專利名稱：單倍體基因組用于遺傳診斷、修飾和增殖的制作方法
技術領域：
本發明涉及單倍體基因組的增殖和應用，目的在于(1)遺傳診斷；(2)遺傳選擇；和(3)遺傳修飾。所選擇的單倍體基因組在與另一種單倍體基因組、優選一種具有所需遺傳組成的單倍體基因組合時可用于生產胚胎和胚胎干細胞。
背景技術：
配子是通過減數分裂產生的特定的單倍體細胞(例如精子和卵母細胞)且涉及有性生殖。相反，二倍體細胞具有同源配對的染色體且帶有每種常染色體遺傳基因座的兩個拷貝。二倍數(2n)等于單倍數的2倍且是大多數細胞而非配子的特征數。合子是因受精過程中雄性和雌性配子融合而產生的二倍體細胞。參見《細胞生物學詞典》(THEDICTIONARY OF CELL BIOLOGY)103，139，388(J.M.Lackie等，編輯，1995)。僅(二倍體)合子能夠產生存活的后代。相反，盡管單倍體配子有可能產生屬于雌性衍生的單倍體細胞(卵母細胞)的孤雌發育的胚胎，但是這些胚胎一般在胚胎發生完成前終止發育。這類胚胎可以自發產生，但更一般的情況是通過對卵母細胞進行人工活化來產生。這類雌核發育胚胎可用于研究胚胎發生。
以前曾經報導了合適單倍體衍生的多能細胞系的生產。例如，據推定通過從129 SvE或C57BL x CBA雜種小鼠中獲得卵并在與7％乙醇的磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液接觸后以孤雌生殖方式將其活化來生成所述的多能單倍體細胞。然而，在檢查這些早期傳代的″單倍體″細胞系的染色體時，所有的細胞均為帶有40條染色體模態數的二倍體(Kaufman等，《胚胎學和形態學實驗雜志》(J.Embryol.Exp.Morphol.)73249-61(1983))。
盡管已經充分報導了哺乳動物胚胎可以由單倍體基因組產生，但是尚未將這類哺乳動物胚胎用于遺傳分析。相反，就本發明者所了解到的情況而言，通常使用顯然正常的(二倍體)胚胎在子宮內或子宮外進行產前遺傳診斷。然而，子宮內的遺傳診斷是侵害性的且對發育中的胎兒而言可能存在危險性(例如羊膜腔穿刺術和絨毛膜取樣)。可以使經診斷患有疾病的胎兒流產或孕育至分娩期，因為子宮內手術和基因療法仍然具有很高的風險性和實驗性。
在人體中，一般對通過體外受精(IVF)技術產生的胚胎進行子宮外遺傳診斷。一般從最新的胚胎中取1個或2個細胞并檢測諸如囊性纖維化(CF)、性連鎖疾病、染色體異常、脆性X染色體綜合征、脊柱肌肉萎縮和強直性肌營養不良這樣的疾病(de Die-Smulders等，Ned.Tijdschr.Geneeskd.1422441-4(1998))。可以使用聚合酶鏈反應(PCR)或嵌套式PCR進行植入前遺傳診斷(PGD)以便診斷CF常見的ΔF508突變(Cui等，《人體生殖分子學》(Mol.Hum.Reprod.)263-1(1996)；和Ao等，《產前診斷》(Prenat.Diagn.)16137-42(1996))以及其它疾病(Ben-Ezra，《臨床實驗室醫學》(Clin.Lab.Med.)1595-815(1995))。還可以通過對獼猴卵裂早期胚胎血型分型進行單個卵裂球活檢(RhD)(Avner等，《人體生殖分子學》(Mol.Hum.Reprod.)260-2(1996))或通過胚泡活檢(Verlinsky等，Bailieres Clin.Obstet.Gynaecol.8177-96(1994))來進行遺傳篩選。可以將原位致敏標記(PRINS)和原位雜交用于為PGD檢測人染色體的異常(Pellestor等，《人體生殖分子學》(Mol.Hum.Reprod.)2135-8(1996))。還使用熒光原位雜交(FISH)進行了PGD以便防止因具有單倍體X的精子(隨后發生復制)與失活卵母細胞受精而產生的胎塊發育(Reubinoff等，《人體生殖》(Hum.Reprod.)12805-8(1997))。可以對卵母細胞進行PGD以便通過第一極體分析來診斷單一基因病癥并鑒定含有母體未受影響的基因的卵母細胞(Verlinsky等，《生物化學與分子醫學》(Biochem.Mol.Med.)62182-7(1997)；Verlinsky等，《最新產科學與婦科學觀點》(Curr.Opin.Obstet.Gynecol.)4720-5(1992)；和Verlinsky等，《人體生殖》(Hum.Reprod.)5826-9(1990))。在一種情況中，通過稀釋和顯微操作使有兩個具有成骨不全受侵染嬰兒的父代的各個精子分離。使用嵌套式PCR來擴增含有所述突變的I型膠原蛋白基因的片段并測序以便檢測野生型基因和帶有單一點突變的基因(Iida等，《人體生殖分子學》(Mol.Hum.Reprod.)2131-4(1996))。就應用胞質內精子注射技術(ICSI)而言，已經研發了選擇精子的方法(Meschede等，《人體生殖》(Hum.Reprod.)102880-6(1995))。對第一和第二極體的序列分析和多樣PCR可以比通過單細胞DNA分析遇到的易產生的錯誤獲得更精確的遺傳診斷(Richitsky等，J.Assist.Reprod.Genet.16192-8(1999)).
遺傳篩選的其它方法包括限制片段長度多態性(RFLPs)、串聯重復(VNTR)序列和二核苷酸或其它短串聯重復(STR)序列的可變數量的檢測或改變。另一方面，使用與野生型或突變體序列互補的引物進行等位基因特異性擴增和等位基因特異性連接，為檢測特異性突變提供了兩種選擇方式。還有其它方法可用于篩選突變的存在情況而不鑒定特異性突變自身。這些方法包括單鏈構象多態(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和通過酶(RNA酶A)或化學(哌啶)方式進行的錯配裂解分析。參見Fujimura，《分子生物學和生物技術綜合參考書》(MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGYA COMPREHENSIVE DESKREFERENCE)中的“遺傳測試(″Genetic Testing″)，374-379(RobertA.Meyers，編輯，1995)。
因此，以上述為基礎，顯然盡管在使植入前遺傳篩選和體外生成的胚胎操作完善方面正在取得進展，但是在對配子進行遺傳篩選或對用于生產轉基因動物的配子進行遺傳操作方面幾乎沒有取得任何進展。
因此，盡管文獻中預先報導了什么內容，對配子遺傳篩選的改進方法和遺傳加工單倍體細胞用于生產轉基因動物仍存在需求。
本發明的概括和目的本發明的一個方面提供了一種選擇用于生產胚胎、胚胎干細胞或胚胎種系細胞的基因組的方法，該方法包括下列步驟(i)培養含有雄性或雌性衍生的單倍體遺傳組成的細胞；(ii)將所述培養細胞的遺傳組成進行遺傳測試以便鑒定所述單倍體基因組是否包括遺傳缺陷、所需基因或缺乏功能基因；和(iii)選擇不包括遺傳缺陷的細胞或選擇含有所需基因或缺乏功能基因的細胞。
特別就雌性衍生的單倍體細胞而言，可以通過5種方法之一獲得該細胞(1)對其中一半染色體排出在極體中的卵母細胞進行激活；(2)通過使卵受精并從其中除去雄性原核；(3)通過活化卵以便產生含有兩個雌性原核的卵并除去所述原核之一；(4)通過將二倍體細胞核插入不成熟的卵母細胞，隨后使所述染色體分入兩個單倍體核；和(5)通過將單性胚胎(含有半數染色體，但增殖全部DNA成分即4條染色單體)的核轉入卵母細胞且隨后從其中排出半數染色體。
本發明的另一個目的涉及可以通過下列方法之一獲得的雄性衍生的單倍體細胞的篩選方法(1)從除去雌性原核的受精卵中獲得雄性衍生的單倍體細胞；(2)通過使去核的卵受精而獲得雄性衍生的單倍體細胞；和(3)通過對精核進行人工解凝、然后將其注入非卵衍生的胞質體而獲得雄性衍生的單倍體細胞。
本發明的另一個目的是一種增殖雄性或雌性衍生的單倍體細胞的方法，該方法通過選自的方法來進行(i)使單倍體卵胞質體進行細胞分裂；(ii)使單倍體細胞產生單倍體胚胎，然后將這種胚胎培養成″增殖單倍體″細胞；(iii)將單倍體胚胎培養產生單倍體的胚胎干細胞樣細胞并使這類胚胎于細胞樣細胞分化；和(iv)在使細胞分裂的條件下培養單倍體體細胞胞質體。
本發明的另一個目的是提供雄性或雌性來源的增殖單倍體基因組細胞系、即包括所需遺傳組成或包括所需遺傳修飾的細胞系。
本發明的另一個目的是提供由單倍體細胞系產生的多能或胚胎干細胞樣細胞和由其來源的分化細胞，它們包括所需遺傳組成、例如包括所需的遺傳修飾。
本發明的另一個目的是提供由遺傳修飾或選擇的單倍體雄性和/或雌性基因組產生的二倍體哺乳動物胚胎以及由其來源的多能細胞系和分化細胞。
定義本發明涉及通過任意方法進行的含有雄性或雌性衍生的單倍體染色體組成的細胞的生產和增殖方法、這些細胞在特異性單倍體基因組的遺傳評價、遺傳修飾或增殖中的應用以及這些細胞在生產具有DNA的二倍體組成的胚胎中的應用。所增殖、篩選和/或修飾的單倍體基因組包括下列動物的單倍體基因組有蹄類動物，諸如牛、綿羊、豬、馬、山羊；犬、貓、鼠、家兔和嚙齒動物(例如豚鼠、倉鼠和大鼠)；人、非人靈長目，諸如獼猴、黑猩猩、狒狒和大猩猩。
所謂″遺傳篩選″、″遺傳診斷″、″遺傳分析″和″遺傳測試″指的是通過常規方法分析單倍體基因組以便檢測存在或不存在與表型、疾病或疾患相關的特異性DNA。這類方法包括原位雜交、聚合酶鏈反應、嵌套式聚合酶鏈反應、熒光檢測法、RFLP分析VNTR或STR檢測法(其中篩選大量串聯重復二核苷酸或其它短串聯重復(STR)序列的用法)、單鏈構象多態性(SSCP)分析、指示梯度凝膠電泳(DGGE)和錯配裂解分析、即通過酶(RNA酶A)或化學(哌啶)方式而進行的裂解分析。這類方法綜述在Fujimura，《分子生物學和生物技術綜合參考書》(MOLECULARBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGYA COMPREHENSIVE DESK REFERENCE)中的“遺傳測試”(″Genetic Testing″)，374-379(Robert A.Meyers，編輯，1995)中。
所謂″遺傳選擇″指的是使用遺傳測試對基因型進行的定向選擇。
所謂″遺傳修飾″或″遺傳操作″指的是對細胞、一般是單倍體細胞的基因組進行的修飾。它包括插入、缺失和取代這樣的修飾。優選在基因組中的靶位點上進行修飾。在一個優選的實施方案中，最終將修飾的單倍體細胞用于核移植以便產生表達所修飾/操作的基因的動物。
所謂″增殖″指的是增加包括所需雄性或雌性來源的單倍體基因組的細胞數。
所謂″單倍體細胞″指的是帶有單倍體數量(n)染色體的細胞。″配子″是通過減數分裂產生并涉及有性生殖的特化單倍體細胞(例如精子和卵母細胞)。″二倍體細胞″具有同源配對的染色體并帶有每種常染色體遺傳基因座的兩個拷貝(2n)。″合子″是因受精過程中雄性和雌性配子融合產生的二倍體細胞。
術語″核轉移″或″核移植″指的是一種克隆方法，其中將來自供體細胞的核移植入去核的卵母細胞。已知核轉移技術或核移植技術公開在文獻中(Campbell等，《動物生殖學》(Theriogenology)43181(1995)；Collas等，《生殖與發育分子學》(Mol.Reprod.Dev.)38264-267(1994)；Keefer等，《生物學與生殖》(Biol.Reprod.)50935-939(1994)；Sims等，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)906143-6147(1993)；Evans等，WO 90/03432(1990年4月5日)；Smith等，WO 94/24274(1994年10月27日)；Wheeler等，WO 94/26884(1994年11月24日))。另外，美國專利號US 4,994,384和US 5,057,420中描述了用于牛核移植的步驟。另外參見美國專利號US 5,945,577；WO 97/06668和WO 97/06669，受讓人或申請人的名稱分別為The University of Massachusetts和Roslin Institute。將該專利和申請引入本文作為參考。在本申請中，核轉移或核移植或NT可以互換使用。本定義還包括植入一個或兩個選擇的單倍體基因組以便產生胚胎的過程。
所謂″缺乏功能基因″指的是整個基因從本發明主題的基因組中缺失或該基因突變至它不再起作用(例如產生野生型蛋白)的程度。
所謂″遺傳缺陷″指的是核酸缺失或插入，相當于基因轉錄、基因mRNA翻譯成蛋白質的改變、蛋白質或基因mRNA的半衰期改變或該基因野生型表達的其它改變。給定基因的不同形式稱作″等位基因″。基因的″野生型等位基因″是那些在天然群體中以相對高的頻率存在并產生野生型或正常表型的等位基因。產生異常或非野生型表型的基因的等位基因是″突變體等位基因″。
所謂″增殖單倍體細胞系″指的是在單倍體細胞宿主生物體外通過人工方式產生的增殖單倍體細胞的細胞系。一般來說，這類單倍體細胞系包含在體外培養物中。另一方面，例如可以通過注入SKID小鼠以產生分化細胞類型使單倍體細胞增殖。
發明詳述如上所述，本發明涉及單倍體基因組的生產和增殖方法、通過遺傳分析從所述增殖單倍體基因組中選擇所需單倍體基因組和所述選擇的單倍體基因組在生產二倍體胚胎中的應用。正如本申請背景技術中所述，已知將對植入前胚胎進行遺傳評價作為選擇適合于移植和產生后代的胚胎的方式。這類方法包括在植入前對所述胚胎的一個或多個細胞的基因組進行遺傳評價。
然而，這類方法可能產生倫理問題，即胚胎受到操作，且如果它表現出不需要的遺傳特性，那么將會被破壞。最特別的情況是，就人植入前胚胎而言，這類方法可能產生倫理問題、尤其是通過核轉移或常規體外受精產生的那些人體胚胎而言更是如此。
相反，本發明通過對單倍體細胞基因組進行遺傳測試而選擇用于生產二倍體胚胎的單倍體DNA。由于單倍體細胞不能產生存活后代，因此這類方法不會產生相同的倫理憂慮。因此，棄去不理想的單倍體基因組或對單倍體基因組操作避免了與操作和破壞二倍體胚胎、例如人二倍體胚胎相關的倫理問題。
因為本發明包括對單倍體基因組進行遺傳測試，所以需要這類單倍體基因組的增殖來源。這種情況最初需要構建或獲得含有單倍體基因組的細胞并要求其增殖。
可以使用生產含有雄性或雌性單倍體基因組的細胞的各種方法。例如，根據實例，生產含有雌性來源的單倍體基因組的單倍體細胞的方法包括下列步驟(i)在體外活化卵母細胞，其中半數染色體被排出在極體中；(ii)使卵受精并除去雄性原核；(iii)在體外活化包括兩個雌性原核的卵并從其中除去所述原核之一；(iv)將二倍體細胞核插入未成熟的卵母細胞并將所述染色體分入兩個單倍體核；和(v)將包含半數染色體、但增殖全部DNA成分即四條染色單體的的孤雌生殖核轉移入卵母細胞并從其中排出一半染色單體。
在上述方法中，優選(i)、(iii)、(iv)和(v)，因為這些方法在任何情況下均不會產生其中半數其DNA組成屬于雄性來源且另一半屬于雌性來源的二倍體胚胎。因此，即使將它們植入，它們也不能夠發育成足月后代。
用于提供雄性來源單倍體基因組的方法包括(i)使卵受精并除去雌性原核；(ii)使去核的卵母細胞受精；和(iii)將精子核進行人工解凝并注入非卵衍生的胞質體。
可以通過各種方法增殖上述單倍體細胞和其它單倍體細胞。例如，可以通過誘導卵胞質體的分裂來增殖單倍體基因組。另一方面，可以將單倍體胚胎用于胚胎干細胞樣細胞的生產中。這可以通過使用已知培養基和用于維持培養中的胚胎的方法培養所述胚胎并培養內細胞團或來源于其中的細胞來進行該步驟，以便產生胚胎干細胞樣細胞。例如，可以通過將內細胞團或單倍體基因組衍生胚胎的內細胞團細胞置于飼養層、例如鼠胎兒成纖維細胞上來進行該步驟以便產生含有胚胎干細胞樣細胞的培養物，所述的胚胎干細胞樣細胞在例如移離飼養層后可產生不同的分化細胞類型。
另一方面，可以將來源于單倍體胚胎的胚胎干細胞樣細胞用于產生具有親代單倍體基因組的基因組的分化細胞。增殖單倍體基因組的另一種方式包括誘導通過將單倍體基因組導入胞質體產生的單倍體體細胞胞質體的分裂。
應注意，在優選的實施方案中，所述的單倍體基因來源于人，例如來源于人的精子或卵母細胞。然而，本發明包括任意哺乳動物種類來源的單倍體基因組的構建，所述的哺乳動物種類例如有非人的靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠、家兔、熊、牛、馬、豬、綿羊、豚鼠、水牛、山羊、羚羊等。本發明主要適用于選擇例如需要通過核轉移增殖任意動物，這些含有特別重要的所需遺傳組成的動物是農用動物、尤其是具有長妊娠期的動物。本發明應能夠快速篩選可產生具有所需遺傳特性的二倍體胚胎的單倍體基因組。例如，性連鎖遺傳疾病的存在或不存在可能是遺傳篩選的基礎。
此外，本發明使得按照本發明產生的單倍體細胞系通過同源重組進行遺傳修飾成為可能。
這是本發明的一個有利的方面，因為在基因座上的等位差異不會干擾所需重組事件。此外，本發明可以使得對雄性和雌性單倍體細胞系中相同基因座進行打靶，然后將產生的修飾雄性和雌性單倍體基因組合并而產生對特定修飾(例如缺失特定基因)而言屬于純合的二倍體胚胎。
如上所述，本文所述的本發明對現有的移植前遺傳診斷(PGD)方法進行了改進，因為這些方法不會涉及對胚胎的操作。一般來說，極少有胚胎可用于篩選。此外，為測試而從胚胎中取出細胞對該胚胎的進一步發育而言可能是有害的。而通常僅有一個或極少的幾個細胞用于遺傳測試，這將導致因DNA缺失或DNA污染而產生不準確的結果。最后，關于胚胎的處理存在倫理考慮。單倍體DNA的遺傳篩選提供的優勢在于，如果篩選雄性和/或雌性配子，那么盡管篩選的配子極少，但總體上可能的組合將是很大的。
就性連鎖遺傳疾病而言，可以僅對精子進行篩選，而精子通常易于大量獲得。如果不能獲得大量精子，那么使精子基因組增殖也是有用的。這項技術可以制成基因組的許多相同拷貝用于篩選，以便將誤診的可能性減小到最低限度，并允許分析其它樣品以便檢驗結果。有關與精子相關的工作和對精子的操作的倫理憂慮與那些使用胚胎進行工作的情況相比是最小的。
例如，還可以篩選單倍體細胞，以便測定該單倍體細胞中的遺傳或DNA甲基化缺陷是否可以導致由其發育而成的任何成年動物患癌或其它疾病。對遺傳疾病和易感性的篩選可以用于消除含有這類缺陷的有缺陷單倍體細胞。可以將本發明用于篩選與疾病或其它不需要的性狀相關的染色體畸變和DNA序列。一般將這些單倍體基因組棄去。然而，在某些情況中，可以保留這類單倍體基因組。例如，編碼涉及疾病的基因的單倍體基因組的產生可以用于生產用于研究目的的動物，例如用于評價推定的治療或預防的功效。此外，可以將本發明用于選擇含有所需遺傳組成、例如包括涉及促進生長、疾病耐受性、產奶或其它所需性狀的DNA序列的單倍體基因組。例如，可以使用DNA探針和連鎖(L)或突變(M)檢測對表1中所列下列人體疾病進行單倍體細胞的遺傳分析
表1
Frank K.Fujimura，《分子生物學和生物技術綜合參考書》(MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGYA COMPREHENSIVE DESKREFERENCE)中的“遺傳測試”(″Genetic Testing″)，374-379(RobertA.Meyers，編輯，1995)。
用于篩選基因組檢查特異性DNA序列或染色體畸變是否存在的方法是眾所周知的。根據實例，這類篩選方法包括聚合酶鏈分析(PCR)技術，包括嵌套式PCR和直接PCR擴增；SSCP分析；RFLP分析；原位引發標記(PRINS)法(參見Pellestor等，1996)；熒光原位雜交(FISH)分析；和VNTRs或STRs分析；變性梯度凝膠電泳(DGGE)；以及使用酶(例如RNA酶A)或化學(例如哌啶)法進行的錯配裂解分析。
其它篩選方法包括可用于鑒定基因組印記相關綜合征的DNA甲基化分析。與基因組印記相關的人體綜合征和疾病包括普-威綜合征(PWS)、安格爾曼綜合征(AS)、單親異雙軀干畸胎病(uniparentalisodisomy)、伯-韋綜合征(BWS)、維爾姆斯瘤癌發生和馮·希佩爾-林道(yon Hippel-Lidau，VHL)病。就進行DNA甲基化分析的方法而言，參見Buchholz等，《人體遺傳學》(Hum.Genet.)103535-9(1998)。可以通過遺傳突變、諸如缺失以及異常基因組印記產生PWS(Barabash等，《臨床醫學》(Med.Clin.)(Barc)108304-6(1997))。在動物中，還將基因組印記與皮毛顏色聯系起來了。例如，小鼠agouti基因賦予野生型毛色，Aiapy等位基因的差異表達與基因上游調節序列的甲基化情況有關(Michaud等，《基因發育》(Genes Dev.)81463-72)。可以將農學上的遺傳篩選用于遺傳選擇以便產生最佳組合，這種組合可將隱性突變減小到最低限度、增加雜合性或純合性或累積有益的或者所需的等位基因。
如上所述，許多遺傳篩選和測試方法在本領域中是公知的且可以用于本發明。此外，已經鑒定了與所需或不需要的性狀相關的許多序列。
可以將本發明的方法用于例如農業、實驗室或馴養動物這樣的動物以及人中的遺傳選擇。目前，構成胚胎的配子基因組的組合是隨機的。然而，通過對配子進行遺傳篩選，可以獲得最佳組合以便將隱性突變最小到最低限度、增加雜合性、增加純合性或累積有益的等位基因。選擇到的具有所需遺傳組成的單倍體基因組可以用于產生二倍體胚胎和后代。
如上進一步所述，還可以將生產增殖單倍體細胞的方法用于制備遺傳修飾的單倍體細胞。就同源重組而言，基因座上的等位差異不會干擾重組事件。此外，靶向雄性和雌性細胞系可以獲得純合修飾。
用于進行基因組修飾的方法在本領域中是眾所周知的，例如包括應用逆轉錄病毒載體、顯微注射和使用包括待插入序列的DNA進行轉化。優選在基因組的靶位點上進行遺傳修飾。已經充分報導了用于對基因組，特別是哺乳動物基因組進行靶向插入、缺失和取代修飾的方法，它們是許多專利的主題。
本質上說，在本發明中，可以對增殖單倍體細胞系中包含的特定單倍體基因組進行遺傳修飾以便除去、添加或取代特定的DNA序列。在例如通過同源重組進行這類遺傳修飾后，對所述的單倍體基因組進行測試或篩選以便確定它確實包括所述修飾。例如，可以通過上文確定的遺傳篩選方法或通過表達例如酶、抗生素抗性標記、熒光或放射性標記等這樣在插入的DNA中包含的特定標記來完成上述步驟。
在產生了遺傳修飾的單倍體基因組后，優選通過上述方法擴增它。
所得選擇的雄性或雌性來源的單倍體(其基因組可以是遺傳修飾的)特別可用于核轉移或核移植。這類方法主要包括將所選擇的雄性和雌性單倍體基因組導入去核的卵母細胞或將所選擇的雄性或雌性單倍體基因組導入單倍體卵母細胞的步驟，其中這類單倍體DNA是雄性或雌性來源。由此獲得二倍體核轉移單位，其中已基于其遺傳組成對其中的雄性或雌性DNA進行了選擇。可以將這些二倍體核轉移單位用于生成具有所需遺傳組成、例如含有涉及疾病耐受性、生長或編碼所需產物的異源DNA的基因的子代。
核轉移技術或核移植技術在文獻中是眾所周知的。特別參見Sims等，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)906143-6147(1993)；Collas等，《發育的分子學報告》(Mol.ReportDev.)38264-267(1994)；Keefer等，《生殖生物學》(Biol.Reprod.)50935-939(1994)；Campbell等，《動物生殖學》(Theriogenology)，43181(1995)；Campbell等，《自然》(Nature)，38064-66(1996)；Schnieke等，《科學》(Science)2782130-3(1997)；Wells等，《生殖生物學》(Biol.Reprod.)57385-393(1997)；Wilmut等，《自然》(Nature)386810-813(1997)；Cibelli等，《科學》(Science)2801256-8(1998)；Kato等，《科學》(Science)2822095-8(1998)；Wakayama等，《自然》(Nature)394369-74(1998)；Wolf等，《生物技術雜志》(J.Biotechnol.)6599-110(1998)；Baguisi等，《國家生物技術》(Nat.Biotechnol.)17456-61(1999)；Dominko等，《生殖生物學》(Biol.Reprod.)601496-1502(1999)；Wolf等，《生殖生物學》(Biol.Reprod.)60199-204(1999)；PCT/US99/00045；WO 94/26884；WO 94/24274；和WO 90/03432，將這些文獻的全部內容引入本文作為參考。此外，美國專利號US 4,944,384和5,057,420中描述了用于牛核轉移的步驟。另外參見美國專利號US 5,945,577，將該文獻的全部內容引入作為參考。
用于核轉移的卵母細胞可以獲自包括哺乳動物和兩棲類動物在內的動物。卵母細胞的合適的哺乳動物來源包括綿羊、牛、羊、豬、馬、兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長類、人和非人等。在優選的實施方案中，卵母細胞可以獲自靈長類，例如人卵母細胞；或有蹄類動物。
用于分離卵母細胞的方法在本領域中是眾所周知的。這些方法主要包括從例如牛這樣的哺乳動物卵巢或生殖道中分離卵母細胞的步驟。牛卵母細胞的易于得到的來源是來自屠宰場的物質。
為了成功地使用諸如遺傳工程、核轉移和克隆這樣的技術，在將這些細胞用作核轉移用的受體細胞前并在能夠與使精子細胞受精而發育成胚胎之前，一般必須在體外使卵母細胞成熟。這種方法一般需要從卵巢(例如在屠宰場獲得的牛卵巢)中收集不成熟的(前I期)卵母細胞并在受精或去核前在成熟培養基中使卵母細胞成熟，直到卵母細胞達到中期II階段為止，就牛卵母細胞的情況而言，中期II階段一般發生在吸出后約18-24小時。就本發明的目的而言，將該時間期限稱作″成熟期″。本文計算時間期限所用的″吸出″指的是從卵泡中吸出不成熟的卵母細胞。此外，本發明包括通過從許可供體中吸出而分離人卵母細胞的方法。
另一方面，可以將已經在體內成熟的中期II階段的卵母細胞用于核轉移技術。例如，通過手術方法從動情期開始后或注射人絨毛膜促性腺素(hCG)或相似激素后35-48小時的非超排卵或超排卵的母牛或小母牛中采集成熟的中期II卵母細胞。
已經報導去核和核轉移時卵母細胞的成熟階段對NT法的成功是稻重要的。(例如參見Prather等，《分化》(Differentiation)481-8(1991)；Tanaka等，《動物生殖科學》(Anim.Reprod.Sci.)49113-23(1997))。一般來說，成功的哺乳動物胚胎克隆實踐應用中期II卵母細胞作為受體卵母細胞，因為認為在該階段卵母細胞可能或被充分″活化″而將導入的核作為受精精子對待。在馴養的動物且特別是牛中，卵母細胞活化期通常是在吸出后約16-52小時、優選約28-42小時的范圍。
例如，可以如Seshagine等在《生殖生物學》(Biol.Reprod.)40544606(1989)中所述在HEPES緩沖的倉鼠胚胎培養基(HECM)中洗滌不成熟的卵母細胞，且然后在39℃下將其放入處于輕質石蠟或硅烷層之下的成熟培養基液滴中，該液滴由含有10％胎牛血清(FCS)的50ul組織培養基(TCM)199組成，所述培養基含有諸如黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)這樣適當的促性腺素以及雌二醇。
在約10-40小時且優選約16-18小時范圍的固定成熟期后，可以將卵母細胞去核。在去核前，優選取出該卵母細胞并在除去卵丘細胞前將其放入含有1mg/ml透明質酸酶的HECM中。通過經極其精密孔徑分吸量管反復吸移或通過簡單地渦旋來完成上述步驟。然后對剝離的卵母細胞篩選極體，隨后將通過存在極體確定的所選擇中期II卵母細胞用于核轉移。去核過程如下。
可以通過諸如美國專利號US 4,994,384中所述的公知方法進行去核，將該文獻引入作為參考。例如，將中期II卵母細胞置于可以含有或不含有7.5μg/ml松胞菌素B的HECM中以便于即刻去核，或可以將其置于例如CR1 aa+10％動情期母牛血清的適宜培養基中以后再去核，優選在不超過24小時后且更優選在16-18小時后去核。
可以使用微量吸移管通過顯微手術的方式進行去核以便除去極體和相鄰的細胞質。然后可以篩選卵母細胞以便鑒定已經成功去核的那些卵母細胞。可以通過用HECM中的1μg/ml 33342 Hoechst染料對卵母細胞染色且然后在紫外線照射下將所述卵母細胞觀測10秒以下進行這種篩選。可以將隨后成功去核的卵母細胞置于合適的培養基、例如CR1 aa+10％血清中。
在本發明中，可以將1個或2個選擇的可能進行遺傳修飾的單倍體基因組植入任選去核的卵母細胞的卵周隙或其它胞質體中。按照本領域中公知的方法將所得的含有屬于二倍體的卵母細胞或胞質體的單倍體基因組用于產生NT單位。例如，可以通過電融合融合細胞。通過提供足以使質膜短暫破裂的電脈沖來進行電融合。質膜的這種破裂時間極短，因為該膜可快速重形成。實質上，如果誘導兩個相鄰的膜破裂，則重形成時脂雙層滲入，在兩個細胞之間將開放小的通道。由于這類小孔存在熱力學不穩定性，它擴大至兩個細胞合二為一為止。有關該方法的進一步討論參閱Prather等的美國專利US 4,997,384。可以使用例如包括蔗糖、甘露糖醇、山梨醇和磷酸緩沖溶液在內的各種電融合介質。還可以使用仙臺病毒作為融合劑進行融合(Graham，Wister Inst.Symp.Monogr.919(1969)。
此外，在某些情況中(例如使用小供體核)，可能優選將單倍體細胞或核直接注入卵母細胞而不是使用電穿孔融合法。這類技術公開在Collas等的Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)中。
可以通過公知方法對人或動物細胞和卵母細胞或胞質體進行電融合例如在引發卵母細胞成熟后約24小時，在500μm室內通過使用90-120V的電脈沖約15μsec。融合后，將所得的融合NT單位置于合適的培養基中至活化為止。可以在融合之前或之后不久、一般在小于24小時后且優選在約4-9小時后進行活化。
可以通過公知方法活化NT單位。這類方法包括例如在亞生理學溫度下培養NT單位，實質上是通過對NT單位施用冷或事實上冷卻的溫度休克。最方便的是通過在與胚胎通常暴露的生理學溫度相比屬于室溫的條件下培養NT單位來進行該步驟。
另一方面，可以通過施用公知的活化劑來進行活化。例如，已經證實在受精過程中由精子透入卵母細胞可活化充滿的卵母細胞而產生較大數量的存活受孕體并在核轉移后倍增出遺傳方式相同的幼體。此外，可以將諸如電休克和化學休克這樣的處理方法用于活化融合后的NT胚胎。卵母細胞的活化方法是Susko-Parrish等的美國專利號US5,496,720的主題。
另一方面，可以同時或依次進行下述步驟完成活化(i)增加卵母細胞中二價陽離子的濃度；和(ii)降低卵母細胞中細胞蛋白的磷酸化。
一般可以通過將例如鎂、鍶、鋇或鈣這樣的二價陽離子以例如離子載體的形式導入卵母細胞細胞質來進行上述步驟。其它增加二價陽離子濃度的方法包括使用電休克、用乙醇處理和用籠狀螯合劑(cagedchelators)處理。
可以通過公知方法、例如通過添加諸如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑(例如6-二甲氨基嘌呤、staurosporine、2-氨基嘌呤和鞘氨醇)這樣的激酶抑制劑來減少磷酸化。另一方面，可以通過將磷酸酶(例如磷酸酶2A和磷酸酶2B)導入卵母細胞來抑制細胞蛋白的磷酸化。
進行NT活化的一種方式通過下列步驟來進行使融合的NT單位與含有5μM離子霉素和1mg/ml BSA的TL-HEPES培養基簡單接觸，隨后在融合后約24小時內、且優選在融合后約4-9小時內在含有30mg/ml BSA的TL-HEPES中洗滌。另一方面，可以通過使用乙醇或反復的電脈沖來進行活化。
然后可以將由一種或兩種選擇的單倍體基因組產生的活化NT單位在合適的體外培養基中培養至胚胎或胚胎干細胞樣細胞和細胞集落產生為止。適合于培養胚胎和使之成熟的培養基在本領域中是眾所周知的。可以用于牛胚胎培養和維持的已知培養基的實例包括Ham’s F-10+10％胎牛血清(FCS)、組織培養基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、蒂羅德清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco’s磷酸緩沖鹽水(PBS)、Eagle’s和Whitten’s培養基。用于收集卵母細胞并使之成熟的最常用培養基之一是TCM-199+1-20％血清補充劑、包括胎牛血清、新生血清、動情期的母牛血清、小羊血清或公牛血清。優選的維持培養基包括含有Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大霉素的TCM-199。上述任何一種還可以包括與諸如顆粒細胞、輸卵管細胞、BRL細胞、子宮細胞和STO細胞這樣不同細胞類型的共培養物。
此后，優選將活化的培養NT單位進行洗滌且然后置于例如帶孔平板中的含有10％FCS和6mg/ml的CRIaa培養基這樣合適的培養基中，這些平板優選含有合適的匯合飼養層。合適的飼養層包括例如成纖維細胞和上皮細胞，例如來源于有蹄類動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞、雞成纖維細胞、鼠(例如小鼠或大鼠)成纖維細胞、STO和SI-m220飼養層細胞系和BRL細胞。
在飼養層上將NT單位培養至NT單位達到適合于獲得可用于產生胚胎干細胞樣細胞或細胞集落的細胞的大小。優選將這些NT單位培養至至少約2-400個細胞、更優選約4-128個細胞和最優選至少約50個細胞。在合適的條件、例如約38.5℃和5％CO2條件下進行培養，并且一般約每2-5天、優選約每3天更換所述培養基以使生長達到最佳。
在獲得所需大小的NT單位后，以機械方式從所述區域中取出所述細胞且然后用于產生胚胎或胚胎干細胞樣細胞和細胞系。優選通過取出包括一般含有至少約50個細胞的所述NT單位的細胞塊、洗滌這類細胞并將這些細胞鋪在例如照射的成纖維細胞這樣的飼養層上來完成上述步驟。一般來說，用于獲得所述干樣細胞或細胞集落的細胞將獲自優選至少為50個細胞大小的培養NT單位的最內層部分。然而，也可以將較小或較大細胞數量的NT單位以及來自NT單位其它部分的細胞用于獲得ES-樣細胞和細胞集落。將這些細胞維持在例如補充了10％FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM這樣的適宜生長培養基內的飼養層中。根據需要更換生長培養基以便使生長最佳化，例如每2-3天更換一次。該培養過程導致形成胚胎或胚胎干細胞樣細胞或細胞系。在這類細胞產生前的培養時間可能隨特定核供體細胞、具體卵母細胞和培養條件的不同而改變。本領域技術人員可以根據需要的不同而改變培養條件以便使特定胚胎或胚胎干細胞樣細胞的生長最佳化。
由所述單倍體基因組所生成胚胎或胚胎干細胞樣細胞和細胞集落應表現出與用作核細胞供體的種類的天然胚胎或胚胎干細胞樣細胞相似的外觀。
已經參照優選實施方案描述了本發明。然而，對本領域技術人員而言，顯然能夠以非如上所述的特定方式使本發明具體化而不會脫離本發明的實質。下面實施例中所述的優選實施方案是解釋性的而不應將其看作以任何方式來限定本發明。本發明的范圍由所附的而非上述描述確定，并且屬于權利要求范圍內的所有改變和等同內容均包括在其中。
實施例單倍體細胞系的產生大鼠A9細胞的產生在補充了10％胎牛血清的αmem(Biowhittaker，location)中用3.75μg/ml松胞菌素B(Sigma，location)將鼠A9細胞(HPRT-)培養96小時。松胞菌素B是微絲的抑制劑，可防止細胞進行胞質分裂，同時使細胞合成DNA并增加大小。撤離該藥物24小時后，可以從培養物表面取出細胞并操作。所得細胞約為30μm直徑。
培養用聚-D-賴氨酸包被直徑約為2.5cm的玻璃圓盤。以60-80％匯合率將松胞菌素B處理的A9細胞平板鋪在該圓盤上并使之貼壁24小時。將圓盤細胞側朝下置于含有5ml去核培養基(磷酸緩沖鹽水、10％胎牛血清、10ug/ml松胞菌素B)的離心管內。在37℃下將細胞保溫20分鐘。將離心管置于37℃的超速離心機中并以23,000g再旋轉20分鐘。所得的胞質體可存活24-48小時。
通過胰蛋白酶消化從玻璃表面取下胞質體。以1X濃度向培養基中加入HAT補充劑以便殺傷剩余的有核細胞。該步驟的另一種選擇是在導入供體核后加入HAT補充劑。該步驟會消除任何有核A9細胞，而任何未融合的胞質體會在48小時內裂解。
供體核的導入通過獲能或用蛋白酶處理來制備從攜帶新霉素抗性基因(Neo)的轉基因小鼠中采集的精子用于融合。將這些處理方法用于確保精子將粘著胞質體。轉基因標記可用于證實精子的來源，但對該過程來說并非必需。或者，單倍體供體可以是通過顯微操作從新近受精胚胎中取出的雄性和雌性原核(單倍體核體)。
融合用蛋白酶或PHA處理A9胞質體和精子二者以便增加胞質體與精子的粘附和融合的可能性。應利用適宜濃度的精子或供體核和胞質體，以便增加帶有單核的所得細胞的數量。可以用AC脈沖將核/胞質體偶聯體定向，使得所融合的膜對電流而言是正交的。可以給予DC脈沖以便誘導核供體細胞與胞質體之間的融合。還可以將細胞融合的其它方法用于這樣的步驟中，諸如聚乙二醇、融合-誘導病毒或脂質體。
選擇融合幾天后，開始選擇A9-單倍體核雜種。將HAT敏感性A9細胞用作胞質體的來源，因此，HAT培養基中形成的任何集落來自單倍體-胞質體雜種。非去核的A9細胞不能在選擇中存活。將所得的雜種以克隆方式增殖直至獲得足夠數目用于分析。我們可通過熒光原位雜交或核型分析確定雜種是單倍體還是二倍體。
受精可以將單倍體細胞用作卵母細胞受精中的供體核。使用標準方法進行核轉移。使用引起第二極體排出和雌性染色質單倍化的方法可活化胚胎。
權利要求
1.一種用于選擇含有單倍體基因組的細胞的方法，該方法包括下列步驟(i)獲得含有雄性或雌性來源的單倍體基因組的細胞并擴增其數目；(ii)將所述單倍體細胞的基因組進行遺傳篩選或分析以便測定所述單倍體基因組是否包括所需的遺傳組成；和(iii)選擇含有所述所需遺傳組成的細胞。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細胞是通過活化其中半數染色體排出在極體中的卵母細胞而產生的。
3.權利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細胞是通過使卵受精并從其中除去雄性原核而產生的。
4.權利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細胞是通過活化卵以便產生含有兩個雌性原核的卵并除去所述原核中的一個而產生的。
5.權利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細胞是通過將二倍體細胞核插入未成熟的卵母細胞、隨后使所述染色體分入兩個單倍體核而產生的。
6.權利要求1所述的方法，其中所述的雌性衍生的單倍體細胞是通過下列步驟產生的將含有半數染色體但增殖所有DNA成分即四條染色單體的單性胚的核轉移到卵母細胞中，隨后從其中排出染色體的一半。
7.權利要求1所述的方法，其中所述的雄性衍生的單倍體細胞來源于除去了雌性原核的受精卵。
8.權利要求1所述的方法，其中所述的雄性衍生的單倍體細胞通過使去核卵受精而衍生。
9.權利要求1所述的方法，其中所述的雄性衍生的單倍體細胞通過對精核進行人工解凝、然后將其注入非卵衍生的胞質體而產生。
10.權利要求1所述的方法，其中通過選自下述的方法來擴增所述的雌性或雄性衍生的單倍體細胞(i)使單倍體卵胞質體進行細胞分裂；(ii)使單倍體細胞產生單倍體胚胎，然后將這種胚胎培養以產生″增殖單倍體″細胞；(iii)將單倍體胚胎培養以產生增殖單倍體細胞并使這類胚胎干細胞樣細胞分化；和(iv)在允許細胞分裂的條件下培養單倍體體細胞胞質體。
11.權利要求1所述的方法，其中將所述選擇的單倍體基因組進行遺傳修飾。
12.權利要求11所述的方法，其中對選擇的雄性和雌性單倍體基因組二者均進行遺傳修飾。
13.權利要求1所述的方法，其中進一步包括使用所述選擇的雄性或雌性單倍體基因組或含有所述選擇的單倍體基因組的細胞用于產生二倍體胚胎的步驟。
14.權利要求1所述的方法，其中進一步包括使用選擇的雄性和雌性單倍體基因組產生二倍體胚胎的步驟。
15.權利要求1所述的方法，其中將所述選擇的雄性或雌性單倍體基因組或將含有所述雄性或雌性基因組的細胞用作核轉移供體。
16.權利要求15所述的方法，其中將選擇的雄性和雌性單倍體基因組用作核轉移供體以便產生含有所述選擇的雄性和雌性單倍體基因組的二倍體核轉移單位。
17.權利要求15所述的方法，其中所述的單倍體基因組是人的。
18.權利要求15所述的方法，其中所述的單倍體細胞或基因組包括來源于增殖單倍體胚胎的分化細胞、胚胎干細胞樣細胞或內細胞團細胞。
19.權利要求18所述的方法，其中所述的分化細胞或胚胎干細胞樣細胞通過體外培養單倍體胚胎而產生。
20.權利要求13所述的方法，其中將所述選擇的單倍體基因組進行遺傳修飾。
21.權利要求19所述的方法，其中將所述選擇的單倍體基因組二者均進行遺傳修飾。
22.權利要求20所述的方法，其中通過同源重組對所述選擇的單倍體基因組進行遺傳修飾，以便消除、插入或取代特定的DNA。
23.權利要求21所述的方法，其中通過同源重組對所述選擇的單倍體基因組二者均進行遺傳修飾，以便消除、插入或取代特定的DNA。
24.權利要求1所述的方法，其中所述的遺傳測試包括下列步驟對所述擴增的單倍體基因組篩選遺傳缺陷、與異常基因組印記相關的DNA甲基化缺陷或選擇含有所需DNA、等位性狀或缺乏功能基因的細胞。
25.權利要求24所述的方法，其中所述的遺傳缺陷導致下列遺傳疾病中的一種α-1抗胰蛋白酶缺乏癥；α-地中海貧血；腺瘤樣結腸息肉病；成人多囊性腎病；因BRCA1或BRCA2缺陷導致的乳腺癌易感性；β-地中海貧血；沙-馬-圖病；因MSH2、MLH1、PMS1或PMS2缺陷導致的結腸癌易感性；先天性腎上腺增生；囊性纖維化；杜興/貝克肌營養不良；脆性X染色體綜合征；A型和B型血友病；戈謝病；亨廷頓舞蹈病；肯尼迪病；萊-尼綜合征；馬方綜合征；中鏈脂酰輔酶A脫氫酶缺乏癥；黑素瘤易感性；1或2A型多發性內分泌腺瘤形成；強直性肌營養不良；1型神經纖維瘤病；鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏病；視網膜母細胞瘤；鐮形細胞貧血；類固醇硫酸酶；泰-薩病；或韋-霍病。
26.權利要求24所述的方法，其中所測試的DNA甲基化缺陷選自普-威綜合征、安格爾曼綜合征、單親異雙軀干畸胎病、伯-韋綜合征、維爾姆斯瘤癌發生和馮.希佩爾-林道綜合征。
27.權利要求24所述的方法，其中所述的遺傳測試包括使用直接或間接與標記連接的核酸序列或選擇含有所需DNA或等位性狀或缺乏功能基因的細胞的步驟，所述的標記可以和與特定遺傳缺陷相關的核酸序列特異性結合。
28.權利要求1所述的方法，其中所述的遺傳測試包括對特定DNA序列、等位性狀或遺傳缺陷使用質譜、熒光或放射性核檢測的步驟。
29.權利要求1所述的方法，其中這類遺傳篩選包括RFLP分析、SSCP分析、STR分析、VNTR分析或變性梯度凝膠電泳。
30.權利要求13所述的方法，其中將所述胚胎植入合適的雌性替代物并使之發育成可存活的后代。
31.權利要求1所述的方法，其中所述的單倍體基因組是牛的單倍體基因組。
32.權利要求1所述的方法，其中所述的單倍體基因組是靈長類的單倍體基因組。
33.權利要求1所述的方法，其中所述的單倍體基因組選自山羊、綿羊、牛、豬、羊、馬、綿羊、犬、貓、鼠、兔、靈長類、人、象、豚鼠、小鼠、大鼠的單倍體基因組組成的組。
34一種使用權利要求10所述方法獲得的增殖單倍體細胞系。
35.權利要求34所述的增殖單倍體細胞系，其中所述的細胞系是雌性細胞或雄性細胞衍生的單倍體細胞系。
36.一種通過核轉移產生的二倍體胚胎，其中所述的核轉移方法包括將單倍體基因組或按照權利要求1方法產生的細胞用作核轉移供體的步驟。
37.權利要求36所述的二倍體胚胎，其中所述的核轉移方法包括移植雄性和雌性單倍體基因組二者或按照權利要求1方法產生的細胞的步驟。
38.由單倍體胚胎產生的胚胎干細胞樣細胞或分化的細胞。
39.一種用于產生克隆的胚胎、胎兒或動物的改進的核轉移方法，其中所述的改進包括將由單倍體胚胎產生的胚胎干細胞樣細胞或分化的細胞用作核轉移供體。
全文摘要
本發明提供了用于增殖雄性或雌性來源的單倍體基因組和對其進行遺傳篩選和修飾的方法。可以將這些單倍體基因組用于生產單倍體胚胎和胚胎干細胞樣細胞和分化的細胞。此外,這些單倍體基因組和含有這些單倍體基因組的細胞可以用作產生二倍體核轉移單位的核轉移供體。可以將這些二倍體NT單位、例如人NT單位用于獲得多能細胞和分化細胞以及組織。
文檔編號G01N33/566GK1387401SQ00815283
公開日2002年12月25日 申請日期2000年11月2日 優先權日1999年11月2日
發明者J·M·羅博爾, P·莫雷拉 申請人:馬薩諸塞大學