專利名稱：新型稀土熒光標記物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微量生理活性物質的測定技術，具體地說是一種新型稀土熒光標記物及其應用。
背景技術：
作為生體試料(細胞組織、血液、尿等)中微量生理活性物質的測定方法，免疫測定法、DNA雜交測定法等已廣泛應用于各種臨床測定中。在這些測定中均需使用某種標記物來標記抗體、抗原、核苷酸、核酸等物質。目前作為標記物使用的物質包括放射性元素、酶、熒光化合物、化學發光化合物等。它們的不足之處在于1)使用放射性標記物的方法，放射性標記物及其標記產品在儲藏、運輸、使用、廢液處理等方面存在許多的不便和麻煩，并可導致環境污染，而且放射性標記物的自身衰減問題，導致其可保存時間較短。2)使用酶標記物的方法，酶標記物的分子量太大，其活性極易受到溫度、保存條件、酸度、雜離子、防腐劑等的影響，導致該方法再現性較差。3)使用有機熒光標記物的測定方法在用于生體組織、血清等樣品測定時，由于激發光的散亂光和樣品產生的強本底熒光的影響，使該方法的靈敏度較低，只適用于高濃度物質的測定。
近年來稀土熒光配合物作為標記物的時間分辨熒光測定法已廣泛應用于各種測定中。稀土熒光配合物具有熒光壽命極長、Stokes位移大、熒光發光峰尖銳等特點，通過使用時間分辨熒光測定法，可非常有效地消除激發光的散亂光和樣品產生的本底熒光對熒光測定的影響，從而極大地提高測定靈敏度。目前的稀土熒光標記物及時間分辨熒光測定法包括(1)芬蘭Wallac公司開發的溶解增強時間分辨熒光測定法(簡稱DELFIA測定法)，文獻1E.Soini and T.Lovgren，CRC.Crit.Rev.Anal.Chem.，1987，18，105-154.文獻2E.P.Diamandis and T.K.Christopoulos，Anal.Chem.，1990，62，1149A-1157A.文獻3I.Hemmila，J.Alloys Compd.，1995，225，480-485。DELFIA測定法使用三價銪與N1-(p-異硫腈基苯基)-二乙基三胺四乙酸的配合物作為標記物來標識抗體、抗原等物質，當免疫反應結束后，由于該標記物是非熒光性銪配合物，所以在進行時間分辨熒光測定之前，必須要在反應體系中加入弱酸性的含有β-二酮類配位體、三辛基氧化膦及表面活性劑的所謂熒光增強溶液，使銪離子轉化為強熒光性配合物后才能進行測定。DELFIA測定法的靈敏度較高，其不足之處在于該法的熒光測定的溶液中含有大過量的β-二酮類配位體及三辛基氧化膦，極易受到測定環境、測定樣品及測定用溶液等中的金屬離子的污染，對測定操作環境及所用試劑要求極其嚴格；而且該體系只能進行液相熒光測定，其應用范圍受到很大限制。
(2)加拿大的Diamandis等人開發的FIAgen測定法，文獻4E.P.Diamandis，Clin.Biochem.，1988，21，139-150.文獻5E.F.G.Dickson，A.Pollakand E.P.Diamandis，Pharmacol.Ther.，1995，66，207-235。該測定法使用熒光性銪配合物4，7-二(氯磺酰基苯基)-1，10-啡羅啉-2，9-二羧酸(簡稱BCPDA)與Eu3+的配合物作為標記物來標識抗體、抗原等物質，當免疫反應結束后不需加入熒光增強溶液即可直接對免疫復合物進行時間分辨熒光測定。該法的缺點是BCPDA的銪配合物熒光較弱，測定靈敏度較低。
(3)法國的Mathis等人開發的TRACE測定法，文獻6G.Mathis，Clin.Chem.，1995，41，1391-1397.文獻7G.Mathis，J.Clin.Ligand Assay，1997，20，141-147。該法是同時使用三(聯二吡啶)窩穴體(簡稱TBP)與Eu3+的熒光配合物和藍藻蛋白(allophycocyanin)作為熒光標記物的均相時間分辨熒光測定法。其缺點是測定靈敏度較低并且試劑價格昂貴。
(4)用氯磺化β-二酮與銪的配合物作為標記物的時間分辨熒光測定法，文獻8J.Yuan，K.Matsumoto and H.Kimura，Anal.Chem，1998，70，596-601.文獻9松本和子，袁景利，日本公開特許公報，1997，特開平9-241233.文獻10K.Matsumoto and J.Yuan，United States Patent，1999，Patent number5859297.文獻11J.Yuan and K.Matsumoto，Bunseki Kagaku，1999，48，1077-1083。該法的測定靈敏度高、不需使用熒光增強溶液，其缺點是標記物水溶性差，不適用于小分子物質的標記。

發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏度高、適用范圍廣的新型稀土熒光標記物及其應用。
本發明技術方案是是以稀土離子與含有2，2’6’，2”-聯三吡啶骨架結構或2，6-二吡唑基吡啶骨架結構類配位體形成的熒光配合物，其所述配位體結構式為 當R1＝NH2，NCS，SO2Cl或 時R2＝OH當R1＝H時 或 當骨架結構下部為冠醚結構時，R1＝NH2，NCS，SO2Cl或 本發明的熒光配合物能廣泛用于制備標記蛋白質、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸及其它標記有機化合物；具體制備方法如下1)將待標記物溶于pH值9.1的0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液中后，加入熒光標記物的配位體，室溫下攪拌反應3小時后；2)通過透析或柱層析方法除去反應液中的未反應的標記物；3)收集已標記的溶液，加入稀土離子溶液(標記物∶稀土離子＝1∶1～1.5)后即制得所需的標記產物；制得的標記產物低溫下保存；當標記產物是標記抗體等蛋白質時，應在溶液中加入防腐劑(如NaN3)，和蛋白質活性穩定劑(如BSA)，然后低溫下保存；本發明的熒光配合物可在時間分辨熒光測定法中廣為應用；即利用所述新型稀土熒光標記物在時間分辨熒光測定法中標記待測物，通過測定熒光標記物的熒光強度或相對熒光強度比值來測定待測物的濃度；首先利用所述新型稀土熒光標記物標記一種反應原料(如抗體或抗原)，在標記反應原料與待測物反應之后，分離除去未反應的標記反應原料，然后通過時間分辨熒光測定法測定反應生成物的熒光強度來測定待測物的濃度，或首先利用所述新型稀土熒光標記物標記樣品中的待測物(如氨基酸，多肽，藥物等)，(利用某種分離方法如液相色譜，電泳等)將標記待測物與未反應的稀土熒光標記物分離后，通過時間分辨熒光測定法測定標記待測物的熒光強度來測定待測物的濃度；其中所述的時間分辨熒光測定法包括時間分辨熒光免疫測定法、時間分辨熒光免疫組織化學測定法、時間分辨熒光顯微鏡測定法、時間分辨熒光細胞活性測定法、時間分辨熒光液相色譜測定法和時間分辨熒光毛細管電泳測定法；本發明的熒光配合物也可在核酸(DNA和RNA)熒光測定法中應用；即利用所述新型稀土熒光標記物在核酸(DNA和RNA)熒光測定法中標記待測物，用時間分辨熒光儀測定其濃度；即利用所述新型稀土熒光標記物標記核酸包括核酸探針，核苷酸，寡核苷酸，在標記核酸與待測核酸(包括DNA和RNA)反應之后，分離除去未反應的標記核酸，然后通過時間分辨熒光測定法測定反應生成物的熒光強度來測定待測核酸的濃度；其中所述的核酸(DNA和RNA)熒光測定法為核酸雜交測定法、熒光PCR測定法、基因芯片測定法或分子信標測定法。
本發明具有如下優點1.本發明的新型稀土熒光標記物適用范圍廣。水溶性好；該類配合物可通過其含有的功能性基團與蛋白質、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸、有機化合物等物質形成共價鍵結合而標記這些物質，進而用于這些物質的時間分辨熒光測定；并且該類配合物還可于核酸(DNA和RNA)熒光測定法中。
2.本發明的新型稀土熒光標記物使用簡便。制得的新型配位體標記物不用進一步精制，可直接用于蛋白質等的標識。
3.本發明的新型稀土熒光標記物在固態或水溶態中均十分穩定。其熒光性質不受緩沖溶液組成等因素的影響。
4.本發明的新型稀土熒光標記物的熒光量子收率大。配合物的最大激發光波長在紫外區，其發光峰形狀均為稀土離子配合物特征的尖銳形發光峰。


圖1是TTTA-Eu3+在pH值9.1的0.05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光光譜，其濃度是1.0×10-6mol/L。
圖2是BTTA-Eu3+在pH值9.1的0.05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光光譜，其濃度是1.0×10-6mol/L。
圖3是TTTA-Eu3+和BTTA-Eu3+溶液的時間分辨熒光測定結果。其中溶劑為pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液。
圖4是使用TTTA-Eu3+標記鏈親和素的時間分辨熒光免疫測定法測定人血清中TSH的工作曲線。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明。
實施例1標記物4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸單N-羥基琥珀酰胺酯(簡稱NHS-TTTA)的合成。標記物NHS-TTTA由下面所示合成路線合成， 具體操作過程如下(1)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶(化合物1)的合成在500ml干燥甲醇中加入23.1克醋酸銨，16.3克N-[2-(pyrid-2’-yl)-2-oxoethyl]pyridinium iodide(N-[2-(2′-吡啶基)-2-氧代乙基]吡啶碘化物，50mmol)，和10.76克(E)-3-(2”-thenyl)-1-(pyrid-2’-yl)prop-2-enone((E)-3-(2″-噻吩基)-1-(2’-吡啶基)-2-丙烯酮，50mmol)，溶液攪拌下回餾24小時。反應液冷至室溫后，在-15℃放置1小時，過濾收集沉淀，用冷甲醇(-15℃左右)充分洗滌后，產品用乙腈重結晶。得目標化合物6.91克(43.8％收率)。1H NMR(CDCl3即氘代氯仿)測定結果8.74(d，J，7.9Hz，2H)，8.69(s，2H)，8.64(d，J，7.9Hz，2H)，7.87(t，J，7.9Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.44(d，J，5.1Hz，1H)，7.38-7.32(m，2H)，7.19-7.15(m，1H)。
(2)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶-1，1”-二氧化物(化合物2)的合成500ml二氯甲烷中加入12.61克化合物1(40mmol)和40克間氯過氧化苯甲酸，室溫下攪拌反應20小時后，反應液用200ml的10%碳酸鈉洗滌4次。有機相用無水硫酸鈉干燥后，蒸餾除去二氯甲烷。將產物溶于300ml甲醇中，過濾除去微量的不溶物，濾液減壓蒸餾除去甲醇后，產品用乙腈充分洗滌并真空干燥。得目標化合物8.53克(61.4％收率)。1HNMR(CDCl3)測定結果9.23(s，2H)，8.35(d，J，6.6Hz，2H)，8.23(d，J，7.9Hz，2H)，7.70(d，J，3.6Hz，1H)，7.45-7.28(m，5H)，7.16-7.13(m，1H)。
(3)6，6”-二腈基-4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶(化合物3)的合成在300ml二氯甲烷中加入8.69克化合物2(25mmol)和24.80克(CH3)3SiCN(250mmol)，室溫攪拌20分鐘后，攪拌下緩慢(約20分鐘)滴入14.05克苯甲酰氯(100mmol)。反應液室溫下攪拌20小時后，減壓蒸發溶劑至溶液體積為150ml，加入10％碳酸鉀水溶液600ml，繼續室溫下攪拌1小時。過濾收集沉淀，用水充分洗滌后，再用冷二氯甲烷(-15℃左右)洗滌，然后真空干燥。得目標化合物9.0克(98.5％收率)。1H NMR(DMSO-d6)測定結果8.95(d，J，7.9Hz，2H)，8.62(s，2H)，8.32-8.26(m，2H)，8.19(d，J，7.6Hz，2H)，8.07(d，J，3.6Hz，1H)，7.86(d，J，5.1Hz，1H)，7.28-7.31(m，1H)。
(4)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶-6，6”-二羧酸甲酯(化合物4)的合成將4.40克化合物3加入到45ml硫酸-45ml醋酸-12ml水的溶液中。75-80℃下攪拌反應48小時后，反應液加入到300ml冰水中，過濾收集沉淀，用水充分洗滌后，再用無水乙醇洗滌，真空干燥(得4.85克水解產物)。
在400ml干燥甲醇中，外部用冰水冷卻下加入8克氯化亞砜，攪拌15分鐘后，加入4.85克上述水解產物，反應液攪拌回餾8小時后，室溫下繼續攪拌16小時。蒸去溶劑后，生成物用氯仿反復抽提。氯仿溶液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌后，用無水硫酸鈉干燥。蒸去溶劑后，生成物用硅膠柱層析分離，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展開，收集最先洗出的第一個組分。蒸去溶劑后，產品用甲苯重結晶，真空干燥，得目標化合物2.50克(48.1％收率)。元素分析結果(％)，按C23H17N3O4S計算值C＝64.03，H＝3.97，N＝9.74；實測值C＝63.76，H＝3.83，N＝9.52。1H NMR(CDCl3)測定結果8.16(d，J，7.8Hz，2H)，8.78(s，2H)，8.20(d，J，7.6Hz，2H)，8.03(t，J，7.8Hz，2H)，7.82(d，J，3.6Hz，1H)，7.49(d，J，5.1Hz，1H)，7.22-7.19(m，1H)，4.08(s，6H)。
(5)6，6”-二羥甲基-4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶(化合物5)的合成在200ml干燥乙醇中加入2.89克化合物4(6.7mmol)和1.05克NaBH4，室溫下攪拌3小時后，攪拌回餾1小時。減壓蒸去乙醇，產物中加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌下加熱至沸騰。冷卻后過濾收集不溶物，用水洗滌后真空干燥。將產品加熱溶于200ml四氫呋喃中，過濾除去不溶物，減壓蒸去四氫呋喃后，產品用乙腈充分洗滌，真空干燥。得目標化合物1.82克(72.2％收率)。1H NMR(DMSO-d6)測定結果8.63(s，2H)，8.50(d，J，7.3Hz，2H)，8.03(t，J，7.3Hz，2H)，7.93(d，J，3.6Hz，1H)，7.82(d，J，5.1Hz，1H)，7.61(d，J，7.1Hz，2H)，7.28-7.31(m，1H)，4.74(s，4H)。
(6)6，6”-二溴甲基-4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶(化合物6)的合成在200ml干燥四氫呋喃-30ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中加入2.17克化合物5和4.75克三溴化磷，反應液攪拌回餾5小時后，減壓蒸去溶劑。將生成物溶入300ml氯仿，氯仿溶液用4×100ml(即四次每次使用100毫升)的10％Na2CO3水溶液洗滌4次后，用無水硫酸鈉干燥。過濾除去硫酸鈉，減壓蒸去氯仿溶液，產品用正已烷充分洗滌，真空干燥，得目標化合物2.02克(69.7％收率)。1H NMR(CDCl3)測定結果8.71(s，2H)，8.54(d，J，7.8Hz，2H)，7.87(t，J，7.8Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.52(d，J，7.8Hz，2H)，7.48(d，J，5.1Hz，1H)，7.21-7.19(m，1H)，4.70(s，4H)。
(7)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸四乙酯(化合物7)的合成在200ml干燥乙腈-50ml干燥四氫呋喃中加入2.04克化合物6(4mmol)，1.53克二乙酸乙酯基胺(8.1mmol)溶于30ml干燥乙腈的溶液和5.52克K2CO3(40mmol)，反應液攪拌回餾24小時后，過濾除去不溶物。減壓蒸去溶劑后，將生成物溶于200ml氯仿中，氯仿溶液用4×100ml飽和硫酸鈉水溶液洗滌后，用無水硫酸鈉干燥。過濾后溶液減壓蒸去溶劑，用石油醚洗滌后真空干燥。所得油狀物用硅膠柱層析分離，用乙酸乙酯-甲醇-四氫呋喃(w/w/w，10∶3∶2)展開，收集最先洗出的第一個組分。蒸去溶劑后，真空干燥。得目標化合物1.95克(67.9％收率)。1H NMR(CDCl3)測定結果8.67(s，2H)，8.51(d，J，7.8Hz，2H)，7.86(t，J，7.8Hz，2H)，7.78(d，J，3.6Hz，1H)，7.63(d，J，7.8Hz，2H)，7.45(d，J，5.1Hz，1H)，7.20-7.17(m，1H)，4.19(q，J，7.3Hz，8H)，3.72(s，8H)，3.46(s，4H)，1.26(t，J，7.3Hz，12H)。
(8)4’-(2-噻吩基)-2，2’6’，2”-聯三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸(簡稱TTTA)的合成將1.94克化合物7(2.7mmol)加入到120ml乙醇中，然后加入4克氫氧化鉀和10ml水，反應液攪拌回餾3小時。減壓蒸去溶劑，將生成物溶于150ml水中，過濾除去微量不溶物，向攪拌下的溶液中漫漫滴入的三氟乙酸水溶液至溶液的pH值約為1為止。溶液室溫下攪拌3小時后，過濾收集沉淀，用1％的三氟乙酸水溶液充分洗滌，真空干燥。將生成物加入到200ml乙腈中，攪拌回餾2小時，過濾收集沉淀，真空干燥。得目標化合物0.89克(51.4％收率)。元素分析結果(％)，按C29H31N5O9S(TTTA·2H2O)計算值C＝54.29，H＝4.87，N＝10.91；實測值C＝54.09，H＝4.57，N＝10.41。1H NMR(DMSO-d6)測定結果8.75(s，2H)，8.59(d，J，7.8Hz，2H)，8.18(t，J，7.8Hz，2H)，8.10(d，J，3.6Hz，1H)，7.87(d，J，5.1Hz，1H)，7.75(d，J，7.8Hz，2H)，7.34-7.31(m，1H)，4.72(s，4H)，4.28(s，8H)。
(9)NHS-TTTA的合成將TTTA·2H2O在P2O5真空干燥器中充分干燥后，取181.7mg(0.3mmol)溶于5ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌下加入34.5mg(0.3mmol)的N-羥基琥珀酰胺(NHS)和61.9mg(0.3mmol)的N，N’-二環己基炭化二亞胺(DCC)，室溫下攪拌24小時后，過濾除去不溶物。濾液減壓濃縮除去溶劑后，生成物用少量異丙醇洗滌，真空干燥。得目標化合物180mg(85.4％收率)。制得的NHS-TTTA不用進一步精制，可直接用于蛋白質等的標識。
實施例2標記物N，N，N1，N1-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶]四乙酸單N-羥基琥珀酰胺酯(簡稱NHS-BTTA)的合成標記物NHS-BTTA由下面所示合成路線合成， 具體操作過程如下(1)2，6-二溴-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物I)的合成在250ml乙酸中加入3.25克4-胺基-2，6-二溴吡啶(12.9mmol)和12.9克噻吩，攪拌溶解后，攪拌下滴加入1.93克亞硝酰異戊酯溶于13ml乙酸中的溶液。反應液室溫下攪拌24小時后，50℃下繼續攪拌反應3小時。減壓蒸去溶劑，生成物用40ml的10％碳酸鉀中和，用4×60ml的氯仿抽出生成物。氯仿溶液用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸去溶劑。生成物用硅膠柱層析分離，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展開，收集最先洗出的第一個組分。蒸去溶劑后，產品用甲醇重結晶兩次，真空干燥。得目標化合物1.97克(47.9％收率)。元素分析結果(％)，按C9H5NBr2S計算值C＝33.88，H＝1.58，N＝4.39；實測值C＝33.46，H＝1.46，N＝4.23。1H NMR(CDCl3)測定結果7.60(s，2H)，7.50-7.48(m，2H)，7.16-7.13(m，1H)。
(2)2，6-二(3’-羧酸甲酯-1’-吡唑基)-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物II)的合成在150ml干燥四氫呋喃中加入10.1克3-羧酸甲酯基吡唑(80mmol)，攪拌溶解后加入3.12克小塊的金屬鉀，溶液在60℃下攪拌反應至金屬鉀全部反應完后，加入6.38克的化合物I(20mmol)。反應液連續攪拌回餾7天后，減壓蒸去溶劑，生成物用6×150ml氯仿抽提可溶物。減壓蒸去溶劑，產品用硅膠柱層析分離，用二氯甲烷-甲醇(w/w，99∶1)展開，收集最先洗出的第一個組分。蒸去溶劑后，產品用苯重結晶，真空干燥。得目標化合物3.0克(36.7％收率)。元素分析結果(％)，按C19H15N5O4S計算值C＝55.74，H＝3.69，N＝17.10；實測值C＝55.47，H＝3.62，N＝16.82。1H NMR(CDCl3)測定結果8.60(d，J，2.7Hz，2H)，8.22(s，2H)，7.79(d，J，3.6Hz，1H)，7.53(d，J，5.0Hz，1H)，7.20-7.18(m，1H)，7.03(d，J，2.7Hz，2H)，4.01(s，6H)。
(3)2，6-二(3’-羥甲基-1’-吡唑基)-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物III)的合成在300ml干燥四氫呋喃中加入1.30克LiAlH4，然后加入2.72克化合物II(6.64mmol)，反應液室溫下攪拌4小時后，慢慢滴入1.1ml水，1.1ml的15％氫氧化鈉及4.5ml水。室溫下攪拌30分鐘后，過濾除去沉淀，用3×100ml四氫呋喃抽提沉淀中的可溶物，合并四氫呋喃溶液。減壓蒸去溶劑后，產品用乙腈充分洗滌，真空干燥，得目標化合物1.60克(68.2％收率)。1H NMR(DMSO-d6)測定結果8.88(d，J，2.6Hz，2H)，7.96(d，J，3.6Hz，1H)，7.90(s，2H)，7.85(d，J，5.1Hz，1H)，7.29-7.26(m，1H)，6.60(d，J，2.5Hz，2H)，4.58(s，4H)。
(4)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-(2’-噻吩基)吡啶(化合物IV)的合成在200ml干燥四氫呋喃中加入1.59克化合物III(4.50mmol)，攪拌溶解后加入3.65克PBr3，反應液攪拌回餾4小時后，減壓蒸去溶劑。生成物中加入100ml的10％碳酸鈉溶液，充分攪拌后用氯仿抽出生成物。氯仿溶液中再加入6克固體的碳酸氫鈉，室溫下攪拌1小時后，加入無水硫酸鈉干燥。過濾后減壓蒸餾除去溶劑，產品用正己烷充分洗滌，真空干燥，得目標化合物2.03克(94.1％收率)。1H NMR(CDCl3)測定結果8.50(d，J，2.7Hz，2H)，8.02(s，2H)，7.72(d，J，3.6Hz，1H)，7.50(d，J，5.1Hz，1H)，7.19-7.16(m，1H)，6.56(d，J，2.7Hz，2H)，4.59(s，4H)。
(5)N，N，N1，N1-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶]四乙酸四乙酯(化合物V)的合成在100ml干燥乙腈-30ml干燥四氫呋喃中加入1.20克化合物IV(2.50mmol)，984mg的二乙酸乙酯基胺(5.2mmol)溶于30ml干燥乙腈的溶液和3.45克K2CO3(25mmol)，反應液攪拌回餾24小時后，過濾除去不溶物。減壓蒸去溶劑，將生成物溶于200ml氯仿中，氯仿溶液用2×100ml水洗滌后，用無水硫酸鈉干燥。過濾后溶液減壓蒸去溶劑，真空干燥。所得油狀物用硅膠柱層析分離，用乙酸乙酯-二氯甲烷(w/w，100∶10)展開，收集最先洗出的第一個組分。蒸去溶劑后，真空干燥。得目標化合物0.87克(50.0％收率)。1H NMR(CDCl3)測定結果8.51(d，J，2.7Hz，2H)，8.00(s，2H)，7.72(d，J，3.6Hz，1H)，7.49(d，J，5.1Hz，1H)，7.19-7.16(m，1H)，6.56(d，J，2.7Hz，2H)，4.20(q，J，7.2Hz，8H)，4.09(s，4H)，3.66(s，8H)，1.28(t，J，7.2Hz，12H)。
(6)N，N，N1，N1-[2，6-二(3’-胺甲基-1’-吡唑基)-4-(2”-噻吩基)吡啶]四乙酸(簡稱BTTA)的合成將850mg的化合物V(1.22mmol)加入到60ml乙醇中，然后加入1.8克氫氧化鉀和7ml水，反應液攪拌回餾3小時。減壓蒸去溶劑，將生成物溶于50ml水中，過濾除去微量不溶物，向攪拌下的溶液中漫漫滴入的鹽酸水溶液至溶液的pH值約為1為止。溶液室溫下攪拌3小時后，過濾收集沉淀，用100倍稀釋的濃度37％的鹽酸水溶液充分洗滌，真空干燥。得目標化合物660mg(92.6％收率)。元素分析結果(％)，按C25H27N7O9S(BTTA·H2O)計算值C＝49.92，H＝4.52，N＝16.29；實測值C＝50.08，H＝4.38，N＝16.09。1H NMR(DMSO-d6)測定結果8.90(d，J，2.5Hz，2H)，7.98(d，J，3.6Hz，1H)，7.90(s，2H)，7.86(d，J，5.1Hz，1H)，7.30-7.27(m，1H)，6.59(d，J，2.5Hz，2H)，4.00(s，4H)，3.52(s，8H)。
(7)NHS-BTTA的合成將BTTA·H2O在P2O5真空干燥器中充分干燥后，取175.0mg(0.3mmol)溶于5ml干燥N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌下加入34.5mg(0.3mmol)的N-羥基琥珀酰胺(NHS)和61.9mg(0.3mmol)的N，N’-二環己基炭化二亞胺(DCC)，室溫下攪拌24小時后，過濾除去不溶物。濾液減壓濃縮除去溶劑后，生成物用少量異丙醇洗滌，真空干燥。得目標化合物172mg(84.2％收率)。制得的NHS-BTTA不用進一步精制，可直接用于蛋白質等的標識。
實施例3TTTA和BTTA與稀土離子(Eu3+和Tb3+)配合物熒光性質測定1.熒光光譜、熒光強度及熒光壽命在水溶液中TTTA及BTTA與稀土離子混合后可迅速形成穩定的配合物。用pH值9.1的0.05mol/L硼酸緩沖溶液為溶劑測定了TTTA-Eu3+、TTTA-Tb3+及BTTA-Eu3+、BTTA-Tb3+在該溶劑中的紫外可見光譜、熒光光譜、摩爾吸光系數(ε)、熒光量子收率(φ)及熒光壽命(τ)。紫外可見光譜測定用儀器為天美UV7500分光光度計。熒光測定用儀器為Perkin Elmer LS 50B熒光分光光度計。量子收率測定使用4’-苯基-2，2’6’，2”-聯三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸與Eu3+和Tb3+的配合物作為標準物測得(其Eu3+配合物的ε335nm＝14300，φ＝0.160，Tb3+配合物的ε337nm＝14000，φ＝0.100)文獻12M.Latva，H.Takalo，V.-M.Mukkala，C.Matachescu，J.C.Rodriguez-Ubis and J.Kankare，J.Lumin.，1997，75，149-169，計算式為φ1＝I1ε2C2φ2/I2ε1C1，式中I2、ε2、φ2、C2為標準物的熒光強度、摩爾吸光系數、量子收率和濃度，I1、ε1、φ1、C1為待測物的熒光強度、摩爾吸光系數、量子收率和濃度。表1所示為兩種配位體及其配合物在pH值9.1的0.05mol/L硼酸緩沖溶液中的吸收及熒光性質。
表1.幾種化合物在pH值9.1的0.05mol/L硼酸緩沖溶液中的吸收及熒光性質

由表1可看出，TTTA-Eu3+和BTTA-Eu3+均為強熒光性化合物，并且具有非常長的熒光壽命，而TTTA-Tb3+和BTTA-Tb3+僅為弱熒光性化合物。
如圖1、2所示，兩種配合物的最大激發光波長均在紫外區，其最大熒光發光波長分別在615nm和620nm，其發光峰形狀均為Eu3+配合物特征的尖銳形發光峰。
2.緩沖溶液pH值對配合物熒光性質的影響用不同pH值的0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液為溶劑，測定了不同pH值下TTTA-Eu3+的熒光強度和熒光壽命，其結果見表2。測定結果表明，在pH值為9-5.8的變化范圍內，TTTA-Eu3+的熒光強度和熒光壽命受pH值的影響不大。另外在Tris-HCl和硼酸鹽緩沖溶液中測得的TTTA-Eu3+的熒光強度和熒光壽命幾乎相同，說明TTTA-Eu3+在這些緩沖溶液中有很高的穩定性，其熒光性質不受緩沖溶液組成的影響。
表2 pH值變化對TTTA-Eu3+熒光性質的影響

3.使用TTTA-Eu3+和BTTA-Eu3+進行時間分辨熒光測定的靈敏度用pH值8.0的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液為溶劑，配制系列濃度的TTTA-Eu3+和BTTA-Eu3+溶液，通過時間分辨熒光測定確定了使用TTTA-Eu3+和BTTA-Eu3+進行時間分辨熒光測定的靈敏度。測定用儀器為WALLAC VICTOR 1420多標記計數儀(PerkinElmer Life Sciences公司產)，測定條件為激發波長，340nm；檢測波長，615nm；遲延時間(delay time)，0.2ms；窗口時間(window time)，0.4ms；循環時間(cycling time)1.0ms。
如圖3所示，用本底信號標準偏差的2倍計算最低檢出下限，得TTTA-Eu3+和BTTA-Eu3+溶液的時間分辨熒光測定最低檢出下限分別為TTTA-Eu3+，1.3×10-12mol/L，BTTA-Eu3+，1.4×10-12mol/L。說明使用兩者的時間分辨熒光測定均具有非常高的靈敏度。
實施例4使用NHS-TTTA-Eu3+標記鏈親和素將5mg的鏈親和素溶于10ml的pH值9.1的0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液中后，加入10mg的NHS-TTTA，室溫下攪拌反應3小時后。溶液在4℃下對3升的含有0.25克NaN3(迭氮鈉)的0.1mol/L碳酸氫鈉溶液進行三次透析，每次24小時，除去未反應的標記物。透析后取少量溶液用標準EuCl3溶液(濃度為1.0×10-5mol/L)進行熒光滴定確定溶液中TTTA的濃度，然后計算標記率(TTTA濃度與鏈親和素濃度的比值)。該法制得的標記鏈親和素的標記率為20。所得溶液中加入EuCl3溶液(Eu3+∶TTTA＝1.5∶1)后，即得到TTTA-Eu3+標記鏈親和素溶液。該溶液中加入20mg的牛血清白蛋白(BSA)和25mg的NaN3后，-20℃下冷凍保存。
在上述溶液用于時間分辨熒光免疫分析時，用含有0.2％BSA、0.9％NaCl和0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液稀釋1000倍后使用。
實施例5使用NHS-BTTA-Eu3+標記鏈親和素將5mg的鏈親和素溶于10ml的pH值9.1的0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液中后，加入10mg的NHS-BTTA，室溫下攪拌反應3小時后。用Sephadex G-50柱分離已標記的鏈親和素和未反應的標記物，用0.05mol/L的NH4HCO3溶液作為洗出溶液，每1.5ml分收，測定各分收溶液在280nm的吸光度，合并洗出的標記蛋白質溶液。取少量標記蛋白質溶液用標準EuCl3溶液(濃度為1.0×10-5mol/L)進行熒光滴定確定溶液中BTTA的濃度，然后計算標記率。該法制得的標記鏈親和素的標記率為18。所得溶液中加入EuCl3溶液(Eu3+∶BTTA＝1.5∶1)后，即得到BTTA-Eu3+標記鏈親和素溶液。該溶液中加入20mg的BSA和25mg的NaN3后，-20℃下冷凍保存。
實施例6使用TTTA-Eu3+標記鏈親和素的時間分辨熒光免疫測定法測定人血清中的促甲狀腺素(TSH)1.生物素標記抗人TSHα-亞單元單克隆抗體的制備按文獻13J.Yuan，G.Wang，H.Kimura and K.Matsumoto，Anal.Sci.，1998，14，421-423中方法制備。在用于時間分辨熒光免疫分析時，用含有0.2％BSA、0.9％NaCl和0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液稀釋到所需濃度后使用。
2. 96微孔板的包被在96微孔板(Fluoro Nunc微孔板)的各孔中加入60微升的抗人TSHβ-亞單元單克隆抗體(10微克/毫升，Mitsubishi Chem.Co.產品)的pH值9.6的0.1mol/L碳酸氫鈉溶液后，4℃下放置24小時。棄去溶液后，各孔用含有0.05％吐溫20的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗滌兩次，再用pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗滌一次，即得到抗人TSHβ-亞單元單克隆抗體包被的96微孔板。
3.人血清TSH的測定在上述包被后孔板的孔中，加入50微升的TSH標準溶液(TSH標準溶液具體濃度是，100，10，1，0.1，0.01，0.00mIU/L)系列和人血清樣品，37℃下放置1小時后，棄去溶液，各孔用含有0.05％吐溫20的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗滌兩次，再用pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗滌一次。向各孔中加入50微升的生物素標記抗人TSHα-亞單元單克隆抗體溶液(溶液濃度參照文獻13配制即可)，37℃下放置1小時后，棄去溶液，各孔用含有0.05％吐溫20的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl溶液洗滌兩次，再用pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl溶液洗滌一次。向各孔中加入50微升的TTTA-Eu3+標記鏈親和素溶液，37℃下放置1小時后，棄去溶液，各孔用含有0.05％吐溫20的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl溶液洗滌4次后，進行固相時間分辨熒光測定。測定用儀器為WALLAC VICTOR 1420多標記計數儀，測定條件為激發波長，340nm；檢測波長，615nm；遲延時間(delay time)，0.2ms；窗口時間(window time)，0.4ms；循環時間(cycling time)1.0ms。
如圖4所示，用零濃度時的熒光信號(本底)的標準偏差的2倍計算TSH測定的最低檢出下限，得本法的最低檢出下限為0.09mIU/L。
2，2’6’，2”-聯三吡啶骨架結構和2，6-二吡唑基吡啶骨架結構與冠醚形成配位體的合成路線如下
權利要求
1 一種新型稀土熒光標記物，其特征在于是以稀土離子Eu3+，Sm3+，Gd3+，Tb3+，Dy3+與含有2，2’6’，2”-聯三吡啶骨架結構或2，6-二吡唑基吡啶骨架結構類配位體形成的熒光配合物；其中所述配位體結構式為 當R1＝NH2，NCS，SO2Cl或 時R2＝OH當R1＝H時 或 當骨架結構下部為冠醚結構時，R1＝NH2，NCS，SO2Cl或
2.一種根據權利要求1所述新型稀土熒光標記物的應用，其特征在于利用所述新型稀土熒光標記物制備標記蛋白質、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸及其它標記有機化合物，具體制備方法如下1)將待標記物溶于pH值9.1的0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液中后，加入熒光標記物的配位體，室溫下攪拌反應3小時后；2)通過透析或柱層析方法除去反應液中的未反應的標記物；3)收集已標記的溶液，加入稀土離子溶液后即制得所需的標記產物，其標記物∶稀土離子＝1∶1～1.5。
3.一種根據權利要求1所述新型稀土熒光標記物的應用，其特征在于首先利用所述新型稀土熒光標記物標記一種反應原料，在標記反應原料與待測物反應之后，分離除去未反應的標記反應原料，然后通過時間分辨熒光測定法測定反應生成物的熒光強度來測定待測物的濃度；或首先利用所述新型稀土熒光標記物標記樣品中的待測物，將標記待測物與未反應的稀土熒光標記物分離后，通過時間分辨熒光測定法測定標記待測物的熒光強度來測定待測物的濃度。
4.根據權利要求3所述的標記物的應用，其特征在于其中所述的時間分辨熒光測定法為時間分辨熒光免疫測定法、時間分辨熒光免疫組織化學測定法、時間分辨熒光顯微鏡測定法、時間分辨熒光細胞活性測定法、時間分辨熒光液相色譜測定法或時間分辨熒光毛細管電泳測定法。
5.一種根據權利要求1所述新型稀土熒光標記物的應用，其特征在于利用所述新型稀土熒光標記物標記核酸，在標記核酸與待測核酸反應之后，分離除去未反應的標記核酸，然后通過時間分辨熒光測定法測定反應生成物的熒光強度來測定待測核酸的濃度。
6.根據權利要求5所述的標記物的應用，其特征在于其中所述的核酸熒光測定法為核酸雜交測定法、熒光PCR測定法、基因芯片測定法或分子信標測定法。
全文摘要
本發明涉及一種新型稀土熒光標記物及其應用。新型稀土熒光標記物是稀土離子Eu
文檔編號G01N33/533GK1407052SQ0112807
公開日2003年4月2日 申請日期2001年8月22日 優先權日2001年8月22日
發明者袁景利, 譚明乾, 王桂蘭 申請人:中國科學院大連化學物理研究所