生長腹水瘤;10天后采集腹水,該腹水中含有大量單克隆抗體;保存好該單克隆抗體備用;b.利用上述的單克隆抗體來制備免疫親和柱,其步驟如下(a).稱取適量溴化氰活化的的瓊脂糖干粉用1毫升1M的稀鹽酸使其溶脹,然后在燒結玻璃濾器上沖洗以除去雜質;(b).將溶脹后的瓊脂糖凝膠在偶聯緩沖液中與上述制備得到得單克隆抗體均勻混合,并在室溫下震蕩充分反應1小時,偶聯緩沖液由0.1M NaHCO3和0.5MNaCL配成,PH值為8.3;(c).除去未與瓊脂糖凝膠結合的游離抗體;(d).封閉瓊脂糖凝膠珠上殘余的活性基團,用0.1MPH值為8.0的Tris-HCl處理偶聯復合物,并靜置2小時;(e).用含有0..5MnaCl、PH值為4.0的0.1M的乙酸緩沖液淋洗偶聯復合物一次,再用含有0.5MnaCl、PH值為8.0的0.1MTris-HCl緩沖液淋洗一次,如此循環反復清洗3次;(f).最后將瓊脂糖—抗體復合物填充入55×6mm層析柱中,即制成免疫親和柱。作平衡備用;B.飼料中黃曲霉毒素的分離與檢測方法1.樣品提取固體飼料經磨細,粒度小于2mm,準確稱取樣品50.0克,加入氯化鈉5.0克和甲醇100ml,用高速均質器高速攪拌1分鐘,然后定量濾紙過濾,準確移取10ml濾液,并用40ml蒸餾水共混均勻,再用玻璃纖維濾紙過濾,濾液備用。
2.試樣濾液凈化將AFT免疫親和柱連接于10ml玻璃注射器下,準確移取上述濾液(相當于1克樣品),注入玻璃注射器中,控制壓力使溶液以6ml/min的流速緩慢通過AFT免疫親和柱,直至2-3ml空氣通過柱體。以10ml蒸餾水淋洗柱子兩次,棄去全部流出液,再使2-3ml空氣通過柱體。然后準確加入10ml甲醇進行洗脫,流速為1-2ml/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中備用。
3.熒光光度計測定(1)熒光光度計校準在激發波長360nm,發射波長450nm條件下,以0.05mol/l硫酸溶液為空白,調節熒光光度計的讀數為0.0ug/L,即相當于0.0ug/L黃曲霉毒素;取熒光光度計校準溶液,以此來調節熒光光度計的讀數值為20ug/L,即相當于20ug/L黃曲霉毒素。熒光光度計校準溶液的配制為稱取3.4克硫酸奎寧,用0.05mol/L硫酸溶液溶解并定容至100ml,即得熒光光度計校準溶液。此校準溶液在熒光光度計上的讀數相當于20ug/L黃曲霉毒素標準溶液。
(2)測定取上述試樣洗脫液加入1.0ml0.002%溴衍生溶液,混合均勻后靜置1分鐘,立刻于熒光光度計上測定樣液中黃曲霉毒素AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,AFM1的總含量。飼料中黃曲霉毒素的檢測結果如表1所示表1飼料中AFT的檢測結果

從測定結果可以得出,所檢測飼料中的黃曲霉毒素的含量其平均值為3.43。且三個平行檢測的結果批間變異系數為1.7%,說明免疫親和柱性能穩定,完全可以實際檢測。
本發明中采用的免疫親和柱的回收效果良好,它具有較高的回收率,可以通過熒光光度計檢測免疫親和柱的回收效果,檢測方法如下將AFT混合標準品(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)以不同濃度添加到不含AFT的樣品中。根據國家標準GB/T18980-2003提取方法提取AFT,用本發明的免疫親和柱凈化后,在真菌毒素熒光分析儀上直接讀取AFT濃度結果,計算回收率,其結果如下表2所示表2熒光光度計檢測回收率結果添加AFT濃度(ng/g)次數 416 64熒光計實際測得值(ng/g)1 3.5 12.472 3.8 11.473 3.6 12 48平均值 3.63 11.67 47.33平均回收率(%) 90.7572.9 73.9變異系數(%) 4.2 5.01.2從上表檢測結果可知,其回收率均在70%以上,處于《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準》的范圍之內。由此表明本發明所采用的免疫親和柱完全可以滿足AFT快速檢測的需要。
權利要求
1.一種黃曲霉毒素的檢測方法,它是以單克隆抗體免疫親和柱為分離裝置,用熒光光度計為檢測工具的檢測方法,該方法的特征是具有以下檢測過程和步驟A.親和柱的準備和制備a.制備單克隆抗體,單克隆抗體的制備通過小鼠免疫、細胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株、采集單克隆抗體步驟來獲得,其主要步驟為(a).小鼠免疫以黃曲霉毒素B1(簡稱AFB1)和牛血清蛋白BSA的偶聯復合物為免疫原(抗原)免疫小鼠;用50ug/50ul抗原(AFB1-BSA)與50ul弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射每只10周齡BALB/C雄性小鼠,一個月后進行加強免疫,腹腔注射50ug/50ul抗原與弗氏不完全佐劑乳化后的抗原,再經過2個月后作最后一次免疫,采用尾靜脈注射劑量為50ug/50ul抗原,4天后取出小鼠的脾臟細胞,進行下一步的細胞融合;(b)細胞融合免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞X63-Ag8.653以10∶1混勻,借助50%聚乙二醇(PEG1500)進行融合,融合細胞用HAT選擇培養基于5%CO2,37℃培養箱中培養;7天后更換HT培養液,第10天進行陽性篩選;(c)雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株進行陽性孔篩選采用間接非競爭酶聯免疫吸附法與排除法結合的方法;將篩選得到的強陽性細胞進行有限稀釋克隆化,反復克隆多次,獲得多株能穩定分泌抗黃曲霉素AFT抗體的雜交瘤細胞株,對其中的2A12進行系統鑒定后待用;(d).采集單克隆抗體將上述2A12雜交瘤細胞株擴大培養后,注入預先注射有降植烷的小鼠腹腔內,使其生長腹水瘤;10天后采集腹水,該腹水中含有大量單克隆抗體;保存好該單克隆抗體備用;b.利用上述的單克隆抗體來制備免疫親和柱,其步驟如下(a)稱取適量溴化氰活化的的瓊脂糖干粉用1毫升1M的稀鹽酸使其溶脹,然后在燒結玻璃濾器上沖洗以除去雜質;(b).將溶脹后的瓊脂糖凝膠在偶聯緩沖液中與上述制備得到得單克隆抗體均勻混合,并在室溫下震蕩充分反應1小時,偶聯緩沖液由0.1M NaHCO3和0.5MNaCL配成,PH值為8.3;(c).除去未與瓊脂糖凝膠結合的游離抗體;(d).封閉瓊脂糖凝膠珠上殘余的活性基團,用0.1MPH值為8.0的Tris-HCl處理偶聯復合物,并靜置2小時;(e).用含有0..5MNaCl,PH值為4.0的0.1M乙酸緩沖液淋洗偶聯復合物一次,再用含有0.5MNaCl,PH值為8.0的0.1MTris-HCl緩沖液淋洗一次,如此循環反復清洗3次;(f).最后將瓊脂糖-抗體復合物填充入55×6mm層析柱中,即制成免疫親和柱。平衡備用;B.食品中黃曲霉毒素的分離與檢測方法稱取適量樣品,用一定比例的甲醇/水提取其中的AFT,經過過濾步驟并進行適當稀釋之后,將液體樣品流經親和柱達到凈化的目的,再用甲醇將親和柱上的AFT洗脫下來,在洗脫液中加入溴溶液衍生,提高檢測靈敏度,然后用熒光分光光度計測定樣液中黃曲霉毒素的含量。
全文摘要
本發明涉及一種黃曲霉毒素的檢測方法,更確切的說它是利用黃曲霉毒素單克隆抗體制備的免疫親和柱及熒光光度計來檢測食品中黃曲霉毒素的方法,屬生物細胞學及微生物菌類毒性代謝產物檢測方法技術領域。本發明方法的是首先制備制備單克隆抗體,單克隆抗體的制備要通過小鼠免疫、細胞融合、雜交瘤篩選及獲取雜交瘤細胞株、采集單克隆抗體等步驟來獲得,然后利用上述的單克隆抗體來制備免疫親和柱,最后將食品或飼料磨細后用甲醇/水溶液提取其中的黃曲霉毒素,經過過濾,將液體樣品流經親和柱達到凈化后,再用甲醇將親和柱上的AFT洗脫下來,然后用熒光分光光度計測定樣液中黃曲霉毒素的含量。
文檔編號G01N30/88GK1588068SQ200410054318
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月7日 優先權日2004年9月7日
發明者黎雙華, 陳宇光 申請人:上海大學
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