專利名稱：與bcl－xl相互作用的多肽pablo及其有關用途的制作方法
背景技術：
凋亡涉及控制某些分化的細胞類型(例如造血譜系和其它體細胞和干細胞)的量和分布。凋亡首先被描述成以細胞收縮、膜出泡和染色質濃縮最終使細胞片段化為特征的細胞死亡形態圖案(Kerr等，1972，Br.J.Cancer 26239)。經歷凋亡的細胞表現出內核小體DNA斷裂的特征性圖案(Wyllie.1980.Int.Rev.Cytol.69251；Abrams等人1993，Development.11729)。
經鑒定編碼參與調節凋亡的蛋白的首個基因bcl-2從攜帶t(14∶18)的B細胞淋巴瘤的染色體斷點克隆得到(Tsujimoto等人，1984.Science 2261097)，它表現出抑制細胞的凋亡易感性(Cory.1994.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.345289)。隨后對與bcl-2有同源性的幾個基因作為了特性鑒定，這些基因包括al，它編碼80氨基酸的蛋白，該蛋白對GM-SCF或LPS反應而在巨噬細胞中迅速誘導產生(Lin等人，1993，J.Immunol..151，1979-1988)；mcl-1，經歷巨噬細胞分化的骨髓細胞系中的早期應答基因(Kozopas等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3516-3520)；和bak，一種可能增強凋亡的bcl-2同源物(Chittenden等人，1995.Nature 374733；Kiefer等人，1995.Nature 374736)。與bcl-2相互作用和/或在結構上與bcl-2基因產物有關的其它蛋白質也已被鑒定，例如Bcl-XL和Bcl-xS(Boise等人，1993.Cell 74957)；Ced-9(Vaux等人，1992.Science 2581955)和兩種DNA病毒蛋白(非洲淋巴瘤病毒LMW5-HL和BHRF-1)。
與Bcl-2蛋白家族密切相關的bcl-x基因產物也保護細胞以防凋亡。Bcl-x缺陷型小鼠的分析提示，它在神經和造血系統發育期間支持不成熟細胞的存活(Motoyama等人，1995.Science 267，1506-1510；Ma等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4763-4767)。人bcl-x的可變剪接可能產生至少兩個不同的bcl-x mRNA物種，bcl-xL和bcl-xS。較大的bcl-x mRNA的主要蛋白產物(233氨基酸)Bcl-xL在生長因子減少時抑制細胞死亡(Boise等人，1993.Cell 74，597-608)，其轉基因表達改變了胸腺細胞成熟，使成熟胸腺細胞的數量增加(Chao等人，1995.J.Exp.Med.，182，821-828；Grillot等人，1995.J.Exp.Med.，182，1973-1983)。另一方面，Bcl-xS抑制了Bcl-2抑制細胞死亡的能力，使得細胞更容易發生凋亡性細胞死亡。其它的鼠Bcl-x同種型(稱為Bcl-xβ和Bcl-xΔTM)已被鑒定。β同種型能抑制神經元中的凋亡(Gonzalez-Garcia等人，1995.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4304-4308)，ΔTM同種型能抑制B細胞中的凋亡(Fang等人，同上)。
因此，BCL-2蛋白家族包括促凋亡性和抗凋亡性成員(Farrow和Brown，1996，Curr.Opin.Genet.Dev.645)。Bcl-2有關的蛋白共同具有的同源性群集在四個保守區域內(稱為Bcl-2同源性1-4(BH1-4)結構域)。一個兩親性的α螺旋BH3對于促凋亡性家族成員特別重要(Korsmeyer.1999.Cancer Res.11693s-1700s；Chittenden等人，1995.EMBO J 145589)。促凋亡性分子僅僅在BH3處與Bcl-2家族有序列同源性。Bcl-xL的BH1、BH2和BH3結構域形成的疏水性斷裂負責Bcl-xL和含HB3的死亡激動劑之間的相互作用(Minn等人.EMBO J 1999年2月1日；18(3)632-43)。
除了在正常發育中起作用外，凋亡還參與了病理性狀況，例如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側索硬化(ALS)和脊髓性肌萎縮(例如參見Passer等人，J.Biol.Chem.1999/8/20；27424007)。另外，調節細胞內凋亡的能力在控制不希望的細胞增殖(例如癌細胞增殖)方面是有價值的。因此，能調節凋亡的因子的鑒定可能在研究和治療應用方面在控制細胞增殖、分化和/或凋亡中有用。
發明概述本發明至少部分是基于這樣一個發現Pablo及其衍生的多肽與Bcl-xL相互作用，因此可以用作調節各種細胞過程、尤其是神經細胞過程中的調節劑。
因此，本發明一方面提供了一種分離的核酸分子，它包含選自下列的核苷酸序列a)編碼分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的核苷酸序列，其中所述分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域與SEQ ID NO2所示的Bcl-xL結合結構域有70％的氨基酸序列相同性；b)編碼分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在45℃6X SSC中、然后在50-65℃下用0.2 SSC和0.1％SDS洗滌一次或多次后與編碼Bcl-xL結合結構域的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的互補序列雜交；和c)如SEQID NO1所示的編碼分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的核苷酸序列。
在一個實施方案中，分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的大約419-559位氨基酸或大約429-559位氨基酸所示的氨基酸序列組成。在另一實施方案中，分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的436-489位氨基酸所示的氨基酸序列組成。
在一個實施方案中，分離的Bcl-xL結合結構域調節神經細胞中的凋亡。
在一個實施方案中，核酸分子編碼融合蛋白。
本發明一方面涉及一種分離的多肽，該多肽選自下列a)包含分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的多肽，其中所述分離的Bcl-xL結合結構域由與SEQ ID NO2所示的Pablo Bcl-xL結合結構域有至少70％相同性的氨基酸序列組成；b)包含Bcl-xL結合結構域的多肽，其中所述Bcl-xL結合結構域由與SEQ ID NO2所示的PabloBcl-xL結合結構域有至少70％相同性的氨基酸序列組成，條件是所述多肽不是全長Pablo多肽；和c)包含SEQ ID NO2所示的Bcl-xL結合結構域的多肽。
另一方面，本發明涉及一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO2所示的分離的Bcl-xL結合結構域。在另一實施方案中，對Bcl-xL結合結構域作了保守性氨基酸置換。
另一方面，本發明涉及一種由SEQ ID NO2所示的分離的Bcl-xL結合結構域組成的多肽。
在一個實施方案中，該分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的419-559位氨基酸或429-559位氨基酸組成。在另一實施方案中，分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的436-489位氨基酸組成。
在一個實施方案中，分離的Bcl-xL結合結構域調節神經細胞凋亡。
另一方面，本發明涉及一種融合蛋白，該蛋白包含由分離的Bcl-xL結合結構域組成的第一多肽和非Pablo的第二多肽。
另一方面，本發明涉及一種分離的核酸分子，該核酸分子與編碼Bcl-xL結合結構域的SEQ ID NO1的那部分反義。
本發明還有一個實施方案涉及一種包含權利要求1所述核酸分子的載體。
在另一實施方案中，本發明涉及一種穩定表達SEQ ID NO2所示的分離的Bcl-xL結合結構域或外源Pablo多肽的神經細胞系。
另一方面，本發明涉及一種非人轉基因動物，它包含編碼至少一種轉基因Pablo蛋白的轉基因以及至少一個指導至少一種轉基因Pablo蛋白表達的啟動子元件。
在一個實施方案中，該Pablo蛋白是人Pablo。
在一個實施方案中，該非人轉基因動物是小鼠。
在一個實施方案中，至少一個啟動子元件指導組織特異性的表達。
在一個實施方案中，啟動子元件主要指導神經細胞中的表達。
在一個實施方案中，至少一個啟動子選自Thy1.2啟動子和神經元特異性烯醇酶啟動子。
在一個實施方案中，轉基因Pablo蛋白包含截短的或改變的Pablo蛋白。
在一個實施方案中，轉基因Pablo蛋白是Pablo的顯性失活突變體。
在一個實施方案中，轉基因動物包含可調節的表達系統。
在一個實施方案中，可調節的表達系統是四環素依賴型表達系統，它包含四環素敏感型反式激活蛋白和在轉基因啟動子元件中的至少一個四環素敏感型反式激活蛋白的識別位點序列。在另一實施方案中，四環素敏感型反式激活蛋白還包含轉錄阻遏蛋白結構域。
在一個實施方案中，轉錄阻遏蛋白結構域是KRAB結構域。
另一方面，本發明涉及一種非人轉基因動物，它包含一基因組，該基因組中內源性Pablo蛋白已經缺失或改變，從而使該動物中不發生Pablo的功能性表達。
另一方面，本發明涉及一種調節細胞凋亡的方法，該方法包括調節Pablo多肽或其Bcl-xL結合結構域的活性。
另一方面，本發明涉及一種調節細胞凋亡的方法，該方法包括調節Pablo多肽或其Bcl-xL結合結構域的表達。
另一方面，本發明涉及一種治療對象神經系統失調的方法，該方法包括調節對象細胞中Pablo的表達或活性，從而治療該對象體內的神經系統失調。
另一方面，本發明涉及一種鑒定化合物的方法，該化合物調節Bcl-xL結合結構域的調節凋亡的能力，該方法包括使表達Bcl-xL結合結構域的細胞與測試化合物接觸；測定測試化合物調節Bcl-xL結合結構域活性的能力，從而鑒定出能調節Bcl-xL結合結構域的凋亡調節能力的化合物。
還有一方面，本發明涉及一種鑒定化合物的方法，該化合物能調節Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL相互作用的能力，該方法包括使含有Bcl-xL結合結構域的無細胞混合物與測試化合物接觸；測定測試化合物對Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL相互作用能力的調節能力，從而鑒定出能調節Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL相互作用能力的化合物。
附圖簡述

圖1表示在轉染后30小時，與用空白載體(eGFP)轉染的細胞相比，用Pablo轉染的大鼠海馬神經元100％顯示出異常的核形態(從固縮核看出)(**p＜0.01)。
圖2顯示出不表達Pablo的PC12細胞存活，而誘導Pablo表達(無DOX)的PC12細胞存活較少。
圖3顯示出在轉染/誘導后48小時對于綠色熒光蛋白呈陽性(GFP+)的表達Pablo的PC12細胞百分數。該數據是顯示單用eGFP載體(eGFP)或eGFP載體+Bcl-xL(Bcl-xL)轉染的表達Pablo的細胞。
圖4說明，在轉染/誘導后48小時，經含有Bcl-xL的eGFP載體(Bcl-xL)轉染的表達Pablo的PC12細胞只有3.5％表現出凋亡的胞核。
圖5顯示出，與單單表達eGFP載體的細胞相比，表達Pablo的293細胞(單單Pablo)中固縮核沒有統計學上有意義的增加。
圖6顯示出圖5中接受單獨載體或載體+Pablo的293細胞的轉染效率大體相同。
圖7顯示出，當只測定GFP+細胞時，圖5中接受單獨載體或載體+Pablo的293細胞中具有固縮核的細胞百分數大體上相同。
圖8顯示出Pablo轉染引起神經細胞凋亡，但不引起非神經細胞凋亡。
圖9顯示了經eGFP空白載體、有PabloΔ142突變體的eGFP載體或全長Pablo-eGFP構建物轉染的GFP陽性神經元存活百分數。
圖10顯示了Bcl-xLΔTM構建物的核苷酸序列。
圖11顯示了在酵母雙雜交篩選中用作誘餌的Bcl-xL的氨基酸序列。
圖12顯示了PabloΔ142突變體的核苷酸序列。
圖13顯示了PabloΔ142突變體的氨基酸序列。
圖14是PabloΔ142，Δ70和尾構建物的示意圖。
圖15表明Pablo全長構建物和Δ70構建物對于大鼠小腦顆粒神經元培養液有毒性，而Δ142和尾構建物沒有。
圖16顯示了全長Pablo的表達和各種Pablo缺失構建物的共轉染引起的預計毒性。
圖17是為產生圖16所示數據所進行的共轉染的總結。
發明詳述本發明至少部分是基于這樣一個發現即，Pablo蛋白和從中衍生的新多肽與Bcl-xL相互作用，從而調節了凋亡，尤其是神經細胞凋亡。Pablo Bcl-xL結合結構域已作了特性鑒定。另外，Pablo經證實是第一個通過BH3結構域以外的結構域與Bcl-xL相互作用的促凋亡性多肽。
本發明的這些和其它方面在以下有更詳細的描述。
I.定義本文所用的術語“Pablo”指促凋亡性Bcl-xL結合蛋白。Pablo的核苷酸序列和氨基酸序列以前已被Nagase等人(DNA Research(1996)3321-324)鑒定，在該文獻中稱為KIAA0269。Pablo的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO1中，Pablo的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO2中。Pablo多肽包含新的具有Pablo活性的Bcl-xL結合結構域。本文所用的術語“Pablo活性”或“Pablo多肽的活性”包括調節細胞(如神經細胞)凋亡的能力。在一個實施方案中，Pablo活性指根據標準技術在體內或體外測得的Pablo多肽或其部分對Pablo相應性細胞或Pablo結合伙伴的活性。在一個實施方案中，Pablo活性是直接的活性，例如與Pablo-靶分子結合。本文所用的術語“靶分子”或“結合伙伴”是與Pablo蛋白天然結合或相互作用從而實現Pablo介導的功能的分子。與Pablo多肽相互作用的結合伙伴是Bcl-xL分子。
本文所用的術語“凋亡”包括編程性細胞死亡，它可用本領域已知的技術來鑒定。凋亡性細胞死亡可通過細胞收縮、膜出泡和染色質濃縮最終導致細胞片段化來表征。經歷凋亡的細胞還表現出核小體間DNA斷裂的特性性圖案。本文所用的術語“調節凋亡”包括細胞(如神經細胞)的調節性編程性細胞死亡。本文所用的術語“調節凋亡”包括上調或下調細胞中的凋亡。凋亡的調節在下文有更詳細的討論，它可用來改善各種失調，例如神經失調。
本文所用的術語“Bcl-xL結合結構域”包括與Bcl-xL多肽相互作用的結構域，較佳的是與BH3結構域沒有顯著的氨基酸序列同源性。本文所用的術語“BH3結構域”包括具有氨基酸序列Leu-Ala-Gln-Xaa1-Gly-Asp-Xaa2-Met-Asp的結構域，其中Xaa1是Ile或Val，Xaa2是Gln或Ser(例如參見美國專利5,955,593)。較佳的Bcl-xL結合結構域是哺乳動物如人型。較佳的是，Bcl-xL結合結構域調節細胞(較佳的是神經細胞)中的凋亡。Bcl-xL結合結構域可包含約50、70、90、120、130、140或150個氨基酸。據信，Bcl-xL結合需要最少數目的核心氨基酸殘基，然而，最大的Bcl-xL結合活性可能需要額外的氨基酸殘基，它們例如起著給Bcl-xL多肽提供額外的接觸殘基、使核心的Bcl-xL結合結構域穩定或使Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL多肽的復合物穩定的功能。較佳的Bcl-xL結合結構域長度約為120-150個氨基酸殘基。更佳的，Bcl-xL結合結構域的長度約為130-140個氨基酸。較佳的Bcl-xL結合結構域列于SEQID NO2中。較佳的Bcl-xL結合結構域位于多肽(例如SEQ ID NO2所示的多肽)的羧基端。較佳的Bcl-xL結合結構域可包含SEQ ID NO2中從氨基酸420、440或450位到氨基酸470、480、500、520、540或560位。在一個實施方案中，Pablo Bcl-xL結合結構域不由氨基酸445-559位或氨基酸522-559位組成。在另一個實施方案中，PabloBcl-xL結合結構域包含SEQ ID NO2的氨基酸419到氨基酸550，或從氨基酸429到氨基酸559。如實施例7所示，已表明Pablo的羧基端結構域起著抑制Pablo的凋亡活性的顯性失活突變體的作用，該羧基端包含從大約氨基酸418到大約氨基酸559的氨基酸序列。在較佳的實施方案中，Pablo Bcl-xL結合結構域包括從大約氨基酸436到大約氨基酸483的序列。
至于Bcl-xL結合結構域，術語“分離的Bcl-xL結合結構域”包括從包含全長Bcl-xL結合分子的氨基酸殘基(如Pablo)中分離出的結構域。例如，編碼分離的Bcl-xL結合結構域的核酸分子由編碼Pablo Bcl-xL結合結構域的Pablo核酸分子的該部分組成。同樣，分離的Pablo Bcl-xL結合結構域由含有Bcl-xL結合結構域氨基酸殘基的Pablo多肽的該部分組成。這些分離的Bcl-xL結合結構域與來自于制備過程的Pablo分子的其余部分分開(例如，與分子的氨基端氨基酸分開或與編碼分子氨基端氨基酸的核苷酸分開)。然后，這些分離的Bcl-xL結合結構域和Pablo Bcl-xL結合結構域可與其它核苷酸或氨基酸序列(例如載體序列或融合蛋白等)合并或相連。
“分離的”核酸分子是指那些與天然的核酸來源中存在的其它核酸分子分開的核酸分子。例如，對于基因組DNA，術語“分離的”包括從與基因組DNA天然相連的染色體中分離出的核酸分子。較佳的是，“分離的”核酸分子不含在生物體基因組DNA(該核酸分子從該DNA獲得)中天然地接在核酸分子兩側的序列(即，位于核酸分子5′和3′端的序列)。例如，在不同實施方案中，分離的Pablo核酸分子可含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的天然地接在細胞基因組DNA(從該DNA獲得該核酸序列)中該核酸序列兩側的核苷酸序列。另外，“分離的”核酸分子(如cDNA分子)可以基本上不含其它細胞物質或培養基(當用重組技術產生時)，或基本上不含化學前體或其它化學物質(當化學合成時)。然而，“分離的”Pablo核酸分子可以和通常在基因組DNA中并不接在Pablo序列兩側的其它核苷酸序列相連(例如，Pablo核苷酸序列可與載體序列相連)。在某些較佳的實施方案中，“分離的”核酸分子(如cDNA分子)也可不含其它細胞物質。然而，Pablo核酸分子被認為是“分離的”的情況不一定是不含其它細胞物質(例如，與其它哺乳動物DNA分開并插入細菌細胞的Pablo DNA分子仍然被認為是“分離的”)。
本文所用的術語“分離的蛋白質”或“分離的多肽”指當從細胞中分離出來或用重組DNA技術產生時基本上不含其它蛋白質、多肽、細胞物質和培養基的蛋白或多肽，或是當化學合成時不含化學前體或其它化學物質。“分離的”或“純化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含獲得該Pablo蛋白的細胞或組織來源的細胞物質或其它污染性蛋白，或者當化學合成時基本上不含化學前體或其它化學物質。術語“基本上不含細胞物質”包括Pablo蛋白制劑中蛋白與分離或重組產生該蛋白的細胞組分相分離。在一個實施方案中，術語“基本上不含細胞物質”包括Pablo蛋白制劑含有少于約30％(干重)的非Pablo蛋白(在本文中也稱為“污染性蛋白”)，更佳的少于約20％的非Pablo蛋白，還要佳的少于約10％非Pablo蛋白，最佳的少于約5％非Pablo蛋白。當Pablo蛋白或其生物活性部分用重組方法產生時，它最好也基本上不含培養基，即培養基宜少于約20％，更佳的少于約10％，最佳的少于蛋白制劑量的約5％。
術語“基本上不含化學前體或其它化學物質”指，Pablo蛋白的制劑中蛋白與參與該蛋白合成的化學前體或其它化學物質相分離。在一個實施方案中，術語“基本上不含化學前體或其它化學物質”指Pablo蛋白制劑含有少于約30％(干重)的化學前體或非Pablo化學物質，更佳的含有少于約20％的化學前體或非Pablo化學物質，還要佳的含有少于約10％的化學前體或非Pablo化學物質，最佳的含有少于約5％的化學前體或非Pablo化學物質。
本文所用的術語“神經細胞”包括神經細胞(即神經元，例如單極、雙極或多極神經元)和神經細胞前體以及神經膠質細胞(例如大神經膠質細胞如少突膠質細胞、神經膜細胞和星形膠質細胞，或小神經膠質細胞)和神經膠質細胞前體。在較佳的實施方案中，用于本發明的神經細胞是哺乳動物如人的從中樞或外周神經系統獲得的神經細胞。神經細胞前體也可用來實施本發明的方法。本文所用的術語“神經前體”指未分化的神經細胞，例如神經干細胞和神經祖細胞。本文所用的術語“神經干細胞”指能增殖并產生額外的能在適當條件下分化成神經祖細胞的神經干細胞的未分化的神經細胞。本文所用的術語“神經祖細胞”指衍生自神經干細胞的未分化的神經細胞，它能在合適條件下分化成神經細胞。術語“神經前體”還包括能誘導分化成神經細胞的全能性細胞(例如來自早期胚胎的發育能力沒有限制的細胞)。這些前體細胞可用作神經細胞的來源，即，用于本發明的神經細胞可從這些前體細胞衍生獲得。本文所用的術語“衍生”(相對于前體細胞)指從全能干細胞和多能干細胞發育或分化而來或以它們為祖先的細胞。獲得神經前體細胞(例如神經干細胞和/或祖先細胞)的方法是本領域中熟知的。例如，PCT出版物WO95/12665(1995年5月11日公開)、PCT出版物WO97/02049(1997年1月23日公開)、美國專利5,735,506中(這些文獻均納入本文作為參考)獲得的神經干細胞和祖細胞可用于本發明中來產生細胞。
本文所用的術語“調節Pablo活性或表達”包括上調和下調細胞中Pablo的活性或表達(例如在轉錄或翻譯水平上)。
術語“家族”在指蛋白和核酸分子時，指具有共同的結構域或基序且具有本文定義的足夠的氨基酸或核苷酸序列同源性的兩種或多種蛋白質或核酸分子。這些家族成員可天然存在或非天然存在，可來自相同或不同的動物種類。例如，一個家族可含有人源的第一個蛋白，以及人源的其它不同蛋白，或可含有非人源的同源物。家族成員也可具有共同的功能特征。
本文所用的術語“相互作用”指分子之間的可檢測的相互作用，這種相互作用例如可用酵母雙雜交試驗來檢測。術語“相互作用”也包括分子之間的結合“相互作用”。相互作用本質上可以是蛋白-蛋白之間或蛋白-核酸之間。
本文所用的術語“天然存在的”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如編碼天然蛋白)。
本文所用的術語“反義”核酸包括與編碼蛋白的“有義”核酸互補(例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補，與mRNA序列互補，或與基因的編碼鏈互補)的核苷酸序列。因此，反義核酸分子可以與有義的核酸分子氫鍵相連。
本文所用的術語“編碼區”指包含被翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列，而術語“非編碼區”指不翻譯成氨基酸的核苷酸序列(例如5′和3′非翻譯區)。
本文所用的術語“載體”指能運輸已與其相連的另一核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，它指環狀雙鏈DNA環，該環內可連接入額外的DNA片段。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可連接入病毒基因組中。某些載體能在其倒入的宿主細胞中自主復制(例如，細菌載體具有細菌復制起點和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在倒入宿主細胞中后整合到宿主細胞基因組中，從而和宿主基因組一起復制。另外，某些載體能指導與它們操作性相連的基因表達。這些載體在本文中稱為“重組型表達載體”或簡稱“表達載體”。通常，用于重組DNA技術的表達載體通常是質粒形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可互換，因為質粒是最通常使用的載體形式。然而，本發明還包括其它形式的表達載體，如病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們具有等價的功能。
本文所用的術語“宿主細胞”指這樣一種細胞，該細胞中導入了本發明的核酸分子(如本發明的重組表達載體)。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文中可互換使用。應當理解，這些術語不僅指特定的對象細胞，還指該細胞的后代或潛在的后代。由于后代可能會因突變或環境影響而發生某些變化從而使后代可能實際上與母細胞不同，但是它們仍然包括在本文所用術語的范圍內。較佳的宿主細胞是哺乳動物細胞，如人細胞。在特別佳的實施方案中，它是神經細胞。
本文所用的術語“異源DNA”或“異源核酸”包括這樣的DNA，它并非作為所存在的基因組中天然存在的一部分，或在基因組中所見的位置與其天然存在的位置不同，或與非天然正常連接的DNA操作性相連(即，與異源啟動子操作性相連的基因)。異源DNA不是天然存在于該位置上，或對于所導入的細胞不是內源性的，而是從另一細胞獲得的。異源DNA可來自相同或不同的動物種類。在一個實施方案中，它是哺乳動物型例如人型。被本領域技術人員認為對于其表達的細胞而言是異源或外來的DNA在本文中均包括在術語“異源DNA”中。相反，術語“內源性”用于核酸時，包括宿主細胞的天然DNA，即，并非導入、而是天然存在于生物體細胞或基因組中(即沒有用分子生物學技術改變或導入)的DNA。
術語“異源蛋白質”、“重組蛋白質”和“外源蛋白質”在本說明書中可互換使用，它們均指重組DNA技術產生的多肽，其中編碼多肽的DNA通常被插入合適的表達載體中，進而用該表達載體來轉化宿主細胞，以產生異源蛋白。即，多肽由異源核酸表達。
本文所用的術語“轉基因動物”指非人動物，較佳的是哺乳動物，更佳的是小鼠，其中該動物的一個或多個細胞包括“轉基因”。術語“轉基因”指這樣一種外源DNA，該DNA被整合入可發育成轉基因動物的細胞基因組中，并保留在成熟動物的基因組中，例如來指導所編碼的基因產物在轉基因動物的一種或多種細胞類型或組織中表達。
本文所用的術語“同源重組動物”指一種轉基因非人動物，較佳的是哺乳動物，更佳的是小鼠，其中內源性基因已經因內源性基因和導入該動物細胞(例如在動物發育前的動物胚胎細胞)的外源性DNA分子之間同源重組而改變。
本文所用的術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性部分，即含有能結合抗原的抗原結合部位(如Fab和F(ab′)2片段、單鏈抗體、胞內抗體、scFv、Fd或其它片段)的分子。較佳的，本發明的抗體特異性或基本上特異性地結合Pablo分子。本文所用的術語“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”指只含有一種能與抗原特定表位免疫反應的抗原結合部位的抗體分子群，而術語“多克隆抗體”和“多克隆抗體組合物”指含有多種能與特定抗原相互作用的抗原結合部位的抗體分子群。因此，單克隆抗體組合物通常表現出對與其免疫反應的特定抗原有單一的結合親和力。
本文所用的術語“Pablo相關的疾病(失調)”包括因調節Pablo活性或表達而受益的疾病。在一個實施方案中，Pablo相關的疾病是因調節Pablo活性或表達而受益的神經系統疾病。Pablo相關的疾病例子包括受益于細胞死亡增加或減少的中樞或周圍神經系統疾病。典型的疾病包括急性和慢性神經變性疾病，如中風、阿爾茨海默病、與阿爾茨海默病有關的癡呆(如Pick病)、帕金森病和其它Lewy彌散性身體疾病，亨庭頓氏病、脊髓性肌萎縮、多發性硬化、肌萎縮性側索硬化、進行性核上性麻痹、癲癇和Jakob-Creutzfieldt病；精神病，如抑郁癥、精神分裂、korsakoff精神異常、狂躁癥、焦慮癥、或恐懼癥；認知和記憶障礙，例如健忘或與年齡有關的記憶喪失；和神經性疾病，如偏頭痛。與Pablo相關的疾病的其它例子包括涉及不希望有的細胞增殖的疾病，例如癌，尤其是中樞或周圍神經系統癌。
II.分離的編碼Pablo或其部分的核酸分子在實施本發明方法中，可用各種試劑來調節細胞中Pablo的活性和/或表達。在一個實施方案中，該試劑是編Pablo多肽或其部分的核酸分子。下面將更詳細地描述這些核酸分子。
Pablo多肽的分析已經鑒定出在Pablo多肽C端約130個氨基酸內有一個介導Pablo和Bcl-xL相互作用的蛋白質區域。因此，本發明一方面涉及編碼Pablo多肽中與Bcl-xL分子相互作用的部分的核酸分子。
特定蛋白質的氨基酸序列和能編碼該蛋白的核苷酸序列之間有通過遺傳密碼(如下所示)來確定的已知的明確關系。同樣，特定核酸分子的核苷酸序列與該核酸分子所編碼的氨基酸序列之間也能通過遺傳密碼來確定的已知的明確關系。
遺傳密碼丙氨酸(Ala，A) GCA，GCC，GCG，GCT精氨酸(Arg，R) AGA，ACG，CGA，CGC，CGG，CGT天冬酰胺(Asn，N)AAC，AAT天冬氨酸(Asp，D)GAC，GAT半胱氨酸(Cys，C)TGC，TGT谷氨酸(Glu，E) GAA，GAG谷氨酰胺(Gln，Q)CAA，CAG甘氨酸(Gly，G) GGA，GGC，GGG，GGT組氨酸(His，H) CAC，CAT異亮氨酸(Ile，I)ATA，ATC，ATT亮氨酸(Leu，L) CTA，CTC，CTG，CTT，TTA，TTG賴氨酸(Lys，K) AAA，AAG甲硫氨酸(Met，M)ATG苯丙氨酸(Phe，F)TTC，TTT脯氨酸(Pro，P) CCA，CCC，CCG，CCT絲氨酸(Ser，S) AGC，AGT，TCA，TCC，TCG，TCT蘇氨酸(Thr，T) ACA，ACC，ACG，ACT色氨酸(Trp，W) TGG酪氨酸(Tyr，Y) TAC，TAT纈氨酸(Val，V) GTA，GTC，GTG，GTT
終止信號(末端)TAA，TAG，TGA遺傳密碼的一個重要而熟知的特征是它的簡并性，對于用來獲得該蛋白的大多數氨基酸而言，可由一個以上的核苷酸三聯體(如上所述)編碼。因此，有多個不同的核苷酸序列能編碼一個給定氨基酸序列。這些核苷酸序列被認為在功能上是等價的，因為它們能在所有生物中產生相同的氨基酸序列(雖然某些生物可能比其它生物更有效地翻譯某些序列)。另外，有時在給定核苷酸序列中可能會發現有嘌呤或嘧啶的甲基化變體。這些甲基化不影響三核苷酸密碼與對應氨基酸之間的編碼關系。
鑒于上述內容，可采用編碼本發明Pablo多肽(或其部分)的DNA或RNA分子的核苷酸序列，利用遺傳密碼將DNA或RNA分子翻譯成氨基酸序列，從而獲得Pablo氨基酸序列。同樣，對于任何Pablo氨基酸序列，可根據遺傳密碼推導出對應的核苷酸序列(由于冗余性，任何給定氨基酸序列會產生多個核酸序列)。因此，本文中關于Pablo核苷酸序列的描述和/或揭示應認為也包括了對該核苷酸序列編碼的氨基酸序列的描述和/或揭示。同樣，本文對于Pablo氨基酸序列的描述和/或揭示也應認為包括了對編碼該氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或揭示。本發明一方面涉及編碼Pablo蛋白或其生物活性部分的分離的核酸分子，以及足以用作雜交探針來鑒定編碼Pablo的核酸(如Pablo mRNA)的核酸片段，可作為PCR引物用于Pablo核酸分子擴增或突變的片段。應當理解，在討論Pablo核酸分子(如SEQ ID NO1所示)的用途時，可使用該核酸分子的片段和全長Pablo核酸分子。本文所用的術語“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但較佳的是雙鏈DNA。
本發明的核酸分子(如具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的核酸分子或其一部分)可用標準的分子生物學技術和本文提供的序列信息來分離。例如，利用所有或部分的SEQ ID NO1的核酸序列作為雜交探針，可用標準的雜交和克隆技術(如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.《分子克隆實驗指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)來分離Pablo核酸分子。
另外，可根據SEQ ID NO1的序列分別設計的合成寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應(PCR)來分離包括所有或部分SEQ ID NO1的核酸分子。
本發明的核酸可用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，用合適的寡核苷酸引物根據標準PCR擴增技術來擴增。如此擴增得到的核酸可克隆到合適的載體中，并通過DNA序列分析來表征。另外，可用標準的合成技術(如用DNA自動合成儀)來制備對應于Pablo核苷酸序列的寡核苷酸。
在一個較佳的實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一較佳的實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含這樣一個核酸分子，它是SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其部分的互補序列。與SEQ ID NO1所示核苷酸序列互補的核酸分子是與SEQ ID NO1所示核苷酸序列充分互補從而能與SEQ IDNO1所示核苷酸序列雜交形成穩定的雙鏈的序列。
在其它較佳的實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含這樣一種核苷酸序列，它與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(例如核苷酸序列的整個長度)或該核苷酸序列的一部分(例如SEQ ID NO1編碼的Bcl-xL結合結構域)有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同源性。
另外，本發明的核酸分子能僅僅包含SEQ ID NO1的核酸序列的一部分，例如，能用作探針或引物的片段或編碼Pablo蛋白生物活性部分的片段。從Pablo基因克隆測得的核苷酸序列能產生探針和引物，設計用于鑒定和/或克隆其它Pablo家族成員以及來自其它動物種類的Pablo家族同系物。探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸包含在嚴謹條件下與SEQ ID NO1的有義序列或SEQ ID NO1的天然存在的等位基因變體或突變體中至少約12或15個、較佳約20或25個、更佳約30、35、40、45、50、55、60、65、75或100個毗連的核苷酸雜交的核苷酸序列區域。在另一個實施方案中，本發明的核酸分子包含長度至少約400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000或1100個核苷酸、且在嚴謹雜交條件下與SEQ ID NO1的核酸分子或其互補序列雜交的核苷酸序列。
在另一實施方案中，本發明的核酸分子包含SEQ ID NO1的至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100個毗連的核苷酸。
在一個實施方案中，本發明的核酸分子與包含SEQ ID NO1中至少約300、400、500、600、700、800或900個核苷酸的核酸分子有至少70％的相同性，更佳的有80％的相同性，還要佳有90％的相同性。
基于Pablo核苷酸序列的探針可用來檢測編碼相同或同源蛋白質的轉錄物或基因組序列。在較佳的實施方案中，探針還包含與其相連的標記基團，例如該標記基團可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。這些探針可用作診斷測試試劑盒的一部分，用于鑒定錯誤表達Pablo蛋白的細胞或組織(尤其是神經細胞或組織)，例如對象細胞樣品中編碼Pablo的核酸水平，檢測Pablo mRNA水平或確定基因組Pablo基因是否突變或缺失。
編碼“Pablo蛋白生物活性部分的核酸片段”可以這樣來制得分離出SEQ IDNO1中編碼有Pablo生物活性(例如能結合Bcl-xL)的多肽的核苷酸序列部分，使Pablo蛋白的編碼部分表達(例如用體外重組表達)，然后評價Pablo蛋白的編碼部分的活性。
由于遺傳密碼簡并性與SEQ ID NO1不同、但所編碼的Pablo蛋白與SEQ IDNO1編碼的蛋白相同的核酸分子均包括在本發明中。因此，在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子具有編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質的核苷酸序列。
除了SEQ ID NO1所示的Pablo核苷酸序列外，本領域技術人員知道，一種群體(例如人群體)中可能存在導致Pablo蛋白質氨基酸序列變化的DNA序列多態性。Pablo基因中的這些遺傳多態性可能由于天然等位基因變異而存在于群體的個體中。本文所用的術語“基因”和“重組基因”指這樣的核酸分子，它包括編碼Pablo蛋白(較佳的是哺乳動物Pablo蛋白)的開放讀框，而且還可包括非編碼的調控序列和內含子。這些天然的等位基因變異包括功能性和非功能性的Pablo蛋白，通常會導致Pablo基因的核苷酸序列有1-5％的變異。Pablo基因中因天然等位基因變異而產生的且不改變Pablo蛋白功能活性的任何這些核苷酸變異和所得的氨基酸多態性均在本發明范圍內。
另外，具有與SEQ ID NO1的Pablo家族序列不同的核苷酸序列的編碼其它Pablo家族成員的核酸分子也在本發明范圍內。另外，編碼不同動物種類的Pablo蛋白因而具有與SEQ ID NO1的Pablo序列不同的核苷酸序列的核酸分子也在本發明范圍內。
對應于本發明Pablo分子的天然的等位基因變體和同系物的核酸分子可以根據它們與本文公開的Pablo核酸的同源性利用本文公開的cDNA或其部分作為雜交探針根據標準雜交技術來分離。例如，利用所有或部分的SEQ ID NO1作為雜交探針，用標準雜交技術(如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.《分子克隆實驗指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)來分離Pablo核酸分子。另外，包括所有部分Pablo基因的核酸分子可用根據SEQ ID NO1序列設計的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應來分離。例如，mRNA可利用Chirgwin等人(1979)Biochemistry 185294-5299的胍-硫氰酸酯萃取步驟從細胞中分離出來，cDNA可用逆轉錄酶(例如，Moloney MLV逆轉錄酶，購自Gibcol/BRL，Bethesda，MD；或AMV逆轉錄酶，購自Seikagaku，America，Inc.，St.Petersburg，FL)來制得。用于PCR擴增的合成的寡核苷酸引物可根據SEQ ID NO1所示的核苷酸序列來進行設計。本發明的核酸分子可用cDNA或基因組DNA作為模板，用合適的寡核苷酸引物根據標準PCR擴增技術來擴增。如此擴增得到的核酸可克隆到合適的載體中，并通過DNA序列分析來表征。另外，可用標準的合成技術(如用DNA自動合成儀)來制備對應于Pablo核苷酸序列的寡核苷酸。
在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子可用數學算法根據共有的核苷酸序列相同性來鑒定。這些算法在下文有更詳細的描述(例如見第III章)。
在其它實施方案中，本發明的分離的核酸分子長度至少為15、20、25、30或更多核苷酸，它在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補序列的核酸分子雜交。在其它實施方案中，核酸分子的長度至少為30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600個核苷酸。本文所用的術語“在嚴謹條件下雜交”描述了雜交和洗滌條件，在該條件下，相互間有至少30％、40％、50％或60％同源性的核苷酸序列通常保持相互雜交。較佳的，該條件使得相互間有至少約70％、更佳的至少約80％、還要佳的至少約85％或90％同源性的序列通常保持相互雜交。這些嚴謹的雜交條件是本領域技術人員已知的，并可在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。較佳的嚴謹雜交條件非限制性例子是在約45℃下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50-65℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗滌一次或多次。較佳的，在嚴謹條件下與SEQ ID NO1的序列或其互補序列雜交的本發明的分離的核酸分子與天然存在的核酸分子相對應。
本文所用的術語“天然存在”的核酸分子指具有天然具有的核苷酸序列(例如編碼天然蛋白)。除了SEQ ID NO1所示的Pablo核苷酸序列外，本領域技術人員知道，在一個群體內可能存在導致Pablo的核苷酸或氨基酸序列有微小變化的DNA序列多態性。Pablo基因中的這些遺傳多態性可能因天然等位基因變異而存在于群體的個體中。這些天然的等位基因變異會使基因核苷酸序列中產生1-2％的變異。Pablo中由天然等位基因變異產生的且不會改變Pablo多肽功能活性的這些核苷酸變異和導致的氨基酸多態性在本發明的范圍內。
除了群體中可能存在的Pablo序列的天然存在的等位基因變異外，本領域技術人員可以進一步知道，可通過誘變將微小的變化引入核苷酸序列(如SEQ ID NO1)中，從而在不改變Pablo蛋白功能活性的條件下改變編碼蛋白的氨基酸序列。例如，可對SEQ ID NO1序列作核苷酸置換，對“非必需”氨基酸殘基進行氨基酸置換。“非必需”氨基酸殘基是這樣一種殘基，它能在不改變Pablo分子功能活性的情況下從Pablo核酸分子的野生型序列(例如SEQ ID NO1的序列)改變得到。本領域技術人員能通過對Pablo相關分子進行氨基酸序列對比并確定非保守的殘基來確定非必需的因而可進行取代的殘基例子。由于這些殘基是不保守的，因此它們更適合進行置換。
因此，本發明另一方面涉及編碼Pablo蛋白質的核酸分子，其中該蛋白有對于Pablo活性非必需的氨基酸殘基變化。這些Pablo蛋白質的氨基酸序列與SEQ ID NO2不同，但是保留了Pablo的固有活性。在SEQ ID NO1的核苷酸序列中導入一個或多個核苷酸置換、加入或缺失，制得編碼非天然Pablo蛋白變體的分離的核酸分子，從而在所編碼的蛋白質內引入一個或多個氨基酸置換、加入或缺失。可用標準技術(如定點誘變和PCR介導的誘變技術)將突變引入SEQ ID NO1中。可在一個或多個非必需氨基酸殘基處進行保守性氨基酸置換。“保守性氨基酸置換”是指一氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基代替。本領域中已經確定了具有類似側鏈的氨基酸殘基家族，這些側鏈包括堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、未帶電荷的極性側鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，Pablo中的非必需氨基酸殘基可用同一側鏈家族中的其它氨基酸殘基來代替。
或者，在另一實施方案中，可用飽和誘變在Pablo編碼序列的全部或部分中隨機引入突變，篩選所得突變體與DNA結合和/或激活轉錄的能力，以鑒定保留功能活性的突變體。在誘變后，編碼的Pablo突變蛋白可在宿主細胞中重組表達，用本領域中現有的測定Pablo活性的試驗來測定突變蛋白的功能活性。
本發明另一方面涉及編碼Pablo融合蛋白的分離的核酸分子。這些核酸分子包含至少第一個編碼全長Pablo蛋白、具有Pablo活性的多肽或肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與編碼非Pablo蛋白、多肽或肽的第二核苷酸序列操作性相連。這些核酸分子可用標準的重組DNA技術來制得。
在較佳的實施方案中，可測定突變的Pablo蛋白的以下能力1)與Bcl-xL結合的能力和/或)調節凋亡(較佳的是神經細胞，例如中樞或周圍神經系統的細胞的凋亡)的能力。
除了上述編碼Pablo蛋白的核酸分子外，本發明另一方面涉及一種與該核酸分子反義的分離的核酸分子。“反義的”核酸分子包含與編碼蛋白質的“有義”的核酸分子互補(例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補，或與mRNA序列互補)的核苷酸序列。因此，反義核酸分子能與有義的核酸分子氫鍵結合。反義核酸分子能與整個Pablo編碼鏈互補，或只與其部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子與編碼Pablo的核苷酸序列編碼鏈的“編碼區”反義。術語“編碼區”指含有能翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區域。在另一實施方案中，反義核酸分子與編碼Pablo的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區”反義。術語“非編碼區”指接在編碼區側翼、不翻譯成氨基酸的5′端和3′端序列(即，也稱為5′和3′非翻譯區)。
在給出了本文所公開的編碼Pablo的編碼鏈序列后，可根據Watson和Crick堿基配對原則設計本發明的反義核酸分子。反義核酸分子能與Pablo mRNA的整個編碼區互補，但是更佳的是僅僅與Pablo mRNA的編碼區或非編碼區部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸能與Pablo mRNA翻譯起始位點周圍的區域互補。反義寡核苷酸的長度例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。本發明的反義核酸可用本領域已知的步驟通過化學合成和酶促連接反應來構建。例如，可用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸來化學合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，其中各種修飾的核苷酸被設計成使分子的生物穩定性提高或使反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定性提高，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用來產生反義核酸的修飾的核苷酸例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可在表達載體中反義方向亞克隆入核酸(即，從插入的核酸轉錄的RNA將是靶核酸的反義方向，這在下文有進一步描述)，通過生物學方法產生反義核酸。
通過將本發明的反義核酸分子給予對象或由其原位產生，從而使它們與編碼Pablo蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結合，從而例如通過抑制轉錄和/或翻譯來抑制蛋白的表達。雜交可以是通過常規的核苷酸互補形成穩定的雙鏈體，或者，例如在與DNA雙鏈體結合的反義核酸分子情況下，通過雙鏈螺旋體的大凹槽進行特異性相互作用。本發明反義核酸分子的給藥途徑例子包括直接注射在組織部位。或者，可對反義核酸分子進行修飾，以靶向所選細胞，然后全身給藥。例如，對于全身給藥，可以修飾反義分子(例如將反義核酸分子與結合細胞表面受體或抗原的肽或抗體相連)，使它們與所選細胞表面上表達的受體或抗原特異性結合。反義核酸分子也可用本文描述的載體來輸送給細胞。為了獲得反義分子的足夠的胞內濃度，反義核酸分子在強pol II或pol III啟動子控制下的載體構建物是較佳的。
在其它實施方案中，本發明的反義核酸分子是α-異頭核酸分子。異頭核酸分子與互補RNA形成特異性雙鏈雜交物，在該雙鏈雜交物中，與通常的β-單元不同，鏈通常是相互平行的(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res.156625-6641)。反義核酸分子也可包括2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人.(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等人.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
在另一實施方案中，本發明的反義核酸是核酶。核酶是具有核酸酶活性的催化性RNA分子，它能切割有互補區域的單鏈核酸(如mRNA)。因此，核酶(例如，錘頭核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591))可用來催化性切割Pablo mRNA轉錄物，從而抑制Pablo mRNA的翻譯。對編碼Pablo的核酸有特異性的核酶可根據SEQ ID NO1的核苷酸序列來設計。例如可構建血膜蟲(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列與編碼Pablo的mRNA中待切割的核苷酸序列互補。例如參見，Cech等人，美國專利4,987,071；和Cech等人，美國專利5,116,742。或者，可用Pablo mRNA來從RNA分子庫中選出具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如參見，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418。
或者，可靶向與Pablo調控區域(例如Pablo啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，形成防止Pablo基因在靶細胞中轉錄的三聯螺旋結構，抑制基因表達。通常見，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
在另一實施方案中，本發明的Pablo核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上進行修飾，以提高例如穩定性、雜交或分子的溶解度。例如，可修飾核酸分子的脫氧核糖磷酸骨架來產生肽核酸(見Hyrup B.等人(1996)Bioorganic&MedicinalChemistry 4(1)5-23)。本文所用的術語“肽核酸”或“PNA”指核酸模擬物，例如，DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸骨架被假肽骨架代替，只有四個核堿基被保留。PNA的中性骨架顯示出能在低離子強度條件下與DNA和RNA特異性雜交。PNA寡聚物的合成可用標準的固相肽合成程序來進行(如Hyrup B.等人.(1996)同上；Perry-O′Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.9314670-675)。
Pablo核酸分子的PNA可用于治療和診斷用途。例如，PNA可用作反義或抗基因劑用以序列特異性地調節基因表達，例如誘導轉錄或翻譯停止或抑制復制。Pablo核酸分子的PNA還可用于分析基因中單堿基對突變(例如，用PNA-定向PCR夾)；當與其它酶(例如S1核酸酶(Hyrup.B(1996)同上)合用時，作為“人工限制性酶”；或作為探針或引物用于DNA測序或雜交(Hyrup B.等人(1996)同上；Perry-O′Keefe，同上)。
在另一實施方案中，Pablo的PNA可通過將親脂性或其它輔助基團與PNA相連(通過形成PNA-DNA嵌合體或利用脂質體或本領域已知的其它藥物輸送技術)來進行修飾(例如用于增強其穩定性或細胞攝取)。例如，可產生將PNA和DNA的優點結合起來的Pablo核酸分子的PNA-DNA嵌合體。這些嵌合體使得DNA識別酶(例如RNA酶和DNA聚合酶)與DNA部分相互作用，而PNA部分將提供高的結合親和性和特異性。PNA-DNA嵌合體可用長度合適的接頭來連接，該接頭的長度根據堿基堆疊、核堿基之間的鍵數以及取向(Hyrup B.(1996)同上)來加以選擇。PNA-DNA嵌合體的合成可如Hyrup B.(1996)(同上)和Finn P.J.等人.(1996)Nucleic Acids Res.24(17)3357-63中描述的那樣來進行。例如，可用標準的磷酰胺偶聯化學物質和修飾的核苷酸類似物將DNA鏈合成在固體載體上，例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脫氧-胸苷磷酰胺可用于PNA和DNA 5′端之間(Mag，M.等人(1989)Nucleic Acids Res.175973-88)。然后分布連接PNA單體，產生具有5′PNA片段和3′DNA片段的嵌合分子(Finn P.J.等人(1996)同上)。或者，可用5′DNA片段和3′PNA片段來合成嵌合分子(Peterser，K.H.等人.(1975)Bioorganic Med.Chem.Lett.51119-11124)。
在其它實施方案中，寡核苷酸可包括其它懸掛的基團，如肽(例如用來靶向體內宿主細胞受體)或實現穿膜輸送的試劑(例如參見Letsinger等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等人.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84648-652；PCT出版物WO88/09810)或血腦屏障(例如參見PCT出版物WO89/10134)。另外，可用雜交引發的斷裂劑來修飾寡核苷酸(例如參見Krol等人.(1988)Bio-Techniques 6958-976)或嵌入劑。(例如參見Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)。為了這個目的，寡核苷酸可與其它分子偶聯(例如肽、雜交引發的交聯劑、輸送劑或雜交引發的斷裂劑)。
反義多核苷酸可從轉染子細胞或轉基因細胞中的異源表達盒產生。或者，反義多核苷酸可包含給予外部環境(體外培養環境或體內循環系統或間質體液)的可溶的寡核苷酸。外部環境中的可溶性反義多核苷酸顯示出能進入細胞質并抑制特異性mRNA種類的翻譯。
III.分離的Pablo蛋白、其片段和抗Pablo抗體在另一實施方案中，可用來調節Pablo活性或表達的試劑是Pablo蛋白及其有生物活性的部分，以及適合用作免疫原來產生抗Pablo抗體的多肽片段。在一個實施方案中，可用標準的蛋白質純化技術通過合適的純化技術來從細胞或組織來源中分離出天然的Pablo蛋白質。在另一實施方案中，用重組DNA技術產生Pablo蛋白質。除了重組表達，Pablo蛋白或多肽可用標準的肽合成技術化學方法合成。應當理解，在討論例如SEQ ID NO2所示Pablo蛋白的用途時，這些并非全長Pablo多肽的蛋白質的片段(例如SEQ ID NO2中所示的Bcl-xL結合結構域)以及全長Pablo蛋白可以使用。
本發明另一方面涉及分離的Pablo蛋白。較佳的，該Pablo蛋白包含SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列或其部分。在另一較佳實施方案中，蛋白質包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其部分。在其它實施方案中，蛋白質與SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其部分(例如SEQ ID NO2中的Bcl-xL結合結構域)有至少50％、至少60％的氨基酸相同性，更佳的有70％的氨基酸相同性，更佳的有80％、還要佳的有90％或95％的氨基酸相同性。Pablo多肽分子的較佳部分是有生物活性的，即，其編碼的Pablo多肽部分能結合Bcl-xL和/或調節細胞(較佳的是神經細胞，例如中樞或外周神經系統的細胞)中的凋亡。
Pablo蛋白的生物活性部分包括肽，該肽包含與Pablo蛋白的氨基酸序列有足夠的同源性或從其衍生獲得的氨基酸序列(例如是Pablo蛋白的改變形式)，該肽的氨基酸比全長Pablo蛋白少(例如是Pablo的截短形式)，并表現出Pablo蛋白的至少一種活性。在一個有關的實施方案中，Pablo蛋白的生物活性部分是Pablo的顯性失活突變體。本文所用的術語“顯性失活突變體”包括這樣一種蛋白質改變形式(例如截短或突變的形式)，當它導入細胞中并表達后，它能抑制或破壞相應的未改變的內源性蛋白的活性。
為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列之間的相同性百分數，將序列進行對比以獲得最適合的比較(例如，為了最適合的排列，第一和第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中可引入孔隙)。在較佳的實施方案中，用于序列對比的參照序列長度至少為參照序列長度的30％，較佳的至少為40％，更佳的至少50％，尤佳的至少60％，還要佳的至少70％、80％或90％。然后比較在相應的g位置的殘基，當一個序列中的位置被另一序列中對應位置中的相同殘基占據，則該分子在該位置上是相同的。因此，兩個序列之間的相同性百分數是兩個序列共有的相同位置數的函數(即，相同性％＝相同位置數/位置總數×100)。兩個序列之間的相同性百分數是序列共有相同位置數并結合孔隙數、每一孔隙的長度(孔隙是為了兩個序列有最優的排列對比而導入的)來加以考慮的。本文所用的氨基酸或核酸的“相同性”等價于氨基酸或核酸的“同源性”。
兩個序列之間的序列比較和相同性百分數的測定可用數學算法來實現。用于序列比較的一個非限制性的數學算法是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264中的算法，該算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873中有所改進。該算法結合入Altschul，等人.(1990)J.Mol.Biol.215403的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜尋可以采用NBLAST程序評分為100、字長為12來進行，以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜尋可用XBLAST程序評分為50、字長為3來進行，以獲得與本發明蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了獲得有孔隙的排列對比以便進行比較，采用了Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389中描述的Gapped BLAST。在用BLAST和Gapped BLAST程序時，可采用各程序(例如XLBAST和NBLAST)的缺省參數。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.用于序列比較的另一較佳的非限制性算法是Myers和Miller，CABIOS(1989)中的算法。將這些算法結合入作為GCG序列對比軟件包一部分的ALIGN程序(2.0版)。當用ALIGN程序來比較氨基酸序列時，可采用PAM120權重殘基表、孔隙長度罰分為12，孔隙罰分為4。
用于蛋白質序列對比的另一非限制性的數學算法例子是Lipman-Person算法(Lipman和Pearson(1985)Science 2271435)。當采用Lipman-Person算法時，可采用PAM250權重殘基表，孔隙長度罰分為12，孔隙罰分為4，Kutple為2。用于比較核酸序列的較佳的非限制性數學算法例子是Wilbur-Lipman算法(Wilbur和Lipman(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726)。當采用Wilbur-Lipman算法時，可采用窗框為20、孔隙罰分為3，Ktuple值為3。Lipman-Pearson算法和Wilbur-Lipman算法均例如結合入作為DNASTAR序列分析軟件包一部分的MEGALIGN程序(例如3.1.7版)中。
其它用于序列分析的算法是本領域中已知的，包括Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.103中描述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman(1988)PNAS 852444中描述的FASTA。
在較佳的實施方案中，用GCG軟件包中的GAP程序，用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣、16、14、12、10、8、6或4的孔隙權重以及1、2、3、4、5或6的長度權重，測定兩個氨基酸序列之間的相同性百分數。在另一較佳的實施方案中，用GCG軟件包中的GAP程序、并用NWSgapdna、CMP矩陣、40、50、60、70或80的孔隙權重以及1、2、3、4、5或6的長度權重確定兩個核苷酸序列之間的相同性百分數。
蛋白質序列對比也可用Geneworks全球蛋白質序列對比程序(2.5.1版)來進行，開放孔隙的罰分為5，長度孔隙的罰分為5，最小對角長度設定為4，最大對角補償值設定為130，共有截短設定為50％，采用Pam 250矩陣。
本發明的核酸和蛋白質序列能進一步用作“詢問序列”來搜索公眾數據庫，例如來鑒定其它家族成員或有關的序列。這些搜索可用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215430-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)來進行。BLAST核苷酸搜尋可以采用NBLAST程序、評分為100、字長為12來進行，以獲得與本發明的Pablo核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜尋可用XBLAST程序、評分為50、字長為3來進行，以獲得與本發明Pablo蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了獲得有孔隙的排列對比以便進行比較，可采用Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中描述的Gapped BLAST。在用BLAST和Gapped BLAST程序時，可采用各程序(例如XLBAST和NBLAST)的缺省參數。例如，本發明的核苷酸序列可用缺省的Blastn矩陣1-3來分析(孔隙罰分設定為存在為11，伸長為1)。本發明的氨基酸序列可用以下缺省設置來分析Blosum 62矩陣，孔隙罰分設定為存在為11，伸長為1。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.
本發明還提供了Pablo的嵌合或融合蛋白。本文所用的Pablo的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括Pablo多肽以及與其操作性相連的非Pablo多肽。“Pablo多肽”指具有對應于Pablo多肽的氨基酸序列的多肽，而“非Pablo多肽”指該多肽具有的氨基酸序列所對應的蛋白質基本上與Pablo蛋白不同源，例如，與Pablo蛋白不同且從相同或不同生物種類衍生獲得的蛋白質。在Pablo融合蛋白中，Pablo多肽能對應于所有一部分Pablo蛋白。在較佳的實施方案中，Pablo融合蛋白包括Pablo蛋白的至少一個有生物活性的部分，例如Bcl-xL結合結構域。在融合蛋白中，術語“操作性相連”指Pablo多肽和非Pablo多肽在符合讀框地相互融合。非Pablo多肽可以與Pablo多肽的N端或C端融合。
例如，在一個實施方案中，融合蛋白是有GST-Pablo成員的融合蛋白，其中Pablo成員序列與GST序列的C端融合。在另一實施方案中，融合蛋白是Pablo-HA融合蛋白，其中將Pablo成員核苷酸序列插入載體(如pCEP4-HA載體，Herrscher，R.F.等人.(1995)Genes Dev.93067-3082)中，從而使Pablo成員序列與流感病毒血凝素表位尾序列讀框融合。該融合蛋白使重組Pablo成員的純化變得便利。
重組技術產生的融合蛋白和肽可從細胞混合物以及含有蛋白質或肽的培養基中分泌和分離出來。或者，蛋白質或肽可保留在胞質內，然后收獲細胞、裂解并分離蛋白質。細胞培養物通常包括宿主細胞、培養基和其它副產物。用于細胞培養的合適培養基是本領域中熟知的。蛋白質和肽可用本領域中已知用來純化蛋白質和肽的技術從細胞培養液、宿主細胞或兩者中分離出來。轉染宿主細胞以及純化蛋白質和肽的技術是本領域中已知的。
較佳的，本發明的Pablo融合蛋白可用標準的重組DNA技術來制得。例如，按照常規技術將編碼不同多肽序列的DNA片段符合讀框地連接在一起，例如采用便于連接的平頭或錯頭末端，進行限制性酶消化以得到合適的末端，適當地填平粘端，用堿性磷酸酶處理以免不必要的連接，以及酶促連接。在另一實施方案中，融合基因可用常規技術(包括DNA自動合成儀)來合成。或者，可進行基因片段的PCR擴增，用錨定引物在兩個連續的基因片段之間產生互補的突出端，隨后退火，重新擴增產生嵌合的基因序列(例如參見Current Protocols in Molecular Biology編，Ausubel等人.JohnWiley&Sons1992)。另外，已經編碼了一個融合部分(例如GST多肽或HA表位尾序列)的許多表達載體可市售購得。將編碼Pablo的核酸分子克隆到該表達載體中，使得該融合部分與Pablo蛋白讀框相連。
在另一實施方案中，融合蛋白是N端有異源信號序列的Pablo蛋白。在某些宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中，通過使用異源的信號序列可提高Pablo的表達和/或分泌。本發明的Pablo融合蛋白可摻入藥物組合物中并給予對象體內。Pablo融合蛋白可能在治療上可用來治療疾病(如癌癥或阿爾茨海默病)。另外，本發明的Pablo融合蛋白可用作免疫原在對象體內產生抗Pablo抗體。
本發明的Pablo嵌合或融合蛋白宜用標準的重組DNA技術來產生。例如，根據常規技術(例如采用便于連接的平頭或錯頭末端，進行限制性酶消化以得到合適的末端，適當地填平粘端，用堿性磷酸酶處理以免不必要的連接，以及酶促連接)，將編碼不同多肽序列的DNA片段連接起來。在另一實施方案中，融合基因可用常規技術(包括DNA自動合成儀)來合成。或者，可進行基因片段的PCR擴增，用錨定引物在兩個連續的基因片段之間產生互補的突出端，隨后退火，重新擴增產生嵌合的基因序列(例如參見Current Protocols in Molecular Biology編，Ausubel等人.John Wiley&Sons1992)。另外，已經編碼了一個融合部分(例如GST多肽)的許多表達載體可市售購得。將編碼Pablo的核酸分子克隆到該表達載體中，使得該融合部分與Pablo蛋白讀框相連。
本發明還涉及起Pablo激動劑(模擬物)或Pablo拮抗劑作用的Pablo蛋白變異體。Pablo蛋白變體可用諸如不連續的點突變或截短Pablo蛋白等誘變方式來產生。Pablo蛋白激動劑可以基本上保留與Pablo蛋白天然存在的形式相同或其一部分的生物活性。Pablo蛋白的拮抗劑能通過例如競爭性地調節Pablo蛋白的細胞活性來抑制天然型Pablo蛋白的一種或多種活性。因此，通過用功能受限的變體處理，能引發特異性的生物學效果。在一個實施方案中，相對于用天然型Pablo蛋白處理而言，用具有一部分天然型蛋白生物活性的變體處理對象在體內有較少的副作用。
在一個實施方案中，本發明涉及Pablo衍生物，它可通過本領域已知的氧化、還原或其它衍生處理方法來修飾至少一種氨基酸殘基而形成。
在一個實施方案中，起Pablo激動劑(模擬物)或Pablo拮抗劑作用的Pablo蛋白變體可通過篩選Pablo蛋白突變體(例如截短突變體)組合文庫中具有激動劑或拮抗劑活性的Pablo蛋白來鑒定。在一個實施方案中，通過在核酸水平組合誘變，產生一個由混雜基因庫編碼的混雜的Pablo蛋白庫。混雜的Pablo變體庫例如可這樣來產生將合成的寡核苷酸混合物酶促連接成基因序列，使得簡并的一系列潛在的Pablo序列可表達成單獨的多肽或者其中有該系列Pablo序列的一系列較大的融合蛋白(例如用于噬菌體展示)。從簡并的寡核苷酸序列產生潛在Pablo變體文庫可采用各種方法。簡并的基因序列的化學合成可在DNA自動合成儀中進行，然后將合成的基因連接到合適的表達載體中。一系列簡并基因的使用能在一個混合物中提供編碼所需潛在Pablo序列的所有序列。合成簡并寡核苷酸的方法是本領域中已知的(例如參見Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人.(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
另外，可用Pablo蛋白編碼序列的片段文庫來產生混雜的Pablo片段群，以便篩選并隨后選出Pablo蛋白的變體。在一個實施方案中，編碼序列片段的文庫可這樣來產生在一定條件下用核酸酶處理Pablo編碼序列的雙鏈PCR片段(其中每個分子僅僅發生一次切割)，使雙鏈DNA變性，使DNA復性形成雙鏈DNA(該DNA可包括不同切割產物的有義/反義配對)，通過S1核酸酶處理除去重新形成的雙鏈體中單鏈部分，將所得的片段文庫連接入表達載體中。利用該方法，可獲得編碼Pablo蛋白的不同大小的N端、C端和中間片段的表達文庫。
在點突變或截短獲得的組合文庫中篩選基因產物，以及在cDNA文庫中篩選具有所選性質的基因產物的幾種技術是本領域中已知的。這些技術可改進用來迅速篩選組合誘變產生的Pablo蛋白的基因文庫。適合大量分析的篩選大基因文庫所最廣泛采用的技術通常包括，將基因文庫克隆到可復制的表達載體中，將所得載體庫轉化合適的細胞，在一定條件下表達該組合基因，該條件下，通過檢測所需活性能分離出具有編碼所檢測產物的基因的載體。遞歸整體誘變(REM)—一種增強文庫中功能性突變體頻率的技術—可用于和篩選試驗組合用于鑒定Pablo變體(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave等人.(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
在一個實施方案中，可用基于細胞的試驗來分析混雜的Pablo庫。例如，可將表達載體庫轉染到通常合成并分泌Pablo的細胞系中。然后，培養轉染的細胞，使Pablo和特定的突變型Pablo分泌，突變體的表達對細胞上清液中Pablo活性的影響可通過例如許多酶促試驗來檢測。然后，從Pablo活性受抑制或增強的細胞中回收質粒DNA，再進一步鑒定單個克隆。
除了僅僅由天然存在的氨基酸組成的Pablo多肽外，還可提供Pablo多肽模擬物。肽類似物在藥物工業中常用作具有與模板肽相似性質的非肽藥物。這些類型的非肽化合物成為“肽模擬物”(Fauchere，J.(1986)Adv.Drug Res.1529；Veber和Freidinger(1985)TINS 392頁；和Evans等人.(1987)J.Med.Chem.301229，這些文獻均納入本文作為參考)，通常依靠計算機模型設計來產生。肽模擬物在結構上與治療上有用的肽相似，可用來產生等價的治療或預防效果。肽模擬物在結構上與樣本多肽(即，具有生物學或藥物學活性的多肽，如人Pablo)相似，但是有一個或多個肽鍵被選自下列的鍵任選地代替-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，這些代替方法是本領域中已知的且在下列文獻中有進一步的描述Spatola，A.F.“氨基酸、肽和蛋白質的化學性質和生物活性性質”，B.Weinstein編，Marcel Dekker，New York，267頁(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)，卷1，論文3，“肽骨架的修飾”(綜述)；Morley，J.S.，Trends Pharm Sci(1980)463-468頁(綜述)；Hudson，D.等人.，Int J Pept Prot Res(1979)14177-185(-CH2NH-，-CH2CH2-)；Spatola，A.F.等人.Life Sci(1986)381243-1249(-CH2-S)；Hann，M.M.，JChem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(-CH-CH-，順式和反式)；Almquist，R.G.等人.J.Med.Chem.(1980)231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.等人.，TetrahedronLett(1982)232533(-COCH2-)；Szelke，M.等人.，歐洲申請EP45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等人.，Tetrahedron Lett(1983)244401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby，V.J.，Life Sci(1982)31189-199(-CH2-S-)；上述這些文獻均納入本文作為參考。特別佳的非肽鍵是-CH2NH-。這些肽模擬物可能具有比多肽實例更顯著的優點，例如，生產上更經濟，化學穩定性更高，藥物性能(半衰期、吸收性、藥效、效果等)增強，特異性改變(例如有廣譜生物活性)、抗原性減少和其它優點。肽模擬物的標記通常涉及將一個或多個標記直接或通過間隔物(如酰胺基團)共價連接到肽模擬物上非干擾性的位置(可通過定量的結構活性數據和/或分子模型設計來預測)。這些非干擾性的位置通常位于不與該肽模擬物產生治療效果所要結合的大分子直接接觸的位置上。肽模擬物的衍生處理(例如標記)不應對肽模擬物的所需生物或藥物活性有很大的干擾。
用相同類型的D-氨基酸來系統性地置換Pablo氨基酸序列中的一個或多個氨基酸(例如用D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用來產生更穩定的肽。另外，包含Pablo氨基酸序列或基本上相同的序列變化的受約束的肽可用本領域已知的非法來產生(Rizo和Gierasch(1992)Ann.Rev.Biochem.61387，納入本文作為參考)；例如，使能形成分子內二硫鍵使肽環化的內部半胱氨酸殘基。
本文確定的Pablo多肽的氨基酸序列使本領域技術人員能產生對應于Pablo肽序列及其序列變體的多肽。這些多肽可由編碼Pablo肽序列的多核苷酸在原核或真核宿主細胞中表達來產生。或者，這些肽可用化學方法合成。在重組宿主中表達異源蛋白的方法、多肽的化學合成以及體外翻譯均是本領域中熟知的，并且在納入本文作為參考的以下文獻中有所描述Maniatis等人的《分子克隆實驗指南》(1989)第2版ColdSpring Harbor，N.Y.；Berger和Kimmel，《酶學方法》，152卷，Guide to Molecular CloningTechniques(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Merrifield，J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91501；Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11255；Kaiser等人.(1989)Science 243187；Merrifield，B.(1986)Science 232342；Kent，S.B.H.(1988)ann.rev.Biochem.57957；和Offord，R.E.(1980)Semisynthetic Proteins，Wiley Publishing。
肽通常可用直接的化學合成來制得，并例如用作Pablo/Pablo結合蛋白(如Bcl-xL)相互作用的激動劑或拮抗劑。肽可制成經修飾的肽形式，其N端和/或C端與非肽部分共價連接。在某些較佳的實施方案中，羧基端或氨基端或兩者均經過化學修飾。末端氨基和羧基的最常見修飾分別是酰基化和酰胺化。本發明的各個實施方案中可結合入氨基端修飾(如酰化(如乙酰化)或烷基化(例如甲基化))，羧基端修飾(例如酰胺化)、以及其它末端修飾(包括環化)。對于核心序列的某些氨基端和/或羧基端修飾和/或肽延伸能提供有利的物理、化學、生物化學和藥物學性質，例如穩定性增強、效力和/或效果提高、抗血清蛋白酶、具有所需的藥物動力學性質和其它性質。該肽在治療上可用來治療疾病，例如改變患者細胞群的凋亡過程。
分離的Pablo蛋白或其部分或片段也可用作免疫原，利用標準的多克隆和單克隆抗體制備技術來產生Pablo結合抗體。全長Pablo蛋白可用作免疫原，或者，本發明提供了Pablo的抗原性肽片段作為免疫原。Pablo的抗原性肽包括至少8個氨基酸殘基，并包括一個Pablo表位，從而使針對該肽產生的抗體與Pablo形成特異性的免疫復合物。抗原性肽宜包含至少10個氨基酸殘基，更佳的有至少15個氨基酸殘基，更佳的有至少20個氨基酸殘基，最佳的有至少30個氨基酸殘基。
或者，Pablo多肽的抗原性肽片段可用作免疫原。Pablo多肽的抗原性肽片段通常包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的至少8個氨基酸殘基，并包括Pablo多肽的一個表位，從而使針對該肽產生的抗體與Pablo分子形成了免疫復合物。抗原性肽所包含的表位宜是位于蛋白表面上的Pablo區域，例如親水性區域。在一個實施方案中，抗體與Pablo分子顯著特異性結合。在另一實施方案中，抗體與Pablo多肽特異性結合。
抗原性肽宜包含至少約10個氨基酸殘基，更佳的有至少15個氨基酸殘基，更佳的有至少約20個氨基酸殘基，最佳的有至少約30個氨基酸殘基。抗原性肽所包含的表位宜為位于蛋白表面上的Pablo多肽區域，例如親水性區域，而且是Pablo多肽所特有的。在一個實施方案中，這樣的肽對于來自一種動物種類(如小鼠或人)的Pablo蛋白有特異性(即，將跨越種間非保守的Pablo多肽區域的抗原性肽作為免疫原；這些非保守的殘基可用諸如本文提供的序列對比方法來確定)。對蛋白質進行標準的疏水性分析，以鑒定親水性區域。在一個實施方案中，可用包含從約氨基酸436到約氨基酸451的肽片段作為免疫原。
Pablo免疫原通常通過用該免疫原對合適對象(例如家兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物)進行免疫接種來制備抗體。合適的免疫原性制備物例如可含有重組表達的Pablo蛋白或化學合成的Pablo肽。該制備物可進一步包括佐劑，例如Freund完全或不完全佐劑或類似的免疫刺激劑。用免疫原性Pablo制備物對合適對象進行免疫接種誘導產生了多克隆抗Pablo抗體應答。
因此，本發明另一方面涉及抗Pablo抗體的使用。多克隆抗Pablo抗體可如上所述通過Pablo免疫原免疫接種合適對象來制得。用標準技術(例如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，采用固定化的Pablo多肽)監測受免疫對象體內的抗Pablo抗體滴度隨時間的變化。如果需要，可從哺乳動物中(例如血中)分離出針對Pablo多肽的抗體分子，并用熟知的技術(例如蛋白質A層析)作進一步純化，獲得IgG級分。在免疫接種后的合適時間，例如當抗Pablo抗體滴度最高時，獲得對象的產生抗體的細胞，用標準技術來制備單克隆抗體，該標準技術例如是雜交瘤技術(最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256495-497)描述(另見，Brown等人.(1981)J.Immunol 127539-46；Brown等人.(1980)J.Biol.Chem.2554908-83；Yeh等人.(1976)PNAS 762927-31；和Yeh等人.(1982)Int.J.Cancer 29269-75))、最近的EBV雜交瘤技術(Cole等人.(1985)，《單克隆抗體和癌癥治療》，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁)或三瘤(trioma)技術。生產單克隆抗體雜交瘤的技術是熟知的(通常見R.H.Kenneth《單克隆抗體生物學分析中的新領域》，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale.J.Biol.Med.，54387-402；M.L.Gefier等人.(1977)Somatic Cell Genet.，3231-36)。簡言之，將無限增殖細胞系(通常是骨髓瘤)與來自經上述Pablo免疫原免疫的哺乳動物淋巴細胞(通常是脾細胞)融合，篩選所得雜交瘤細胞的培養上清，鑒定產生與Pablo多肽特異性結合單克隆抗體的雜交瘤。
眾多熟知的用于融合淋巴細胞和無限增殖細胞系的熟知程序的任一種均適合用于生產抗Pablo單克隆抗體的目的(例如參見，G.Galfre等人.(1977)Nature 26655052；Gefter等人.Somatic Cell Genet.，同上；Lerner，Yale J.Biol.Med.，同上；Kenneth，單克隆抗體，同上)。另外，一般技術人員會理解，這些方法許多變化方案也是有用的。無限增殖細胞系通常從與淋巴細胞相同的哺乳動物種類獲得。例如，將經本發明免疫原性制備物免疫的小鼠淋巴細胞與無限增殖的小鼠細胞系融合，可制得小鼠雜交瘤。較佳的無限增殖的細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，它對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶胸苷的培養基(HAT培養基)敏感。眾多骨髓瘤細胞系中的任一種均可根據標準技術用作融合伙伴，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤細胞系。這些骨髓瘤系購自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Rockville，Md)。HAT敏感型小鼠骨髓瘤細胞通常用聚乙二醇(PEG)來與脾細胞融合。然后用HAT培養基(它能殺死未融合、未生產性融合的骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞在數天后死亡，因為它們沒有轉化))篩選融合產生的雜交瘤細胞。用標準的ELISA試驗篩選雜交瘤培養上清中結合Pablo分子的抗體，監測產生本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞。
作為制備單克隆抗體分泌型雜交瘤的其它方案，單克隆抗Pablo抗體可通過用Pablo篩選重組組合免疫球蛋白庫(例如抗體噬菌體展示文庫)來鑒定和分離，從而分離出結合Pablo多肽的免疫球蛋白文庫成員。產生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是市售的(例如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。另外，特別適合用來產生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑例子可在例如以下文獻中找到Ladner等人.美國專利No.5,233,409；Kang等人.國際出版物WO92/18619；Dower等人.國際出版物WO91/17271；Winter等人.國際出版物WO92/20791；Markland等人.國際出版物WO92/15679；Breitling等人.國際出版物WO93/01288；McCafferty等人.國際出版物WO92/01047；Garrard等人.國際出版物WO92/09690；Ladner等人.國際出版物WO90/02809；Fuchs等人.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等人.(1992)HumAntibod Hybridomas 381-85；Huse等人.(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等人.(1993)EMBO J 12725-734；Hawkins等人.(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clarkson等人.(1991)Nature 352624-628；Gram等人.(1992)PNAS 893576-3580；Garrad等人.(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.194133-4137；Barbas等人.(1991)PNAS 887978-7982；和McCafferty等人.Nature(1990)348552-554。
另外，可用標準重組DNA技術制得的包含人和非人部分的重組抗Pablo抗體，如嵌合和人源化單克隆抗體，均在本發明范圍內。這些嵌合和人源化抗體可用本領域已知的重組DNA技術制得，例如用Robinson等人.國際出版物PCT/US86/02269；Akira等人.歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等人.歐洲專利申請173,494；Neuberger等人.PCT申請WO86/01533；Cabilly等人.美國專利4,816,567；Cabilly等人.歐洲專利申請125,023；Better等人.(1988)Science2401041-1043；Liu等人.(1987)PNAS 843439-3443；Liu等人.(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等人.(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等人.(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等人.(1985)Nature 314446-449；和Shaw等人.(1988)J.NatlCancer Inst.801553-1559)；Morrison，S.L.(1985)Science 2291202-1207；Oi等人.(1986)BioTechniques 4214；Winter美國專利5,225,539；Jones等人.(1986)Nature321552-525；Verhoeyan等人.(1988)Science 2391534和Beidler等人.(1988)J.Immunol.1414053-4060中描述的方法。
另外，人源化抗體可根據美國專利5,565,332中公開的標準程序來制得。在另一實施方案中，抗體鏈或特異性結合配對成員可這樣來制得，用本領域已知的技術(如美國專利5,565,332，5,871,907或5,733,743中所述)使兩個載體重組，其中第一個載體含有編碼特異性結合配對成員多肽鏈與可復制基因展示包組件的融合物的核酸分子，第二個載體含有編碼單個結合配對成員第二多肽鏈的核酸分子。
抗Pablo抗體(如單克隆抗體)可通過標準技術(如親和層析或免疫沉淀)來分離Pablo多肽。抗Pablo抗體有助于從細胞中純化出天然的Pablo多肽以及宿主細胞中表達的重組產生的Pablo多肽。另外，抗Pablo抗體可用來檢測Pablo蛋白(例如在細胞裂解液或細胞上清中)。檢測可通過將抗體與可檢測物質偶聯(即物理連接)來實現。因此，在一個實施方案中，用可檢測物質標記本發明的抗Pablo抗體。可檢測物質的例子包括各種酶、輔基、熒光物質、發光物質和放射活性物質。合適的酶例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復合物的例子包括鏈親和素/生物素和親和素/生物素；合適熒光物質例子包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰或藻紅蛋白；發光物質例子包括魯米諾；合適放射活性物質例子包括125I，131I，35S或3H。
抗Pablo抗體也可用以下方法獲得，該方法包括(a)用免疫原性Pablo蛋白或Pablo多肽特有的免疫原性部分對動物進行免疫接種；和(b)從動物中分離出特異性結合Pablo蛋白的抗體。
因此，在一個實施方案中，抗Pablo抗體例如可用來在胞內抑制蛋白活性。用胞內抗體抑制細胞內蛋白功能是本領域已知的(例如參見Carlson，J.R.(1988)Mol.Cell.Biol.82638-2646；Biocca，S.等人.(1990)EMBO J.9101-108；Werge，T.M.等人.(1990)FEBS Letters 274193-198；Carlson，J.R.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907427-7428；Marasco，W.A.等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907889-7893；Biocca，S.等人.(1994)Bio/Technology 12396-399；Chen，S-Y.等人.(1994)HumanGene Therapy 5595-601；Duan，L等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915075-5079；Chen，S-Y.等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915932-5936；Beerli，R.R.等人.(1994)J.Biol.Chem.26923931-23936；Beerli，R.R.等人.(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.204666-672；Mhashilkar，A.M.等人.(1995)EMBO J.141542-1551；Richardson，J.H.等人.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 923137-3141；PCT出版物WO94/02610(Marasco等人)；和PCT出版物WO95/03832(Duan等人)。
在一個實施方案中，制得一個重組表達載體，該載體編碼的抗體鏈呈這樣的形式，當該載體導入細胞后，該抗體鏈在細胞胞內部分中表達成功能性抗體。為了根據本發明抑制方法來抑制Pablo活性，特異性結合Pablo蛋白的胞內抗體表達在細胞胞質中。為了制備胞內抗體表達載體，通常從分泌Pablo蛋白特異性的單克隆抗體的雜交瘤中分離出編碼對目標蛋白(如Pablo)特異性的抗體鏈的抗體輕鏈和重鏈cDNA。分泌抗Pablo單克隆抗體或重組抗Pablo單克隆抗體的雜交瘤可如上所述制得。一旦確定了Pablo蛋白特異性的單克隆抗體(例如，雜交瘤衍生的單克隆抗體或來自組合文庫的重組抗體)，就可用標準的分子生物學技術分離出編碼單克隆抗體輕鏈和重鏈的DNA。對于雜交瘤衍生的抗體，例如可用PCR擴增或cDNA文庫篩選方法獲得輕鏈和重鏈cDNA。對于重組抗體(如噬菌體展示文庫的抗體)，可在文庫篩選過程中從分離的展示包(如噬菌體)中回收編碼輕鏈和重鏈的cDNA。本領域中已經知道可制得PCR引物或cDNA文庫探針的抗體輕鏈和重鏈基因的核苷酸序列。例如，這些序列有許多公開在Kabat，E.a.等人.(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，USDepartment of Health and Human Services，NIH出版物No.91-3242，人胚系序列數據庫“Vbase”中。
一旦獲得，用標準方法將抗體輕鏈和重鏈序列克隆到重組表達載體中。為使輕鏈和重鏈胞質表達，除去了編碼輕鏈和重鏈的疏水性前導序列的核苷酸序列。胞內抗體表達載體能以幾種不同形式中的一種形式來編碼胞內抗體。例如，在一個實施方案中，胞內表達編碼全長抗體輕鏈和重鏈(如全長抗體)的載體。在另一實施方案中，載體編碼全長輕鏈以及重鏈的僅僅VH/CH1區域，從而在胞內表達Fab片段。在一個最佳的實施方案中，載體編碼單鏈抗體(scFv)，其中輕鏈和重鏈的可變區靠一靈活的肽接頭(例如(Gly4Ser)3)來連接，并表達成單鏈分子。為了抑制細胞的Pablo活性，用標準的轉染方法(如本文所述)將編碼抗Pablo的胞內抗體的表達載體導入細胞中。
IV.重組表達載體和宿主細胞本發明另一方面涉及含有編碼Pablo蛋白(或其部分)的核酸的載體，較佳的是表達載體。本發明的重組表達載體包含本發明的核酸，該核酸的形式適合使該核酸在宿主細胞中表達，這意味著重組表達載體還包括一個或多個與待表達核酸序列操作性相連的調控序列，這些調控序列可根據用來表達的宿主細胞來加以選擇。在重組表達載體中，“操作性相連”意味著感興趣的核苷酸序列與調控序列連接的方式使得核苷酸序列能夠表達(例如，在體外轉錄/翻譯系統中，或在宿主細胞中(當將載體導入宿主細胞中時))。術語“調控序列”包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸信號)。這些調控序列例如在Goeddel的《基因表達技術酶學方法》185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。調控序列包括知道核苷酸序列在許多類型的宿主細胞中組成型表達的那些序列以及知道核苷酸序列僅僅在某些宿主細胞中表達的那些序列(例如組織特異性調控序列)。本領域技術人員應當理解，表達載體的設計可取決于要轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白表達水平等因素。本發明的表達載體能導入宿主細胞中來產生由本文所述核酸編碼的蛋白質或肽(包括融合蛋白或肽)(例如Pablo蛋白，Pablo蛋白的突變型、融合蛋白等)。
本發明的重組表達載體可進行設計來表達原核或真核細胞中的Pablo蛋白或其片段。例如，Pablo蛋白可在細菌細胞如大腸桿菌、昆蟲細胞(用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。合適的宿主細胞在Goeddel的《基因表達技術酶學方法》185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有進一步的討論。另外，重組表達載體可在體外轉錄和翻譯，例如用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。
蛋白在原核細胞中的表達最通常的是在大腸桿菌中進行，通過含有組成型或可誘導的啟動子的載體來指導融合或非融合蛋白的表達。融合蛋白將許多氨基酸加入其中編碼的蛋白質中，通常是在重組蛋白的氨基端。這些融合載體通常有三個目的1)提高重組蛋白的表達；2)提高重組蛋白的溶解度；和3)通過在親和純化中作為配體來幫助重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，在融合部分與重組蛋白的接頭處，導入蛋白水解切割位點，以便在純化融合蛋白后能將重組蛋白與融合部分分開。這些酶及其同源識別序列包括Xa因子、纖維蛋白酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別將谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A結合融合到靶重組蛋白中。
純化的融合蛋白例如可用于Pablo活性試驗(例如下文有詳細描述的直接試驗或競爭性試驗)中，或用來產生對Pablo蛋白特異性的抗體。
合適的可誘導非融合大腸桿菌表達載體例子包括pTrc(Amann等人.(1988)Gene69301-315)和pET 11d(Studier等人.《基因表達技術酶學方法》185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc載體的目標基因表達依靠的是雜合的trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉錄。pET 11d載體的靶基因表達依靠的是由共表達的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介導的從T7 gn10-lac融合啟動子轉錄。該病毒聚合酶由攜帶T7 gn1基因的原噬菌體在lacUV 5啟動子轉錄控制下從宿主株系BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
使重組蛋白在大腸桿菌中的表達最大的一種策略是使該蛋白在蛋白水解切割重組蛋白的能力受破壞的宿主細菌中表達(Gottesman，S.，《基因表達技術酶學方法》185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改變要插入表達載體的核酸的核酸序列，從而使每個氨基酸的個別密碼子在大腸桿菌中被優先利用(Wada等人.(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。本發明的核酸序列的這些改變可用標準的DNA合成技術來進行。
在另一實施方案中，Pablo表達載體是酵母表達載體。用來在釀酒酵母中表達的載體例子包括pYepSec1(Baldari，等人(1987)Embo J.6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30933-943)，pJRY88(Schultz等人.(1987)Gene 54113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和picZ(InVitrogen Corp，San Diego，CA)。
或者，Pablo蛋白可用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達。適用于在培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人.(1983)Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在其它實施方案中，本發明的核酸可用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等人.(1987)EMBO J.6187-195)。當用于哺乳動物表達時，表達載體的控制功能通常由病毒調控元件來提供。例如，常用的啟動子從多形瘤、腺病毒2、巨細胞病毒和猿病毒40衍生獲得。對于其它合適的用于原核和真核細胞的表達系統，見Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.《分子克隆實驗指南》第2版，第16和17章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989。
在另一實施方案中，重組哺乳動物表達載體能指導核酸在特定細胞類型中優先表達(例如用組織特異性調控元件來表達核酸)。組織特異性調控元件是本領域中已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性例子包括白蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等人.(1987)Genes Dev.1268-277)、淋巴樣特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，尤其是T細胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等人.(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33741-748)、神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865473-5477)，胰腺特異性啟動子(Edlund等人.(1985)Science 230912-916)，和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子，美國專利No.4,873,316和歐洲專利申請No.264,166)。發育上調控的啟動子也包括在內，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science 249374-379)和α-胎兒球蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3537-546)。
另外，可用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達Pablo多肽。用來在培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人.(1983)Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在另一實施方案中，本發明的核酸可用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的例子包括pMex-NeoI、pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等人.(1987)EMBO J.6187-195)。當用于哺乳動物細胞時，表達載體的控制功能通常由病毒調控元件來提供。例如，常用的啟動子從多形瘤、腺病毒2、巨細胞病毒和猿病毒40衍生獲得。
另外，用于哺乳動物細胞的可誘導調控系統是本領域中已知的，例如通過以下方式來調控基因表達的系統重金屬離子(例如參見Mayo等人.(1982)Cell 2999-108；Brinster等人.(1982)Nature 29639-42；Searle等人.(1985)Mol.Cell.Biol.51480-1489)，熱休克(例如參見Nouer等人.(1991)熱休克反應，Nouer，L.編輯，CRC，BocaRaton，FL，167-220頁)，激素(例如參見，Lee等人.(1981)Nature 294228-232；Hynes等人.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782038-2042；Klock等人.(1987)Nature329734-736；Israel&Kaufman(1989)Nucleic Acids Res.172589-2604；和PCR出版物WO94/18317)或四環素(Gossen，M.和Bujard，H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551；Gossen，M.等人.(1995)Science 2681766-1769；PCT出版物WO94/29442；和PCT出版物No.WO96/01313)。因此，在另一實施方案中，本發明提供了一個重組表達載體，其中Pablo DNA與可誘導真核細胞啟動子操作性相連，從而使Pablo蛋白在真核細胞中誘導型表達。
本發明還提供了一個重組表達載體，它包含反義方向克隆到表達載體中的本發明的DNA分子。即，該DNA分子以使與Pablo mRNA反義的RNA分子表達(通過DNA分子轉錄)的方式與調控序列操作性相連。選擇與反義方向克隆的核酸操作性相連的調控序列，它指導反義RNA分子在各種細胞類型中連續表達(如病毒啟動子和/或增強子)，或選擇指導反義RNA組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達的調控序列。反義表達載體可以是重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調控區域控制下產生，其活性可通過導入載體的細胞類型來確定。關于用反義基因調控基因表達的討論參見Weintraub，H.等人的《基因分析分子工具—反義RNA》綜述-遺傳學趨勢，卷1(1)1986。
本發明另一方面涉及已經導入了本發明的重組表達載體的宿主細胞。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文中可互換使用。應當理解，這些術語不僅指特定的細胞對象，而且還指該細胞的后代或潛在的后代。由于后代中可能會因突變或環境影響而發生某些變化，這些后代可能實際上與母細胞不同，但是它們仍包括在本文所用的術語范圍內。
宿主細胞可以是原核或真核細胞。例如，Pablo蛋白可在大腸桿菌等細菌細胞、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞)中表達。其它合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。
載體DNA可用常規的轉化或轉染技術導入原核或真核細胞中。本文所用的術語“轉化”和“轉染”指本領域中認可的用來將外來核酸(如DNA)導入宿主細胞中的各種技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖-介導的轉染，脂轉染或電穿孔。轉化或轉而宿主細胞的合適方法可在Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989以及其它實驗室文獻中找到。
對于哺乳動物細胞的穩定轉染，已經知道，根據所用表達載體和轉染技術，只有少部分的細胞基因組中整合入了外源DNA。為了鑒別和選出這些整合體，通常將編碼可選擇標記(如抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起導入宿主細胞中。較佳的可選擇標記包括賦予藥物(如G418、潮霉素和氨甲喋呤)抗性的那些標記。編碼可選擇標記的核酸可在與編碼Pablo蛋白的同一載體上導入宿主細胞，或可在另一載體上導入。通過藥物篩選，鑒定經導入核酸轉染的細胞(例如已插入可選擇標記的細胞將會存活，而其它細胞死亡)。
在經Pablo穩定轉染的神經細胞情況下，可制成這些細胞系使得Pablo基因可誘導，例如用PC12 Tet-Off細胞系(購自Clontech；Palo Alto，CA)。例如，通過雙穩定表達，可以調節表達的基因，首先是具有tet-控制的反式激活蛋白(tTA)的“調節”質粒的表達，然后是具有Pablo(在四環素響應元件(TRE)的啟動子序列控制下)的“響應”質粒表達。市售的調節質粒加入經過工程改造用于潮霉素篩選的載體中，使構建的響應載體包括第二個可選擇標記。這些細胞系的構建在所附實施例中有更詳細的描述。利用這些方法，Pablo表達可在諸如四環素或四環素相關化合物(如脫氧土霉素)等試劑存在下關閉，在培養基中不加入四環素等試劑時打開。此類細胞系的構建允許通常成毒性的Pablo能在細胞中穩定地表達。
本發明的宿主細胞，例如培養中的原核或真核細胞，可用來產生(即表達)Pablo蛋白。因此，本發明還提供了用本發明宿主細胞來產生Pablo蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括在合適的培養基中培育本發明的宿主細胞(其中已經導入了編碼Pablo蛋白的重組表達載體)，從而產生Pablo蛋白。在另一實施方案中，本發明還包括從培養基或宿主細胞中分離出Pablo蛋白。
本發明的某些宿主細胞也可用來產生非人轉基因動物。例如，在一個實施方案中，本發明的宿主細胞是已經導入了Pablo編碼序列的受精的卵母細胞或胚胎干細胞。然后，這些宿主細胞產生已經導入了外源Pablo序列的非人轉基因動物，或內源Pablo序列已被改變的同源重組動物。這些動物可用來研究Pablo多肽的功能和/或活性，并可用來鑒別和/或評價Pablo活性的調節劑。本文所用的術語“轉基因動物”是非人動物，較佳的是哺乳動物，更佳的是嚙齒類動物如大鼠或小鼠，該動物中的一個或多個動物細胞具有轉基因。轉基因動物的其它例子包括非人靈長類動物、綿羊、狗、奶牛、山羊、雞、兩棲動物等。轉基因是整合到發育形成轉基因動物的細胞基因組中的外源DNA，該轉基因保留在成熟動物的基因組中，從而指導所編碼基因產物轉基因動物的在一種或多種細胞或組織中表達。本文所用的術語“同源重組動物”是非人動物，較佳的是哺乳動物，更佳的是小鼠，該動物中內源性Pablo基因已經通過內源基因與導入哺乳動物細胞(如發育成動物之前的動物胚胎細胞)的外源DNA分子之間的同源重組而改變。
本發明的轉基因動物可以這樣來制得將編碼Pablo的核酸導入(例如通過顯微注射、逆轉錄注射)受精卵母細胞的雄性前核中，使該卵母細胞在假孕雌性代孕動物中發育。SEQ ID NO1的Pablo序列或其部分可作為轉基因導入非人動物的基因組中。或者，可用Pablo基因的非人同系物(如小鼠或大鼠Pablo基因)作為轉基因。另外，可根據與SEQ ID NO1(在下文有進一步描述)的Pablo家族cDNA序列雜交來分離Pablo基因同系物(如另一Pablo家族成員)，并用作轉基因。這些轉基因系統可用來測試針對Pablo的先導化合物的效力，并用來干擾內源Pablo功能，以便揭示Pablo蛋白的發育和穩態作用。
轉基因中還可加入內含子序列和聚腺苷酸化信號，以提高轉基因表達的效力。可將組織特異性調控序列與Pablo轉基因操作性相連，以指導Pablo蛋白在特定細胞(如CNS或神經元)中表達。用于轉基因Pablo表達的有用的組織特異性啟動子例子包括Thy1.2啟動子(例如參見Caroni(1997)J.Neurosci.Methods 713-9；Gordon等人.(1987)Cell 50445-452；Vidal等人.(1990 Genes and Development 51136-1148)和神經元特異性烯醇酶啟動子(NSE；例如參見Forss-Petter等人.(1990)Neuron 5187-197；Chen等人.(1998)Mol.Pharmacology 54495-503)。或者，可有目的地調節的表達系統可用來誘導或抑制轉基因系統中Pablo表達所需次數。這對于防止轉基因表達的可能的發育致死效果有用。例如，四環素依賴型表達系統已被成功采用(例如參見Furth等人.(1994)PNAS 919302-9306；Gossen等人.(1995)Science 2681766-1769；美國專利No.5,992,927，5,866,755，5,859,310，另見http//www.clontech.com/tet/)。這些系統也可作些改變，例如可將阻遏區與反式激活蛋白融合，例如參見Deuschle等人.(1995)Mol.Cell.Biol.151907-1914)。
通過胚胎操作和顯微注射產生轉基因動物(尤其是諸如小鼠等動物)的方法已經變成本領域中的常規方法，例如在美國專利4,736,866和4,870,009(兩者均授予Leder等人)、美國專利4,873,191(Wagner等人)和Hogan，B的《小鼠胚胎的操作》(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中有所描述。采用相似的方法來產生其它轉基因動物。轉基因起始動物可根據其基因組中Pablo轉基因的存在和/或Pablo mRNA在動物組織或細胞中表達來鑒定。然后，可用轉基因起始動物來培育攜帶該轉基因的額外動物。另外，攜帶編碼Pablo蛋白的轉基因的轉基因動物可與攜帶其它轉基因的其它轉基因動物進一步雜交。
為了產生同源的重組動物，制得一載體，該載體含有至少一部分Pablo基因，該基因中已經導入一個缺失、增加或置換從而改變(例如功能性地破壞)了Pablo基因。例如，可用小鼠Pablo基因來構建適合改變小鼠基因組中內源Pablo基因的同源重組載體。在較佳的實施方案中，這樣來設計載體在同源重組后，內源性Pablo基因被功能性破壞(即，不再編碼有功能的蛋白質；也成為“剔除”載體)。或者，轉基因是Pablo基因的顯性失活突變體，當其在轉基因動物中過度表達時，它通過競爭抑制了內源Pablo的活性。Pablo的顯性失活形式宜包含或由Pablo分子的尾部組成。或者，可以這樣設計載體在同源重組后，它會使內源Pablo基因發生突變或改變但仍編碼有功能的蛋白(例如，可改變上游調控區，從而來改變內源性Pablo蛋白的表達)。在同源重組載體中，Pablo基因的改變部分的5′和3′端側接了Pablo基因的其它核酸序列，從而使載體所攜帶的外源Pablo基因和胚胎干細胞中內源Pablo基因之間的發生同源重組。額外的側接的Pablo核酸序列具有足夠的長度，以使與內源基因之間的同源重組成功。通常，載體中包括了數千堿基的側接DNA(在5′和3′端)(關于同源重組載體的描述例如參見Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503)。將載體導入胚胎干細胞系(例如電穿孔)中，選出所導入的Pablo基因與內源Pablo基因已經同源重組的細胞(例如參見，Li，E.等人.(1992)Cell 69915)。然后將所選細胞注入動物(例如小鼠)胚泡中，形成聚集嵌合體(例如參見，Bradley，A.Teratocarcinomas and EmbryonicStem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson編輯(IRL，Oxford，1987)113-152頁)。然后，將嵌合的胚胎植入合適的雌性代孕動物體內，使胚胎足月發育。干細胞中具有同源重組DNA的子代可用來繁殖動物，通過轉基因的胚系傳遞使動物的所有細胞具有同源重組的DNA。構建同源重組載體和同源重組動物的方法在下列文章中有進一步的描述Bradley，A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2823-829，PCT國際出版物WO90/11354(Le Mouellec等人)；WO91/01140(Smithies等人)；WO92/0968(Zijlstra等人)；和WO93/04169(Berns等人)。所需的剔除也可從市售的單基因座突變型胚胎干細胞文庫(例如“OmniBank”，Lexicon Genetics，The Woodlands，Texas；例如參見http//www.lexgen.com)中確定。
另外，除了上述上述內容外，本領域技術人員會知道本領域已知的用于同源重組的其它方法也可用于本發明。酶輔助的點特異性整合系統是本領域中已知的，可用來將DNA分子整合入第二DNA靶分子中的預定位置。這些酶輔助的整合系統例子包括Cre重組酶-lox靶系統(例如在Baubonis，W.和Sauer，B.(1993)Nucleic Acids Res.212025-2029；Fukushige，S.和Sauer，B.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897905-7909中有所描述)、和FLP重組酶-FRT靶系統(例如在Dang，D.T.和Perrimon，N.(1992)Dev.Genet.13367-375；Fiering，S.等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908469-8473中有所描述)。還可采用例如在PCT出版物WO94/29442和PCT出版物WO96/01313中描述的四環素調節的可誘導的同源重組系統。
例如，在其它實施方案中，可產生轉基因非人動物，該動物含有能調節轉基因表達的所選系統。該系統的一個例子是噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統。有關cre/loxP重組酶系統的描述例如參見Lakso等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236。重組酶系統的另一例子是釀酒酵母的FLP重組酶系統(O′Gorman等人.(1991)Science 2511351-1355)。如果用cre/loxP重組酶系統來調節轉基因的表達，則需要動物具有編碼Cre重組酶和所選蛋白的轉基因。這樣的動物例如可通過使兩種轉基因動物(一種有編碼所選蛋白的轉基因，另一種有編碼重組酶的轉基因)交配形成“雙”轉基因動物來得到。
本文描述的非人轉基因動物的克隆也可根據Wilmut，I.等人.(1997)Nature385810-813和PCT國際出版物WO97/07668和WO97/07669中描述的方法來生產。簡言之，可以分離出轉基因動物的細胞(如體細胞)，誘導其離開生長周期進入G0期。然后，休眠細胞可通過例如電脈沖與分離去除休眠細胞的同種動物的去核卵母細胞融合。然后培育重新構建的卵母細胞，使其發育成桑椹胚或胚細胞，然后轉移到假孕雌性代孕動物體內。該雌性代孕動物所生的后代將是分離出該細胞(如體細胞)的動物的克隆。
V.本發明的用途和方法調節Pablo活性或表達的試劑(例如本文描述的核酸分子、蛋白質、蛋白質同系物和抗體)可用于下列一種或多種方法a)治療方法，例如上調或下調凋亡(較佳的是神經細胞的凋亡)；b)篩選試驗；c)預測性藥物(例如診斷試驗、預后試驗、監測臨床試驗或藥物遺傳學)。本發明的分離的核酸分子例如可用于表達Pablo蛋白(例如在基因治療用途中通過宿主細胞中的重組表達載體)，檢測Pablo mRNA(例如在生物學樣品中)或Pablo基因中的遺傳變化，以及調節Pablo活性(下文有進一步的描述)。該Pablo蛋白還可用來治療以Pablo抑制劑的不足或過度表達為特征的疾病。另外，Pablo蛋白可用來篩選天然存在的Pablo結合蛋白，篩選調節Pablo活性的藥物或化合物，以及治療將受益于Pablo調節的疾病(例如以Pablo蛋白或活性比Pablo野生型蛋白低或異常的Pablo蛋白形式的產生不足或過量為特征)。另外，本發明的抗Pablo抗體可用來檢測和分離Pablo蛋白、調節Pablo蛋白的生物利用率，調節Pablo活性(例如調節凋亡)。在本發明的較佳方法中，例如檢測、調節Pablo等方法可在神經細胞(如中樞或周圍神經系統)中進行。
A.調節Pablo的方法本發明提供了調節細胞中Pablo的方法(例如用來鑒定調節Pablo表達和/或活性的試劑)，以及對處于疾病危險(或易患疾病)的對象或患有與Pablo表達或活性異常有關的疾病或受益于Pablo活性調節的疾病的對象進行預后和治療的方法。
本發明另一方面涉及調節細胞中Pablo表達和/或活性的方法。本發明的調節方法包括使細胞與調節Pablo表達和/或活性的試劑接觸，從而使細胞中的Pablo表達和/或活性受到調節。該試劑可通過調節細胞中Pablo蛋白的活性或調節Pablo基因的轉錄或Pablo mRNA的翻譯來起作用。
因此，在一個實施方案中，該試劑抑制Pablo活性。該抑制劑例如可通過直接抑制Pablo促凋亡活性或通過調節負調節Pablo的信號傳導通道來起作用。在另一實施方案中，該試劑刺激Pablo活性。刺激性試劑例如可通過直接刺激Pablo促凋亡活性或通過調節導致Pablo活性受刺激的信號傳導通道來起作用。典型的抑制劑包括反義Pablo核酸分子(例如抑制Pablo mRNA的翻譯)、胞內抗Pablo抗體(例如抑制Pablo蛋白的活性)和Pablo蛋白的顯性失活突變體(例如本文所述的尾部構建物)。可用來抑制Pablo蛋白活性的其它抑制劑是抑制Pablo凋亡活性的化學化合物。這些化合物可通過本文所述的篩選這些化合物的篩選試驗來鑒定。另外，可用本領域已知的方法設計抑制Pablo凋亡活性的化合物。
根據本發明的另一調節方法，通過使細胞與刺激劑接觸，使細胞內的Pablo活性受到刺激。這些刺激劑的例子包括活性Pablo蛋白以及導入細胞中用來提高細胞中Pablo活性的編碼Pablo的核酸分子。較佳的刺激劑是編碼Pablo蛋白的核酸分子，其中該核酸分子以適合在細胞內表達成活性Pablo蛋白的形式導入該細胞內。為了在細胞中表達Pablo蛋白，通常，首先是利用如本文所述的標準的分子生物學技術將PablocDNA導入重組表達載體中。利用如本文所述的聚合酶鏈反應(PCR)擴增或篩選合適的cDNA文庫，可獲得Pablo cDNA。在分離或擴增Pablo cDNA后，如本文所述，將DNA片段導入表達載體中，用標準方法轉染入靶細胞中。可用來刺激Pablo蛋白活性和/或表達的其它刺激劑是刺激細胞中Pablo活性和/或表達的化學化合物(如增強Pablo促凋亡活性的化合物)。這些化合物可用篩選這些化合物的篩選試驗(在下文有詳細描述)來鑒定。
本發明的調節方法可在體外進行(例如使細胞與試劑一起培育，或將試劑導入培養的細胞中)，或者，在體內進行(例如將試劑給予對象，或將試劑導入對象細胞中，例如通過基因治療)。為了實施體外刺激方法，可用標準方法從對象獲得細胞，使細胞在體外與本發明的調節劑一起培育(即培養)，以調節細胞中的Pablo活性。
對于含有核酸(包括編碼Pablo蛋白的重組表達載體，反義RNA，胞內抗體或顯性失活抑制劑)的刺激劑或抑制劑，可用本領域已知用于將核酸(如DNA)體內導入細胞的方法將試劑導入對象的細胞內。這些方法的例子包括非病毒方法和病毒方法，包括下列直接注射通過將DNA直接注射到細胞內，將裸DNA體內導入細胞(例如參見，Acsadi等人.(1991)Nature 332815-818；Wolff等人.(1990)Science 2471465-1468)。例如，可采用將DNA體內在注入細胞的輸送裝置(例如“基因槍”)。該裝置是市售的(例如購自BioRad)。
陽離子脂質裸DNA可通過將DNA與陽離子脂質復合或將DNA包囊在陽離子脂質體中來體內導入細胞。合適的陽離子脂質配方的例子包括N-[-1-(2，3-二油酰氧)丙基]N，N，N-三乙基氯銨(DOTMA)以及摩爾比為1∶1的1，2-二肉豆寇酰氧-丙基-3-二甲基羥乙基溴銨(DMRIE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(例如參見，Logan，J.J.等人.(1995)Gene Therapy 238-49；San，H.等人.(1993)Human Gene Therapy 4781-788)。
受體介導的DNA攝取裸DNA還可通過將DNA與細胞表面受體配體相偶聯的諸如聚賴氨酸等陽離子復合來將裸DNA體內導入細胞(例如參見Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等人.(1992)J.Biol.Chem.267963-967；和美國專利5,166,320)。DNA配體復合物與受體的結合有助于DNA被受體介導的胞吞作用所攝取。可采用與腺病毒外殼(它天然破壞核內體，從而將物質釋放入胞質內)相連的DNA配體復合物，以避免復合物被胞內溶酶體降解(例如參見Curiel等人.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；Cristiano等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902122-2126)。
逆轉錄病毒眾所周知，缺陷型逆轉錄病毒可進行基因轉移以用于基因治療目的(有關綜述參見Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。構建重組逆轉錄病毒，將感興趣的核苷酸序列結合入逆轉錄病毒基因組中。另外，可除去部分逆轉錄基因組，以使逆轉錄病毒復制缺陷。然后，將復制缺陷型逆轉錄病毒包裝入病毒顆粒中，用標準技術通過使用輔助病毒來使該毒粒感染靶細胞。產生重組逆轉錄病毒以及用這些病毒體外或體內感染細胞的方法可在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等編，Greene Publishing Associates，(1989)，Sections 9.10-9.14以及其它標準的實驗室手冊中找到。合適的逆轉錄病毒的例子包括本領域熟知的pLJ，pZIP，pWE和pEM。合適的包裝病毒系的例子包括ψCrip，ψCre，ψ2和ψAm。逆轉錄病毒已被用來將各種基因在體外和/或體內導入許多不同的細胞類型，包括上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、肌母細胞、肝細胞、骨髓細胞(例如參見Eglitis，等人.(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等人.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876141-6145；Huber等人.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888039-8043；Ferry等人.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury等人.(1991)Science2541802-1805；van Beusechem等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay等人.(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等人.(1993)J.Immunol.1504014-4115；美國專利4,868,116；美國專利4,980,286；PCT申請WO89/07136；PCT申請WO89/02468；PCT申請WO89/05345；和PCT申請WO92/07573)。逆轉錄病毒載體依賴于靶細胞分裂，以便使逆轉錄病毒基因組(和插入基因組的外來核酸)整合入宿主基因組中，從而能穩定地將核酸導入細胞內。因此，可能需要刺激靶細胞的復制。
腺病毒可對腺病毒基因組進行操作，使其編碼和表達感興趣的基因產物，但是其在正常病毒裂解生命周期中的復制能力喪失。例如參見Berkner等人.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等人.(1991)Science 252431-434；和Rosenfeld等人.(1992)Cell 68143-155。從腺病毒株系Ad5型dl324和其它腺病毒株系(例如Ad2，Ad3，Ad7等)獲得的合適腺病毒載體是本領域技術人員所熟知的。重組腺病毒是有利的，因為它們不需要分裂的細胞作為有效的基因輸送載體，且可用來感染各種細胞類型，包括呼吸道上皮細胞(Rosenfeld等人.(1992)同上)、內皮細胞(Lemarchand等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)、肝細胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902812-2816)和肌細胞(Quantin等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。另外，導入的腺病毒DNA(和其中所含的外來DNA)沒有整合入宿主細胞基因組中，而是維持附加的形式，從而避免了由于當導入的DNA整合入宿主基因組中后(例如逆轉錄病毒DNA)插入誘變而可能引起的問題。另外，外來DNA的腺病毒基因組的攜帶能力比其它基因輸送載體大(高達8千堿基)(Berkner等人.同上；Haj-Ahmand和Graham(1986)J.Virol.57267)。目前所用的大多數復制缺陷型腺病毒載體缺失所有或部分的病毒E1和E3基因，但是保留了多達80％的腺病毒遺傳物質。
腺伴隨病毒腺伴隨病毒(AAV)是一種天然存在的缺陷型病毒，它需要另一病毒(如腺病毒或皰疹病毒)作為輔助病毒才能進行有效復制和增殖性生命周期。(有關綜述見Muzyczka等人.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。它也是能將其DNA整合入非分裂性細胞的少數病毒之一，并表現出高頻率的穩定整合(例如參見Flotte等人.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等人.(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin等人.(1989)J.Virol.621963-1973)。含有AAV的少達300堿基對的載體可被包裝并能整合。外源DNA的空間限制在約4.5kb。可用AAV載體(如Tratschin等人.(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260)將DNA導入細胞內。利用AAV載體已經各種核酸導入不同類型的細胞中(例如參見Hermonat等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin等人.(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等人.(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等人.(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte等人.(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。
特定表達載體系統的以及將核酸導入細胞內的方法的效率可用本領域常用的標準方法來評價。例如，可采用濾膜雜交技術(例如Southern印跡)檢測導入細胞的DNA，導入的DNA所轉錄產生的RNA可用例如Northern印跡、RNA酶保護或逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)來檢測。基因產物可用合適的試驗如用免疫學檢測所產生的蛋白質(如特異性抗體)來檢測，或用功能試驗來檢測基因產物的功能性活性。
本發明的Pablo調節劑可用來治療多種病理學疾病或失調。在一個實施方案中，該試劑可上調(上調或下調)細胞中的凋亡。例如，在一個實施方案中，可在導致細胞死亡的生理性攻擊期間調節細胞內的Pablo表達或活性。例如，在導致細胞死亡的生理性攻擊(例如給予藥物、腎上腺切除、局部缺血等)期間，可調節Pablo表達。
在另一實施方案中，該方法可用來治療患病對象，其中該疾病將受益于凋亡的上調。在一個較佳的實施方案中，調節Pablo以增強神經細胞的凋亡，從而促進神經系統癌細胞凋亡。在另一實施方案中，例如在阿爾茨海默病或肌萎縮性側索硬化(ALS)患者中，在促進神經細胞存活時，下調細胞(較佳的是神經細胞)中的凋亡(Lee，M.1999.J.of Neuropath&Exper.Neurology 58459；Desjardins，P.和Ledoux，S.1998.Neurosci.Letters.24469；Yoshihisa等人.1998.Brain Resarch.780260)。可通過Pablo調節來治療的其它典型疾病包括其它神經系統疾病。術語“疾病”包括將受益于Pablo活性和/或表達改變的正常情況和多種疾病狀況。
1.預防方法本發明一方面提供了一種預防對象患病的方法，其中該疾病將得益于Pablo活性和/或表達的調節，例如與Pablo表達或活性異常有關的疾病，該方法是將調節Pablo多肽的表達或其至少一種Pablo活性的試劑或Pablo多肽給予對象。由于Pablo表達或活性異常而引起處于患病危險的對象可用例如本文所述的診斷或預測試驗的組合來鑒定。在Pablo遺傳的癥狀表現出來之前，可給予預防劑，從而防止該疾病或失調或延遲該疾病的發展。根據Pablo異常或病情的類型，例如可用Pablo多肽、Pablo激動劑或Pablo拮抗劑來治療對象。合適的試劑可根據本文描述的篩選試驗來確定。
2.治療方法本發明另一方面涉及以治療為目的的調節Pablo表達或活性的方法。因此，在典型的實施方案中，本發明的調節方法包括使細胞與和該細胞相關的調節Pablo蛋白的一種或多種活性的Pablo多肽或試劑接觸。調節Pablo蛋白活性的試劑可以是本文所述的試劑，如核酸或蛋白質，Pablo蛋白的天然存在的靶分子(如Pablo結合蛋白)、Pablo抗體、Pablo激動劑或拮抗劑，Pablo激動劑或拮抗劑的肽模擬物或其它小分子。在一個實施方案中，該試劑刺激一種或多種Pablo活性。這些刺激劑的例子包括活性Pablo蛋白和已經導入細胞內的編碼Pablo多肽的核酸分子。在另一實施方案中，試劑抑制一種或多種Pablo活性。這些抑制劑的例子包括，例如，反義Pablo核酸分子、抗Pablo抗體和Pablo抑制劑。這些調節方法可在體外進行(例如使細胞與試劑一起培育)，或在體內進行(例如將試劑給予對象)。因此，本發明提供了治療受累于某疾病或失調的個體的方法，其中該疾病或失調將得益于Pablo蛋白的調節(例如該疾病得益于免疫反應的上調或下調)，或是以Pablo蛋白或核酸分子的異常的表達或活性為特征。在一個實施方案中，該方法包括給予試劑(例如用本文所述的篩選試驗來鑒定的試劑)，或調節(例如上調或下調)Pablo表達或活性的試劑組合。在另一實施方案中，該方法包括給予Pablo蛋白或核酸分子作為治療來補償減少或異常的Pablo表達或活性。
在Pablo異常下調和/或提高Pablo活性有可能具有有益效果時，例如當需要增加細胞內的凋亡，如在癌或其它一些不需要的生長等腫瘤形成情況下，或在某類細胞過度產生因子(如激素或生長因子)的情況下，希望刺激Pablo活性。同樣，當Pablo異常上調和或減少Pablo活性有可能具有有益效果時，例如當希望減少細胞內凋亡時，希望抑制Pablo活性。需要Pablo調節的典型場合是以凋亡為特征的失調(如局部缺血或腎上腺切除等)的治療。
B.篩選試驗本發明提供了一種鑒定調節物的方法(本文也稱為“篩選試驗”)，該調節物即是Pablo結合蛋白，對例如Pablo表達或Pablo活性有刺激或抑制效果的候選物或測試化合物或試劑(如肽、肽模擬物、小分子或其它藥物)。
本發明的測試化合物可用本領域已知的組合文庫方法中眾多方法的任一種來獲得，這些文庫包括生物學庫；空間上可尋址的并行的固相或液相庫；需要解卷(deconvolution)的合成庫方法；“一珠一化合物”的庫方法；和采用親和層析篩選的合成庫方法。生物學庫方法局限于肽文庫，而其它四種方法適用于肽、非肽寡聚物和小分子化合物庫(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12145)。
合成分子庫的方法例子可在本領域中的下列文獻中找到DeWitt等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422；Zuckermann等人.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等人.(1993)Science2611303；Carrell等人.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等人.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等人.(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物庫可在溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques 13412-421)、或在珠上(Lam(1991)Nature 35482-84)，片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)，細菌上(LadnerUSP 5,223,409)，孢子上(Ladner USP′409)，質粒上(Cull等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或在噬菌體上(Scott和Smith(1990)Science 249386-390)；(Devlin(1990)Science 249404-406)；(Cwirla等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)；(Ladner同上)。
在測試調節劑和天然提取物文庫的許多藥物篩選程序中，為了在給定時間內找到盡可能多的調節劑，希望有高產量的試驗。在無細胞系統中進行的試驗(例如可用純化或半純化的蛋白質衍生)通常稱為“初”篩選，因為它們能產生迅速進展，而且相對容易檢測靶分子中由測試調節劑介導的變化。另外，在體外系統中通常忽略了所測試的調節劑的細胞毒性效果和/或生物利用率，相反，該試驗主要注重于藥物對靶分子的效果(通過與上游或下游元件的結合親和力改變來表現)。
在一個實施方案中，本發明提供了篩選與Pablo蛋白或多肽或其生物活性部分結合或調節其活性(例如調節Pablo多肽與Bcl-xL相互作用的能力)的候選物或測試化合物的試驗。
可用試驗來篩選調節劑，該調節劑包括Pablo同系物，它是Pablo多肽的正常細胞功能的激動劑或拮抗劑。例如，本發明提供了一種方法，在該方法中提供了一種指示組合物，該組合物含有具有Pablo活性的Pablo蛋白。該指示組合物能與測試化合物接觸。通過測定指示組合物中的變化，就能測得測試化合物對Pablo活性的效果，從而鑒定出調節Pablo蛋白活性的化合物。在測試化合物存在下Pablo活性水平的統計學上顯著的變化(如減少或增加)(相對于測試化合物不存在時檢測到的水平而言)表明該測試化合物是Pablo調節劑。該指示組合物例如可以是細胞或細胞抽提物。在一個實施方案中，如所附實施例中描述的那樣評價Pablo活性。
在本發明所列舉的篩選試驗中，使感興趣的調節劑與可能作用于上游的相互作用蛋白(包括其活性的激活劑和抑制劑)或可能作用于Pablo蛋白下游的蛋白接觸，無論它們被調節劑正調控還是負調控。然后，在調節劑、上游或下游元件的混合物中，加入含有Pablo蛋白的組合物。檢測并定量測定Pablo與其上游或下游元件的相互作用，結果提供了調節劑抑制(或增強)Pablo和Pablo結合元件之間形成復合物的效果的測定手段。
調節劑的效果可通過從各種濃度的測試調節劑所得數據產生劑量反應曲線，評價調節劑的效率。另外，還可進行對照試驗來提供用于比較的基線水平。在對照試驗中，將分離并純化的Pablo蛋白加入含有Pablo結合元件的組合物中，在沒有測試調節劑存在下定量測定復合物的形成。
在另一實施方案中，本發明的試驗是一種無細胞的試驗，在該試驗中，使Pablo蛋白或其生物活性部分與測試化合物接觸，然后測定該測試化合物與Pablo蛋白或其生物活性部分結合的能力。測試化合物與Pablo蛋白的結合可如上所述那樣直接或間接測定。在較佳的實施方案中，該試驗包括使Pablo蛋白或其生物活性部分與已知結合Pablo的化合物接觸，形成試驗混合物，使該試驗混合物與測試化合物接觸，然后測定測試化合物與Pablo蛋白相互作用的能力，其中測試化合物與Pablo蛋白相互作用的能力的測定包括測定測試化合物比已知化合物優先結合Pablo多肽或其生物活性部分的能力。
在另一實施方案中，試驗是無細胞的試驗，在該試驗中，使Pablo蛋白或其生物活性部分與測試化合物接觸，然后測定該測試化合物調節(例如刺激或抑制)Pablo蛋白或其生物活性部分的活性的能力。Pablo蛋白能以表達Pablo的細胞裂解液形式、純化或半純化的多肽形式、或重組表達的多肽形式提供。在一個實施方案中，該無細胞試驗系統還包括細胞抽提物或分離的細胞組件，例如線粒體。這些細胞器可用本領域已知的技術來分離。該無細胞試驗系統宜還包含至少一種與Pablo相互作用的靶分子，然后監測測試化合物調節Pablo與靶分子相互作用的能力，從而鑒定出作為Pablo調節劑(例如Bcl-xL活性)的測試化合物。測試化合物調節Pablo蛋白活性的能力可通過例如用諸如實時生物分子相互作用分析(BIA)等技術來實現。Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345和Szabo等人.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705。這里所用的“BIA”是實時研究生物特異性相互作用而不標記任何反應物(例如BIAcore)的技術。可用表面等離子體共振(SFR)的光學現象中的變化來指示生物分子之間的實時反應。
在另一實施方案中，無細胞試驗涉及使Pablo蛋白或其生物活性部分與結合Pablo蛋白的已知化合物接觸，形成試驗混合物，使試驗混合物與測試化合物接觸，確定測試化合物與Pablo蛋白相互作用的能力，其中測試化合物與Pablo蛋白相互作用的能力的測定包括測定Pablo蛋白優先結合或調節Pablo靶分子活性的能力。
本發明的無細胞試驗適合用蛋白的可溶形式和/或膜結合形式(例如，具有與Pablo結合的胞內結構域的Pablo蛋白或受體)。在采用膜結合型蛋白的無細胞試驗中，可能需要采用增溶劑，從而使膜結合型蛋白保留在溶液中。這些增溶劑的例子包括非離子洗滌劑，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(glucamide)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺，TritonX-100，TritonX-114，Thesit，異三癸基聚(乙二醇醚)n，3-[(3-乙醇酰胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、3-[(3-乙醇酰胺丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙磺酸酯(CHAPSO)、或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯。
Pablo靶分子可以是蛋白質或DNA序列。能檢測蛋白-蛋白相互作用的試驗(例如免疫沉淀、雙雜交試驗等)或能檢測DNA結合蛋白與DNA靶序列之間相互作用的試驗(例如電泳遷移試驗、DNA酶I足印試驗等)的合適試驗是本領域中已知的。通過在測試化合物存在和不存在下進行這樣的試驗，這些試驗可用來鑒定出能調節(例如抑制或增強)Pablo與靶分子相互作用的化合物。
Pablo蛋白與Pablo分子配體結合或相互作用的能力的測定可通過直接結合來實現。在直接結合試驗中，可將Pablo蛋白與放射性同位素或酶標記偶聯，從而能通過檢測復合物中標記的Pablo蛋白來確定Pablo蛋白與Pablo靶分子結合。例如，可用125I，131I，35S或3H直接或間接地標記Pablo蛋白，通過直接計數放射性發射或閃爍計數來檢測放射性同位素。或者，可用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶對Pablo分子進行酶促標記，通過測定合適底物轉變成產物來檢測酶標記。
通常，希望將Pablo或其結合蛋白固定，以便將復合物與一種或兩種蛋白的未復合形式分離，并使試驗自動化。Pablo在候選試劑存在和不存在的條件下與上游或下游結合元件的結合可在含有這些反應物的適合容器內進行。容器例子包括微量滴定板、試管和微離心管。在一個實施方案中，提供了一個融合蛋白，該蛋白中加入了使該蛋白與基質結合于基質的區域。例如，谷胱甘肽-S-轉移酶/Pablo(GST/Pablo)融合蛋白能吸附到谷胱甘肽sepharose珠粒(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生處理的微量滴定板上，然后與細胞裂解液、35S標記的測試調節劑混合，使混合物在誘導形成復合物的條件下(例如在生理性鹽和pH條件下)培育，但是可能希望有稍稍更嚴謹的條件。培育后，洗滌珠粒，除去未結合的標記，固定基質，直接測定放射標記(例如將珠粒置于閃爍體內)，或在隨后解離復合物后在上清液中測定放射標記。或者，可使復合物與基質脫離，用SDS-PAGE分離，用標準電泳技術從凝膠中定量測定在珠粒部分中發現的Pablo結合蛋白水平。
該試驗中也可采用其它技術來將蛋白質固定到基質上。例如，可利用生物素與鏈親和素的偶聯來固定Pablo或其關連結合蛋白。例如，可用本領域熟知的技術(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制得生物素化的Pablo分子，然后固定在鏈親和素涂布的96孔板(Pierce Chemical)孔內。或者，將與Pablo反應但是不干擾與上游或下游元件結合的抗體衍生處理在板孔上，通過抗體偶聯將Pablo捕獲在孔內。如上所述，在平板的Pablo呈現孔內培育Pablo結合蛋白和測試調節劑的制備物，定量測定孔內捕獲的復合物量。檢測這些復合物的典型方法，除了上述用于GST固定的復合物的方法外，還包括用與Pablo結合元件反應或與Pablo蛋白反應并與結合元件競爭的抗體來免疫檢測該復合物；以及酶聯試驗，該試驗依靠的是檢測與結合元件相關的酶活性(內在或外在的活性)。在后一情況中，酶可以與Pablo-BP化學偶聯或以與Pablo-BP的融合蛋白形式提供。為了進行說明，將Pablo-BP與辣根過氧化物酶化學交聯或基因融合，用該酶的顯色底物(如四鹽酸3，3′-二氨基-苯扎啶(3，3′-diamino-benzadine)或4-氯-1-萘酚)來測定復合物中捕獲的蛋白量。同樣，可提供包含蛋白質和谷胱甘肽-S-轉移酶的融合蛋白，通過用1-氯-2，4-二硝基苯檢測GST活性來定量測定復合物形成(Habig等人(1974)J.Biol.Chem.2497130)。
對于依靠免疫檢測來定量測定復合物中捕獲的一種蛋白質的方法，可采用針對該蛋白的抗體，如抗Pablo抗體。或者，復合物中要檢測的蛋白可以是“表位加尾的”融合蛋白形式，該蛋白除了包括Pablo序列外還有第二蛋白，而針對該第二蛋白的抗體是可以市售購得的(例如購自商業途徑)。例如，上述GST融合蛋白也可用針對GST部分的抗體來定量測定結合。其它有用的表位加尾包括myc表位(例如參見Ellison等人.(1991)J.Biol.Chem.26621150-21157)，它包括c-myc的10殘基序列以及pFLAG系統(International Biotechnologies，Inc.)或pEZZ-蛋白A系統(Pharmacia，NJ)。
不標記任何相互作用物而測定化合物調節Pablo與其靶分子之間相互作用的能力也在本發明范圍內。例如，可用顯微生理機能測試計(microphysiometer)來檢測Pablo與其靶分子之間的相互作用而無需標記Pablo或靶分子。McConnell，H.M.等人.(1992)Science 2571906-1912。本文所用的術語“顯微生理機能測試計”(如Cytosensor)是利用光可尋址電位傳感器(LAPS)來測定細胞使環境酸化的速度的分析儀器。酸化速度的改變可用來表示化合物和受體之間的相互作用。
除了無細胞試驗外，本發明提供的Pablo蛋白的獲得途徑也有助于產生基于細胞的試驗，來鑒定小分子激動劑/拮抗劑等。例如，可使細胞在感興趣的測試調節劑存在和不存在下表達或過度表達重組Pablo蛋白，用試驗評價Pablo應答由測試計介導受靶細胞的調節。例如，利用無細胞試驗，可以鑒定出使Pablo依賴性反應有統計學上顯著變化的調節劑。
可用來表達Pablo的重組表達載體是本領域中已知的(如上所述)。在一個實施方案中，在表達載體中，編碼Pablo的序列與調控序列操作性相連，該調控序列使Pablo在指定細胞中組成型或誘導型表達。為了鑒定增強或抑制Pablo活性的化合物，宜采用使Pablo組成型或誘導型表達的重組表達載體。在另一實施方案中，在表達載體中，Pablo編碼序列與內源性Pablo基因的調控序列(即，從內源性基因獲得的啟動子調控區)操作性相連。對于鑒定增強或抑制Pablo轉錄表達的化合物來說，宜采用這樣的重組表達載體，其中Pablo表達受內源性調控序列的控制。
在一個實施方案中，試驗是一種基于細胞的試驗，它包括使表達Pablo靶分子(如Bcl-xL或另一Pablo胞內相互作用的分子)的細胞與測試化合物接觸，測定該測試化合物調節(例如刺激或抑制)Pablo靶分子活性的能力。測定測試化合物調節Pablo靶分子活性的能力可通過例如測定Pablo蛋白與Pablo靶分子或其配體結合或相互作用的能力來實現。
在一個描述性的實施方案中，調節細胞內Pablo的表達活性，測定感興趣的調節劑對于感興趣的讀數(如凋亡)的效果。在一個實施方案中，轉錄因Pablo表達或活性的調節而改變的基因調控區(如5′側啟動子和增強子區域)與一標記物(如螢光素酶)操作性相連，該標記物編碼的基因產物易被檢測到。
在一個實施方案中，以這樣的方法鑒定Pablo表達的調節劑使細胞與候選化合物接觸，然后測定細胞中Pablo mRNA或蛋白的表達。將候選化合物存在下PablomRNA或蛋白的表達水平與候選化合物不存在時Pablo mRNA或蛋白的表達水平相比。然后根據這一比較結果，鑒定出作為Pablo表達調節劑的候選化合物。例如，當候選化合物存在下Pablo mRNA或蛋白的表達高于(例如統計學上有意義地高于)化合物不存在時的表達時，該候選化合物鑒定為Pablo mRNA或蛋白表達的刺激物。或者，當候選化合物存在下Pablo mRNA或蛋白的表達低于(例如統計學上有意義地低于)化合物不存在下的表達時，該候選化合物鑒定為Pablo mRNA或蛋白表達的抑制物。細胞中Pablo mRNA或蛋白表達的水平可用本文描述的檢測Pablo mRNA或蛋白的方法來測定。
在較佳的實施方案中，測定Pablo蛋白與Pablo靶分子結合或相互作用的能力可通過測定Pablo或靶分子活性的讀數來實現。例如，Pablo或靶分子的活性可通過以下方式來測定檢測靶的細胞第二信使(例如Bcl-xL調節的第二信使)，在合適底物上檢測靶的催化/酶促活性，檢測報道基因(它包含靶反應性調控元件以及與其操作性相連的編碼可檢測標記物(如氯霉素乙酰轉移酶)的核酸)的誘導，或檢測靶調節的細胞反應(如凋亡)。例如，Pablo蛋白與Pablo靶分子結合或相互作用的能力的測定可通過例如測定化合物調節凋亡(較佳的在神經細胞中)的能力來實現。凋亡的標志是DNA分解。在該過程早期，這種分解發生于核小體DNA之間的連接區。DNA斷裂可能產生雙鏈和單鏈DNA斷裂。用標準技術來測定細胞中的凋亡。例如，細胞群基因組DNA的分解可用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，或可采用基于3H-胸腺嘧啶或5-溴-2′-脫氧-尿苷的DNA片段化試驗。
為了分析個別細胞中的凋亡，可能要用顯微鏡識別凋亡細胞，因為核染色質濃縮和片段化有特征性的外觀。如所附實施例中所述，利用Hoechst染色尋找具有固縮核的細胞，可以測定出個別細胞中的凋亡。或者，通過在酶促反應中用修飾的核苷酸(如生物素-dUTP，DIG-dUTP，熒光素-dUTP)標記游離的3′-OH端，可檢測雙鏈和單鏈的DNA斷裂。末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)將脫氧核糖核苷酸以不依賴模板的方式催化聚合到DNA的3′端。該方法稱為TUNEL(TdT介導的dUTP-X切割標記)。或者，通過切口翻譯用DNA聚合酶標記游離的3′OH基團。隧道染色(tunnel staining)可用來鑒定具有雙鏈DNA斷裂的細胞。已經結合了標記的dUTP的標記的游離的3′OH基團可用流式細胞計數儀和/或熒光顯微鏡檢查來顯示。進行這些試驗的試劑例如可購自Roche Molecular Biochemical USA(原位細胞死亡檢測試劑盒)。另外，膜聯蛋白(如膜聯蛋白-V-AlexaTM568，購自Roch molecular Biochemicals USA)可用于此目的。與細胞經歷凋亡有關的較早的質膜變化之一是磷脂酰絲氨酸從質膜內葉轉移到外層，從而使磷脂酰絲氨酸暴露在細胞表面上。膜聯蛋白-V是一種結合磷脂酰絲氨酸的磷脂結合蛋白，它可用作細胞表面上磷脂酰絲氨酸的探針。膜聯蛋白-V可與DNA株(如BOBOTM-1)合用，以區分凋亡的細胞和壞死的細胞。
在本發明另一方面，在雙雜交試驗或三雜交試驗中可將Pablo蛋白或其部分用作“誘餌蛋白”(例如參見美國專利5,283,317；Zervos等人.(1993)Cell 72223-232；Madura等人.(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等人.(1983)Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等人.(1993)Oncogene 81693-1696；和BrentWO94/10300)，以鑒定與Pablo結合或相互作用并參與Pablo活性的其它蛋白(“Pablo結合蛋白”或“Pablo-bp”)。一種這樣的結合蛋白是Bcl-xL。這樣的Pablo結合蛋白還有可能作為例如Pablo介導的信號傳導通道中的下游元件，來參與Pablo蛋白或Pablo靶的信號傳遞。或者，這種Pablo結合蛋白可能是Pablo抑制劑。
雙雜交試驗基于大多數由可分離的DNA結合和激活結構域組成的轉錄因子的模塊特征。簡言之，該試驗采用了兩種不同的DNA構建物。在一個構建物中，編碼Pablo蛋白的基因與編碼已知轉錄因子(如GAL-4)的DNA結合結構域的基因融合。在另一構建物中，來自DNA序列庫的編碼未鑒定蛋白的DNA序列(“捕獲物”或“樣品”)與編碼該已知轉錄因子的激活結構域的基因融合。如果“誘餌”和“捕獲物”蛋白也能在體內相互作用形成Pablo依賴型復合物，則轉錄因子的DNA結合和激活結構域可相互靠近。這種靠近使得對轉錄因子起反應的轉錄調控部位所操作性相連的報道基因(如LzcZ)轉錄。檢測報道基因的表達，分離出含有功能性轉錄因子的細胞菌落用來獲得編碼與Pablo蛋白相互作用的蛋白的克隆基因。
本發明還提供了一種試劑盒，該試劑盒有雙雜交系統，該系統有(1)含有Pablo和轉錄激活結構域的第一雜交蛋白，(2)含有Bcl-xL多肽和DNA結合結構域的第二雜交蛋白，宿主細胞和指導說明書。或者，Pablo多肽可與DNA結合結構域融合，Bcl-xL多肽與激活結構域融合。該試劑盒還可任選包括用來測試其改變第一和第二雜交蛋白之間分子內雜交的能力的一組試劑。
本發明還涉及用上述篩選試驗鑒定出的新試劑。因此，在合適動物模型中進一步使用上述鑒定的試劑也在本發明范圍內。例如，本文所述的鑒定的試劑(如Pablo調節劑、反義Pablo核酸分子、Pablo特異性抗體或Pablo結合伙伴)可用于動物模型來測定該試劑的處理效果、毒性或副作用。或者，如本文所述鑒定的試劑可用于動物模型，以測定該試劑的作用機理。另外，本發明涉及上述篩選試驗鑒定的新試劑用于進行本文所述治療的用途。
C.合理的藥物設計方法Pablo和Pablo結合多肽(如Bcl-xL多肽)，尤其是在Pablo/Bcl-xL異二聚體中形成直接接觸的那些部分，可用于候選物Pablo或Bcl-xL調節劑的合理藥物設計(例如抗腫瘤藥和凋亡下調劑)。將Pablo鑒定為是本文提供的Bcl-xL的結合伙伴，就能產生基本純化的Pablo/Bcl-xL多肽復合物和計算模型，該計算模型可用于蛋白質X-射線結晶學或其它結構分析方法，如DOCK程序(Kuntz等人(1982)J.Mol.Biol.161269；Kuntz ID(1992)Science 2571978)及其變化方法。潛在的治療藥物可根據所提供的結構信息來合理設計。在一個實施方案中，設計這些藥物以防止或增強Pablo多肽Bcl-xL多肽復合物的形成。因此，本發明可用來設計藥物(包括能抑制或促進Pablo與Bcl-xL結合的藥物)。
D.檢測試驗本文鑒定的cDNA序列的部分或片段(及其對應的完整的基因序列)可以各種方式用作多核苷酸試劑。例如，這些序列可用來(i)確定各基因在染色體上的圖譜；從而確定與遺傳疾病有關的基因區域；(ii)從微小的生物樣品鑒定個體(對組織分類型)；和(iii)有助于生物樣品的法庭鑒定。這些應用在下文有詳細描述。
E.預測藥物本發明還涉及預測醫藥領域，其中采用診斷試驗、預后性試驗和監測臨床試驗進行預后(預測)，從而預防性地處理個體。因此，本發明一方面涉及一種用來確定生物樣品(如血液、血清、細胞、組織(較佳的是神經細胞或組織))中Pablo蛋白和/或核酸表達以及Pablo活性的診斷試驗，從而確定該個體是否受累于疾病或失調，或有產生與Pablo表達或活性異常有關的失調的危險。本發明還提供了用于確定個體是否有產生與Pablo蛋白、核酸表達或活性相關的失調危險的預后性(預測性)試驗。例如，可分析生物樣品中Pablo基因中的突變。這些試驗可用于預防性或預測性目的，從而在以Pablo蛋白、核酸表達或活性為特征或與之相關的失調開始前，對個體進行預防性治療。
本發明另一方面涉及在臨床試驗中監測試劑(例如藥物、化合物)對Pablo的表達或活性的影響。
這些和其它試劑在下文有進一步詳細描述。
1.診斷試驗檢測生物樣品中Pablo蛋白或核酸存在或不存在的典型方法是，從測試對象獲得生物樣品，使該生物樣品與能檢測Pablo蛋白或編碼Pablo蛋白的核酸(如mRNA、基因組DNA)的化合物接觸，從而檢測出生物樣品中Pablo蛋白或核酸的存在。用于檢測Pablo mRNA或基因組DNA的較佳試劑是能與Pablo mRNA或基因組DNA雜交的標記的核酸探針。該核酸探針例如可以是Pablo核酸，如SEQ ID NO1中的核酸或其部分，如長度至少為15、30、50、100、250或500個核苷酸且足以在嚴謹條件下與Pablo mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸。用于本發明診斷試驗的其它合適探針在本文中有所描述。
用于檢測Pablo蛋白的較佳試劑是能結合Pablo蛋白的抗體，較佳的是具有可檢測標記的抗體。抗體可以是多克隆、或更佳的，單克隆抗體。可采用完整的抗體或其片段(如Fab或F(ab′)2)。對于探針或抗體，術語“標記的”包括通過將可檢測物質與探針或抗體偶聯(即物理連接)來直接標記探針或抗體，以及通過與另一直接標記的試劑反應來間接標記探針或抗體。間接標記的例子包括用熒光標記的第二抗體檢測第一抗體，用生物素標記DNA探針的末端，使其能被熒光標記的鏈親和素檢測到。術語“生物樣品”包括從對象分離得到的組織、細胞和生物體液，以及在對象體內的組織、細胞(較佳的是神經細胞或組織)和體液。即，本發明的檢測方法可用來檢測體外生物樣品中和體內的Pablo mRNA、或基因組DNA。例如，Pablo mRNA的體外檢測技術包括Northern雜交和原位雜交。Pablo蛋白的體外檢測技術包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，Westem印跡、免疫沉淀和免疫熒光。Pablo基因組DNA的體外檢測技術包括Southern雜交。另外，Pablo蛋白的體內檢測技術包括將標記的抗Pablo抗體導入對象體內。例如，該抗體可用放射活性標記物作標記，然后用標準的顯象技術來檢測該標記物在對象中的存在和位置。
在一個實施方案中，生物樣品含有來自測試對象的蛋白分子。或者，該生物樣品可含有來自測試對象的mRNA分子或基因組DNA分子。較佳的生物樣品是用常規方法從對象分離得到的血清樣品。
在另一實施方案中，該方法還包括從對照對象獲得對照生物樣品，使該對照樣品與能檢測Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，從而使得能夠檢測到生物樣品中存在Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA，然后將對照樣品中Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的存在與測試樣品中Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的存在相比較。
本發明還包括檢測生物樣品中Pablo存在的試劑盒。例如，該試劑盒可包含能檢測生物樣品中Pablo蛋白或mRNA的標記的化合物或試劑；測定樣品中Pablo量的手段；和將樣品中Pablo量與標準品比較的手段。化合物或試劑可裝入合適的容器內。該試劑盒還可有關于用該試劑盒來檢測Pablo蛋白或核酸的說明書。
2.預后性試驗本文描述的診斷方法還可用來鑒別已患有與Pablo表達或活性異常相關的疾病或失調或有患該病危險的對象。例如，本文描述的方法(如前述診斷試驗或下述試驗)可用來鑒別已患有與Pablo蛋白、核酸的表達或活性相關的失調或有患該失調危險的對象。因此，本發明提供了一種鑒定與Pablo表達或活性異常有關的疾病或失調的方法，在該方法中，從對象獲得測試樣品，然后檢測Pablo蛋白或核酸(如mRNA、基因組DNA)，其中Pablo蛋白或核酸的存在表明該對象患有與Pablo表達或活性異常有關的疾病或失調，或是有患該病的危險。本文所用的術語“測試樣品”指從感興趣對象獲得的生物樣品。例如，測試樣品可以是生物體液(如血清)、細胞樣品或組織。
另外，本文描述的預后試驗可用來確定是否能給予該對象試劑(例如激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質、肽、核酸、小分子或其它藥物候選物)來治療與Pablo表達或活性異常有關的疾病或失調。因此，本發明提供了確定是否能用試劑來有效治療對象的與Pablo表達或活性異常有關的失調的方法，該方法是，獲得測試樣品，檢測Pablo蛋白或核酸的表達或活性(例如，其中富含Pablo或核酸表達或活性即表明該對象能通過給予該試劑來治療與Pablo表達或活性異常有關的失調)。
本發明方法還可用來檢測Pablo基因中的遺傳變化，從而確定具有該改變基因的對象是否有患與Pablo基因有關的失調的危險。在較佳的實施方案中，該方法包括檢測對象細胞樣品中是否存在以影響Pablo蛋白編碼基因完整性或Pablo基因錯誤表達的至少一個變化為特征的遺傳變化。例如，通過確定下列之一的存在，可以檢測到這些遺傳變化1)Pablo基因缺失一個或多個核苷酸；2)Pablo基因中加入了一個或多個核苷酸；3)Pablo基因中有一個或多個核苷酸被置換；4)Pablo基因中有染色體重排；5)Pablo基因的信使RNA轉錄物的水平發生變化；6)Pablo基因有異常修飾，例如基因組DNA的甲基化方式異常；7)Pablo基因的信使RNA轉錄物存在非野生型的切割方式；8)Pablo蛋白有非野生型的水平；9)Pablo基因的等位基因丟失；和10)Pablo蛋白有不合適的翻譯后修飾。如本文所述，本領域中已知有許多試驗技術可用來檢測Pablo基因中的變化。較佳的生物樣品是用常規方式從對象分離得到的組織或血清樣品(如神經組織樣品)。
在某些實施方案中，變化的檢測是在聚合酶鏈反應(PCR)(例如參見美國專利4,683,195和4,683,202)(例如錨式PCR或RACE PCR)、或連接鏈反應(LCR)(例如參見Landegran等人.(1988)Science 2411077-1080；和Nakazawa等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91360-364)中使用探針/引物，其中后者特別可用于檢測Pablo基因中的點突變(見Abravaya等人.(1995)Nucleic Acids Res.23675-682)。該方法可包括下列步驟收集患者的細胞樣品，從細胞樣品中分離出核酸(例如基因組，mRNA或兩者)，使核酸樣品與一種或多種引物接觸，這些引物能在與Pablo基因(如果有)雜交和擴增的條件下與Pablo基因特異性雜交，以及檢測擴增產物的存在或不存在，或檢測擴增產物的大小并與對照樣品比較長度。預計PCR和/或LCR可能需要用作初步的擴增步驟與本文描述的用于檢測突變的任何技術結合使用。
其它的擴增方法包括自動維持序列復制(Guatelli，J.C.等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh，D.Y.等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Q-β復制酶(Lizardi，P.M.等人.(1988)Bio-Technology61197)或其它任何核酸擴增方法，然后用本領域技術人員熟知的技術檢測擴增的分子。如果核酸分子的含量非常低，則這些檢測方案特別適用于檢測這些分子。
在另一實施方案中，細胞樣品的Pablo基因中的突變可通過限制性酶切方式的改變來鑒別。例如，分離樣品和對照DNA，任選地擴增，用一種或多種限制性內切核酸酶消化，用凝膠電泳測定片段長度并比較。樣品和對照DNA之間片段長度大小不同就表明樣品DNA中有突變。另外，可用序列特異性核酶(例如參見美國專利5,498,531)通過核酶切割位點的產生或喪失來確定特異性突變的存在。
在其它實施方案中，可通過使樣品以及對照核酸(如DNA或RNA)與含有數百或數千寡核苷酸探針的高密度陣列雜交來鑒定Pablo中的基因突變(Cronin，M.T.等人.(1996)Human Mutation 7244-255；Kozal，M.J.等人.(1996)Nature Medicine 2753-759)。例如，可在含有光產生的DNA探針的二維陣列中鑒定Pablo中的基因突變(如Cronin，M.T.等人(同上)所述)。簡言之，可用第一雜交探針陣列來掃描樣品和對照中的長DNA序列，通過形成依次重疊探針的線性陣列來鑒別序列之間的堿基變化。該步驟允許鑒別點突變。該步驟后是用第二雜交陣列通過使用較小的特異的與所檢測到所有變體或突變互補的探針陣列來對具體突變進行特性分析。每個突變陣列由并行的探針系列組成，一組探針與野生型基因互補，另一組與突變基因互補。
在還有一個實施方案中，可用本領域中已知的各種測序反應來直接測定Pablo基因的序列，并通過比較樣品Pablo的序列與對應野生型(對照)的序列來檢測突變。測序反應的例子包括那些基于Maxam和Gilbert((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)所開發的技術。當進行診斷試驗時，預計可用各種自動化測序程序((1995)Biotechniques 19448)，包括用質譜法測序(例如參見PCT國際出版物WO94/16101；Cohen等人.(1996)Adv.Chromatogr.36127-162；和Griffin等人.(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38147-159)。
檢測Pablo基因中突變的其它方法包括，用斷裂劑保護來檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈體中錯配的堿基(Myers等人.(1985)Science 2301242)。通常，本領域中“錯配斷裂”的技術首先是使含有野生型Pablo序列的RNA或DNA與從組織樣品獲得的潛在突變型RNA或DNA之間雜交形成異源雙鏈體。然后用切割雙鏈體單鏈區域(例如由于對照和樣品鏈之間堿基對錯配而產生)的試劑處理該雙鏈體。例如，可用RNA酶處理RNA/DNA雙鏈體，用S1核酸酶處理DNA/DNA雜交物，用酶消化錯配區域。在其它實施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈體可用羥胺或四氧化鋨和哌啶處理，以便消化錯誤匹配的區域。在消化錯誤匹配的區域后，在變性聚丙烯酰胺凝膠上分級分離所得物質，確定突變位點。例如參見Cotton等人.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397；Saleeba等人.(1992)Methods Enzymol.217286-295。在較佳的實施方案，對對照DNA或RNA作標記進行檢測。
在還有一個實施方案中，錯配切割反應在確定的系統中采用識別雙鏈DNA中錯配較佳的的一種或多種蛋白(因此稱為“DNA錯配修復”酶)，以檢測細胞樣品所得Pablo中的點突變并作圖譜。例如，大腸桿菌的mutY酶切割G/A錯配處的A，HeLa細胞的胸腺嘧啶DNA糖基化酶切割G/T錯配處的T(Hsu等人.(1994)Carcinogenesis151657-1662)。根據一個典型的實施方案，使基于Pablo序列(如野生型Pablo序列)的探針與測試細胞的cDNA或DNA產物雜交。用DNA錯配修復酶處理雙鏈體，如果有切割產物，則可通過電泳程序等檢測到。例如參見美國專利5,459,039。
在其它實施方案中，可用電泳遷移率的改變來鑒別Pablo基因中的突變。例如，可用單鏈構象多態性(SSCP)來檢測突變型和野生型核酸之間的電泳遷移率差別(Orita等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA862766，另見Cotton(1993)Mutat Res 285125-144；和Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。使樣品和對照Pablo核酸的單鏈DNA片段變性，然后使它們復性。單鏈核酸的二級結構因序列而異，導致的電泳遷移率的變化使得即使單堿基變化也能被檢測到。DNA片段可用標記的探針來標記或檢測。試驗的靈敏度可通過使用RNA(而不是DNA)來增強，其中二級結構對于序列中的變化更為敏感。在鑒定實施方案中，該方法根據電泳遷移率的變化利用異源雙鏈體分析來分離雙鏈的異源雙鏈體分子(Keen等人.(1991)Trends Genet 75)。
在另一實施方案中，用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測定突變型或野生型片段在含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中的移動(Myers等人.(1985)Nature 313495)。當用DGGE作為分析方法時，將對DNA加以修飾，以確保其不完全變性，例如通過PCR加上約40bp的高熔點富含GC的DNA(GC夾序列)。在另一實施方案中，用溫度梯度代替變性梯度，以鑒別對照和樣品DNA的遷移率差別(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 26512753)。
用于檢測點突變的其它技術例子包括，但不局限于，選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴增或選擇性引物延伸。例如，制得已知突變位于中央寡核苷酸引物，然后在僅有完全匹配才能雜交的條件下與靶DNA雜交(Saiki等人.(1986)Nature 324163)；Saiki等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230)。當寡核苷酸與雜交膜連接并與標記的靶DNA雜交時，使這些等位基因特異性寡核苷酸與PCR擴增的靶DNA或許多不同的突變雜交。
或者，取決于選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技術可結合用于本發明。用作特異性擴增引物的寡核苷酸在分子中央可能攜帶了感興趣的突變(因此擴增取決于不同的雜交)(Gibbs等人.(1989)Nucleic Acids Res.172437-2448)，或在一個引物的3′端有突變，在合適條件下可防止錯配或減少聚合酶延伸(Prossner等人.(1993)Tibtech 11238)。另外，可能需要在突變區域內導入新的限制性位點，以產生基于斷裂的檢測(Gasparini等人.(1992)Mol.Cell Probes 61)。預計在某些實施方案中，也可用擴增用Taq連接酶來進行擴增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189)。在這些情況下，只有5′序列的3′端完全匹配，才會發生連接，使得能夠通過尋找擴增的存在與否來檢測在特定部位的已知突變。
本文描述的方法可用例如預先包裝的試劑盒來進行，該試劑盒包含至少一個本文所述的探針核酸或抗體試劑，它可常規用于例如臨床設備以診斷表現出涉及Pablo基因的疾病癥狀或家族史的患者。
另外，在本文所述的預后試驗中可使用表達Pablo的任何類型的細胞或組織。
VI.Pablo調節劑的給予本發明的Pablo調節劑以適合體內藥物給藥的生物相容形式給予對象，以便增強或抑制T細胞介導的免疫反應。“適用于體內給藥的生物相容形式”指蛋白質的給藥形式是蛋白質的治療效果超出了其毒性效果。術語“對象”包括可引發免疫反應的活的生物，例如哺乳動物。對象的例子包括人、狗、錨、小鼠、大鼠及其轉基因動物。本文所述試劑的給藥形式可以是任何藥物形式，包括單獨的治療活性量的試劑，或與藥學上可接受的載體合用。
給予治療活性量的本發明的治療組合物定義為達到所需結果的有效的量和所需的劑型和時間。例如，Pablo調節劑的治療活性量可能因諸如個體的疾病狀況、年齡、性別和體重等因素以及肽在該個體內引發所需反應的能力而異。為了提供最優的治療效果，可調節劑量方案。例如，每日可分開給予數劑，或可根據治療情況的要求按比例減少劑量。
本發明的治療或藥物組合物可用本領域已知的任何合適途徑來給予，這些途徑例如包括靜脈內、皮下、肌內、經皮、鞘內或腦內，或在活體外處理程序中給予細胞。給藥可以是迅速注射，或是在一段時間內緩慢灌輸或給予緩釋劑。為了治療中樞神經系統中的組織，可注射給藥或灌輸入腦脊液(CSF)。當希望將Pablo多肽給予中樞神經系統中的細胞時，可給予能促進Pablo多肽穿過血腦屏障的一種或多種試劑。
Pablo也可與提供所需藥物或藥物動力學性質的試劑連接或偶聯。例如，Pablo能與本領域中已知能促進穿過或輸送通過血腦屏障的任何物質(如運鐵蛋白受體的抗體)偶聯，并通過靜脈內注射(例如參見，Friden等人.Science 259373-377，1993，納入本文作為參考)。另外，Pablo能與諸如聚乙二醇等聚合物穩定地連接，以獲得所需的溶解性、穩定性、半衰期和其它藥學上有益的性質。(例如參見Davis等人.EnzymeEng 4169-73，1978；Burnham，Am J Hosp Pharm 51210-218，1994，納入本文作為參考)。
另外，Pablo多肽可以在有助于輸送入細胞胞質的組合物中。例如，該肽能與載體部分(例如能將肽輸送入細胞胞質的脂質體)偶聯。這些方法是本領域中熟知的(例如參見Amselem等人.Chem Phys Lipids 64219-237，1993，納入本文作為參考)。或者，可對Pablo多肽加以修飾，以加入特異性的輸送肽(該輸送體能將Pablo多肽輸入細胞)或與這些輸送肽融合。另外，可通過顯微注射將多肽直接輸入細胞。
該組合物通常以藥物制劑形式使用。這些制劑用制藥領域熟知的方法制得。一種較佳的制劑采用了賦形劑或生理鹽溶液，但是預計也可采用其它藥學上可接受的載體，如生理濃度的其它非毒性鹽，5％的葡萄糖水溶液，無菌水等。本文所用的術語“藥學上可接受的載體”包括任何溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。對藥物活性物質使用這些介質和試劑是本領域中熟知的。除了與該活性化合物不相容的常規介質或試劑外，預計治療組合物中可采用這些常規介質或試劑。該組合物中還可補充加入活性化合物。組合物中可能希望有合適的緩沖液。如果需要，這些溶液可以是冷凍并保藏與無菌安瓿中，在注射前加入無菌水即可重建。初始的溶劑可以是水性的或非水性。Pablo也可加入固體或半固體的相容基質中，該基質能夠植入需要治療的組織中。
載體還可含有其它藥學上可接受的賦形劑，以改變或維持配方的pH、克分子滲透壓濃度、粘度、透明度、顏色、無菌性、穩定性、溶解速率或氣味。同樣，載體還可含有其它藥學上可接受的賦形劑，用于修飾或維持釋放或吸收或穿透通過血腦屏障。這些賦形劑是通常常規用來配制制劑的那些物質，這些制劑能以單位劑型或多劑型或通過連續或定期灌輸來直接灌輸的方式腸胃外給藥。
給藥可根據所用劑型配方的藥物動力學參數和給藥途徑來重復給藥。
預計含有Pablo多肽或其片段的某些配方也可口服給藥。這些制劑宜是包囊的，和合適載體配制在固體劑型中。合適載體、賦形劑和稀釋劑的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、明膠、糖漿、甲基纖維素、甲基和丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂、水、礦物油等。制劑還可包括潤滑劑、潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、防腐劑、增甜劑或調味劑。該組合物可用本領域熟知的程序配制成能在給予患者后迅速、持續或延遲釋放活性組分。該制劑還可含有減少蛋白水解分解的物質和/或促進吸收的物質(如表面活性劑)。
為了便于給藥，使劑量均一，特別有利的是將腸胃外組合物配制成單位劑型。這里所用的“單位劑型”指物理上不連續的單元，適合用作要治療的哺乳動物對象的單元劑型；每個單元含有預定量的經計算能產生所需的治療效果的活性化合物以及所需的藥物載體。本發明單位劑型的規格直接取決于(a)活性化合物的獨特特征以及要實現的具體治療效果，和(b)本領域中將該活性化合物配制成治療個體敏感性所固有的限制。具體量不難由本領域技術人員根據例如患者的大致體重或身體表面積或要占據的身體空間來計算。劑量也可根據所選特定給藥途徑來計算。本領域普通技術人員可為確定合適治療劑量對計算進行所需的細調。本領域技術人員可根據本文靶細胞制劑試驗中公開的活性無需作過多實驗即可進行計算。結合標準劑量反應研究，可確定確切的劑量。應當理解，實際給予的組合物量將由醫師根據有關的情況(包括待治療的病情、所選的要給予的組合物、個別患者的年齡、體重和反應、患者癥狀的嚴重程度以及所選的給藥途徑)來確定。
這些化合物的毒性和治療效果可用細胞培養或實驗室動物中的標準藥物方法(如測定LD50(使50％群體死亡的劑量)和EC50(在50％群體中有治療效果))來確定。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數，它可表示成比例LD50/ED50。表現出大治療指數的化合物是較佳的。盡管可采用表現出毒性副作用的化合物，但應當仔細設計輸送系統，使得這些化合物靶向受累組織部位，以便最大程度地減少對于未受感染細胞的潛在損傷，從而減少副作用。
從細胞培養實驗和動物研究獲得的數據可用于確定人用的劑量范圍。這些化合物的劑量宜在具有ED50而有很少或沒有毒性的循環濃度范圍內。根據所用的劑型和給藥途徑，該劑量可在該范圍內變化。對于用于本發明方法的任何化合物，最初可從細胞培養試驗來估計治療有效劑量。在動物模型中配制一定劑量，使循環的血漿濃度范圍內有在細胞培養物中確定的IC50(即，最大癥狀抑制的半值的測試化合物濃度)。這些信息可用來更準確地確定人中的有用劑量。血漿中的水平例如可用高效液相色譜來測定。
在本發明的領域實施方案中，可將能產生Pablo生物活性形式或Pablo前體(即，容易在體內轉變成生物活性形式Pablo的分子)的載體或細胞植入患者體內，治療性地給予Pablo多肽。在一個方法中，可將分泌Pablo的細胞包囊入半滲透膜中，以便植入患者體內。細胞可以是正常表達Pablo或其前體的細胞，或是經轉化而表達Pablo或其生物活性片段或其前體的細胞。細胞宜為人源的，且當患者為人時，Pablo多肽是人Pablo。然而，本文的制劑和方法可用于獸醫學和人場合，因此本文所用的術語“患者”或“對象”包括人和獸醫患者。
監測試劑(如藥物或化合物)對于Pablo蛋白的表達或和活性的影響不僅可用于基礎藥物篩選，而且還可用于臨床試驗。例如，在表現出Pablo基因表達、蛋白水平降低或Pablo活性下調的對象的臨床試驗中，可以監測本文所述的篩選試驗所確定的試劑提高Pablo基因表達和蛋白水平或上調Pablo活性的效果。或者，在表現出Pablo基因表達、蛋白水平升高或Pablo活性上調的對象的臨床試驗中，可以監測本文所述的篩選試驗所確定的試劑減少Pablo基因表達和蛋白水平或下調Pablo活性的效果。在這些臨床試驗中，Pablo基因的表達或活性，較佳的是涉及該疾病的其它基因可用作特定細胞表型的“讀出”或標記。
例如，非限制性的是，經能調節Pablo活性的試劑(如化合物、藥物或小分子)(例如在本文所述的篩選試驗中鑒定出來)處理后在細胞中調節的包括Pablo的基因可被鑒定出來。因此，為了研究例如在臨床試驗中該試劑對于Pablo相關疾病的效果，可分離細胞，制備RNA，分別分析參與Pablo相關疾病的Pablo和其它基因的表達水平。基因表達水平(即基因表達圖案)可用本文所述的Northern印跡分析或RT-PCR，或是用本文描述的一種方法測定所產生的蛋白量，或通過測定Pablo或其它基因的活性水平來定量測定。這樣，基因表達圖案可作為一種標記來表明細胞對于試劑的生理學反應。因此，這種反應狀況可在用試劑處理個體之前或其間的各個時間測定。
在較佳的實施方案中，本發明提供了一種監測試劑(例如激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質、肽、核酸、小分子或通過本文所述篩選試驗鑒定的其它藥物候選物)對對象的治療效果的方法，該方法包括下列步驟(i)在給予試劑前，從對象獲得給藥前樣品；(ii)監測給藥前樣品中Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的表達水平；(iii)從對象獲得一份或多份給藥后樣品；(iv)檢測給藥后樣品中Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的表達水平或活性；(v)將給藥前樣品中Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的表達水平或活性與給藥后樣品中的Pablo蛋白、mRNA或基因組DNA的表達水平或活性相比較；和(vi)相應地改變試劑對對象的給藥。例如，為了將Pablo表達或活性升高至高于檢測的水平，即，提高試劑的效果，可能需要增加試劑的給藥。或者，為了將Pablo表達或活性降低至低于所檢測的水平，即，減少試劑的效果，可能需要減少試劑的給藥。根據該實施方案，Pablo表達或活性可用作試劑效果的指標，即使沒有可觀察的表型反應時。
在較佳的實施方案中，Pablo調節劑調節對象(該對象將受益于Pablo表達和/或活性的調節)神經細胞中凋亡的能力可通過檢測給予試劑后患者病情的改善來測定。本領域普通技術人員可用適合患者具體條件的指標不難測定這些改善情況。當收集活檢材料對于患者而言危險增加和/或有害時，通過測定患者病情變化來檢測患者的反應是較佳的。
Pablo水平可能在各種病情中會發生改變，因此，Pablo水平的定量測定將提供臨床上有用的信息。另外，由于本文已經證實，細胞表達的Pablo水平增加能使該細胞的細胞死亡調控機理向生存力減少的方向移動，因此認為測定細胞(如一組細胞、組織和腫瘤形成等)中的Pablo水平將提供有關該細胞凋亡狀況的有用信息。另外，由于Pablo與Bcl-xL相互作用，也希望能測定這些與Pablo相互作用的Bcl-xL家族成員的細胞水平。
另外，在治療病情中，可外源性地給予含Pablo的組合物，可能希望在血清、任何所需的組織區室或受累組織中達到Pablo多肽的某一目標水平。因此，能監測患者或生物樣品(包括從患者獲得的組織活檢樣品)中Pablo多肽的水平是有利的，在一些情況下監測Pablo的水平是有利的，在某些情況下，監測Bcl-xL的水平也是有利的。因此，本發明還提供了檢測患者樣品中Pablo存在的方法。
VII.本發明的試劑盒本發明另一方面涉及用于進行本發明的篩選試驗、調節方法或診斷試驗的試劑盒。例如，用于進行本發明的篩選試驗的試劑盒可包括一種含有Pablo多肽的細胞，用于測定Pablo多肽活性的裝置和關于使用該試劑盒來鑒定Pablo活性的調節劑的說明。在另一實施方案中，用來進行本發明篩選試驗的試劑盒可包括一種含有Pablo多肽的組合物，用于測定Pablo活性的裝置和用該試劑盒來鑒定Pablo活性的調節劑的說明。
在另一實施方案中，本發明提供了一種用來進行本發明調節方法的試劑盒。該試劑盒例如可包括在合適載體中并包裝在合適容器中的本發明的調節劑(例如Pablo抑制劑或刺激劑)，以及關于該調節劑用于調節Pablo活性的說明。
本發明另一方面涉及一種用于診斷對象中與Pablo表達和/或活性異常相關的疾病的試劑盒。該試劑盒可包括用于測定Pablo表達的試劑(例如用于檢測Pablo mRNA的核酸探針或用于檢測Pablo蛋白的一種或多種抗體)，與對象結果作比較的對照，以及關于用該試劑盒進行診斷的說明。
本申請全文中引用的所有文獻的內容，包括文獻中的參考文獻，出版的專利、公開的專利申請(包括背景)均納入本文作為參考。除非另有所述，本發明的實施將采用本領域技術人員已知的細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術。這些技術在文獻內有完全地解釋。例如參見，《分子克隆實驗指南》第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor LaboratoryPress1989)；《DNA克隆》，卷I和II(D.N.Glover編，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編，1984)；Mullis等人的美國專利4,683,195；《核酸雜交》(B.D.Hames&S.J.Higgins編，1984)；《轉錄和翻譯》(B.D.Hames&S.J.Higgins編，1984)《動物細胞的培養》(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；《固定化細胞和酶》(IRL Press，1986)；B.Perbal，《分子克隆實踐指南》(1984)；論文“酶學方法”(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《哺乳動物基因轉移載體》(J.H.Miller和M.P.Calos編，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；《酶學方法》卷154和155(Wu等編)，《細胞和分子生物學中的免疫活性方法》(Mayer和Walker編，Academic Press，London，1987)；《免疫學實驗手冊》，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986)；《小鼠胚胎的操作》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
實施例本發明將通過下列實施例作進一步描述，但不應認為這些實施例有任何方式的限制。
實施例1.鑒定Pablo作為Bcl-xL結合蛋白將Bcl-xL表達成與pAS2-1載體中GAL4蛋白結合結構域部分的融合蛋白形式。將人腦庫(Adult human brain Matchmaker cDNA，購自Clontech；目錄號HL4004AH，52008批)表達成與pACTII載體中GAL4蛋白激活結構域部分的融合物形式。Bcl-xL與庫蛋白的功能性相互作用驅動報道基因活性表達。我們利用的報道物表型是組氨酸原養型和β-半乳糖苷酶活性。
用作誘餌的Bcl-xL是從起始密碼子到658位核苷酸的人cDNA(SEQ ID NO3)。它對應于1-211位氨基酸(SEQ ID NO4)。換句話說，被認為是跨膜區的最后22個氨基酸被除去。
根據Clontech的說明書進行庫轉化和篩選。在his平板上生長呈陽性且β-半乳糖苷酶活性呈陽性的三個克隆編碼了以前鑒定的人腦ESTKIAA0269的一部分(在本文中稱為Pablo-促凋亡性Bcl-xL結合蛋白)。如下文所更詳細描述的，這些克隆中的兩個編碼了Pablo最后的大約130個氨基酸(氨基酸429-559)，發現它們足以結合Bcl-xL。
根據KIAA0269的GenBank遞交書中報道的ATG和終止密碼子周圍的序列設計引物，用這些引物來產生編碼Pablo全長開放讀框的克隆。
測定該試驗中鑒別的克隆的序列，確認其與KIAA0269基因庫遞交書中的序列匹配(登錄號D87459)。KIAA0269編碼的多肽最初由Nagase等人(DNAResearch(1996)3321-324)報道，該該文獻中將其稱為KIAA0269，并描述了它的使用方法。Nagase及其同事最初將KIAA0269已表達的序列標識(EST)片段鑒別為以測定腦中人cDNA克隆序列為目的的項目的一部分。
Pablo是WASP(Wiskott-Aldrich綜合征蛋白)蛋白家族的新成員(Derry等人.1994.Cell.78635；Ramesh等人.1999.Trends Cell Biol.915)。WASP家族是肌動蛋白結合蛋白，認為它們參與了細胞骨架微絲組分的重排。這是各種WSAP機組成員組織特異性表達的證據。在保持KIAA的表達圖案時，該蛋白與N-WASP(一種神經元特異性WASP家族成員)最同源(Miki等人.1996.EMBO 155326)。Bear等人最近的報道(1998，J.Cell.Biol.1421325)證實Pablo是網柄菌屬基因SCAR的人同系物。在另一報道中，Machesky等人(1998 Curr.Biol.81347)報道說，Scar1(Pablo)通過與肌動蛋白相關蛋白Arp2/3相互作用來調節肌動蛋白細胞骨架(Machesky等人.1997.Biochem.J.328105；Mullins等人.1998 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 956181)。
Northern印跡表明，Pablo主要在腦中表達，但是在睪丸和卵巢中也有較低水平的表達。
用小鼠Pablo特異性引物通過聚合酶鏈反應來確認該表達方式。利用FVB/N成年小鼠的組織(四只雄性，四只雌性)，發現Pablo mRNA在神經組織(海馬、皮質、紋狀體、前嗅覺細胞(anterior olfactory)、小腦和下丘腦)中，而在肝、腎、心臟、肌肉、小腸和胃中沒有檢測到或幾乎沒有檢測到。
實施例2.Pablo過度表達對小腦顆粒神經元有毒性利用磷酸鈣ProFectin哺乳動物轉染系統(Promega Corporation，Madison，WI)按照生產商說明書，用Pablo-eGFP-C2構建物(eGFP載體購自Clontech；Palo Alto，CA)瞬時轉染小腦顆粒神經元(CGN)。轉染后8小時，獲得轉染的CGN的圖像。每一圖像是用共焦顯微鏡攝取的穿過神經元的光學截面。檢測Pablo-eGFP融合構建物的熒光信號。圖像表明，在此8小時點時，Pablo蛋白主要位于質膜上。該發現在所檢測的30個以上的CGN中是典型的。該蛋白的二級結構沒有任何暗示表明其具有跨膜區，因此它是整合膜蛋白。相反，如上所述，它與細胞骨架的肌動蛋白組分相關的蛋白家族有同源性。因此Pablo與質膜相結合，而非在質膜內。
在用Pablo-eGFP構建物轉染后24小時獲得的另一組圖中，位置圖案與所獲得的不同。在24小時后，Pablo蛋白不局限于質膜該處，而是呈現出分散在整個胞質期間。另外，盡管熒光是分散的，但是卻未出現在核位置中。這些發現在所檢測的30個以上的神經元中典型的。
在轉染后約36小時，細胞體呈現出不規則形狀，神經突片段化。Pablo分布繼續在除胞核外的整個細胞內分散。到48小時，所有eGFP陽性CGN片段化成碎片。在每個培養物，在每一時間點，未轉染的神經元保持健康。
實施例3.Pablo過度表達在原初大鼠海馬神經元中有毒性用磷酸鈣ProFectin哺乳動物轉染系統(Promega Corporation，Madison，WI)轉染蓋玻片上的原初大鼠海馬培養物(培養10天)。轉染后約30小時，將該培養物固定在4％多聚甲醛中，用Hoechst染色，固定在載玻片上。對eGFP陽性細胞的凋亡性胞核進行評分。經eGFP空載體轉染的海馬神經元有30％在經Hoechst染色后顯現出凋亡的胞核(*p＜0.01；與未轉染的相比)。與之相比，未轉染培養物中為低于5％。因此，轉染程序本身看來對培養物有損傷。盡管本底凋亡有此增加，但是在Pablo轉染的細胞中見到了顯著的凋亡增加。如圖1所示，在轉染后30小時，經Pablo轉染的大鼠海馬神經元100％表現出經歷凋亡的細胞的核形態異常(由固縮核表明(**p＜0.01，與轉染eGFP空載體相比))。
實施例4.Pablo過度表達在PC12細胞中有毒性用PC12 Tet-Off細胞系(購自Clontech；Palo Alto，CA)獲得表達Pablo的穩定的PC12細胞系。構建質粒，用于產生Tet-調控的穩定表達的神經元細胞系。通過兩個質粒的雙穩定表達來調節表達的基因，首先是具有tet-控制的反式激活蛋白(tTA)的“調節”質粒的表達，然后是具有感興趣的基因(在此情況下是Pablo)(基因在四環素響應元件(TRE)的啟動子序列控制下)的“響應”質粒表達。市售的調節質粒加入經過工程改造用于潮霉素篩選的載體中，使構建的響應載體包括第二個可選擇標記。構建響應質粒的原料是pcDNA3.1(-)Zeo(例如參見http//www.invitrogen.com/vecgif/pcdna3.1zeo.gif)。該載體是zeocin可選擇的，但是含有組成型活性CMV啟動子。因此，構建的第一步是用NmuI(啟動子上游)和NheI(啟動子下游，也是多接頭中最上游的位點)消化，除去該啟動子。使所得不相容的末端變平，連接，使質粒重新環化，得到無啟動子的載體。第二步是插入TRE。該元件是通過XhoI和EcoRI消化從pTRE(例如參見http//www.clontech.com/clontech/vectors/pTRE.html)獲得的450bp的片段。用相同切開無啟動子的載體，使其接納TRE插入物，得到適合將Pablo基因置于TRE控制下的TRE驅動的響應載體。該載體有一定程度上有限的多接頭，然而只有EcoRI、BamHI和HindIII可作為有用的位點。將Pablo克隆到BamHI位點中。Pablo表達在四環素或四環素相關化合物(如脫氧土霉素)在下關閉，在培養基中不加入四環素時打開。該載體的構建允許通常成毒性的Pablo能在細胞中穩定地表達。
對于轉染，簡言之，將細胞培養在具有添加劑(10％馬血清，5％胎牛血清，抗生素(100U/ml青霉素G鈉和100微克/毫升硫酸鏈霉素)，和2mM L-谷氨酰胺)的DMEM中。約48小時后，將培養基改為含有添加劑和100微克/毫升G418(Gibco BRL)的DMEM。使細胞繁殖，G418濃度降低至50微克/毫升。
將細胞轉移到含有脫氧土霉素的培養基中，用Promega Profectin(磷酸鈣)系統按照生產商說明書，用含有全長Pablo基因的構建物(約50毫微克DNA)轉染細胞。約16小時后，洗滌細胞，并重懸于有添加劑和脫氧土霉素的DMEM中。約48小時后，將細胞置于含有zeocin的DMEM中。
誘導穩定轉化的異源PC12-Pablo細胞群48小時，或不作誘導。通過測定這些培養物中MTS(Cell titer 96 Aqueous；Promega)還原活性來檢測活細胞。該試驗根據的是細胞將四氮唑鹽MTS([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑，內鹽)轉變成可溶于組織培養基中的甲產物，在96孔試驗板中于490nm下直接測定而不作額外的處理(1-3)。吸光度與培養中活細胞數成正比。數據表示成490nm下的光密度；培養物的光密度越高，含有的活細胞就越多。如圖2所示，37℃下培育90分鐘后，未誘導(+Dox)培養物的490nm光密度為0.517。與之相比，誘導Pablo表達的培養物的490nm光密度為0.209。
Hoechst染色數據提示，Pablo誘導的細胞死亡是凋亡性死亡。另外，如圖1所示，在雙雜交篩選中鑒定Pablo，因為它有Bcl-xL結合活性。因此，檢查Bcl-xL使Pablo誘導的細胞死亡減弱的能力。用Bcl-xL-eGFP(綠色熒光蛋白)或eGFP空載體瞬時轉染穩定的異源PC12-Pablo群。此時，通過除去培養基中的脫氧土霉素，誘導Pablo表達。圖3顯示出了轉染/誘導后48小時呈eGFP+的PC12細胞的百分數。Bcl-xL轉染的培養物中約有14％的細胞為eGFP+。經eGFP空載體轉染的培養物中只有2.5％的細胞為eGFP+。轉染效率的這一明顯差異解釋為約40％的eGFP轉染的細胞正在經歷凋亡。相反，只有3.5％的經Bcl-xL-eGFP轉染的細胞在轉染/誘導后48小時顯示出凋亡的胞核(見圖4)。因此，eGFP空載體的明顯較低的轉染效率可能是由于細胞在48小時前死亡。
實施例5.Pablo過度表達對HEK 293細胞沒有毒性利用磷酸鈣ProFectin哺乳動物轉染系統(Promega Corporation，Madison，WI)，用Pablo-eGFP-C2構建物轉染HEK 293細胞。轉染后48小時，檢查293細胞的共焦圖像。此時，細胞和胞核形態是正常的，沒有細胞死亡的跡象。Pablo分布分散在胞質中，而胞核內沒有。在任何檢查時間點(8、24、48小時)，均沒有CGN中早期所見的特異性定位于質膜的現象。
表1歸納了3個分開的實驗數據，其中6孔板中的HEK293細胞用Pablo-eGFP-C2轉染。作為對照，一些培養物用空白eGFP載體轉染，而其它保持未轉染。在這些實驗中，檢查Pablo過度表達的毒性，以及Pablo過度表達對于隨后攻擊(在此例中是星形孢菌素(STS))的易受損性的效果。圖5中顯示了具有固縮核的細胞百分數，圖6顯示了GFP+細胞的百分數。圖5顯示了轉染后48小時293細胞的Hoechst染色所解釋的固縮核百分數。通過CHI-Squared分析，Pablo轉染的培養物與eGFP培養物相比，固縮核沒有統計學上有意義的增加。另外，與未轉染培養中的星形孢菌素效果相比，Pablo轉染的培養物中星形孢菌素引起細胞損失的增加倍數看來并不更為嚴重。圖6表明，三組轉染組的轉染效率基本上相當。圖7中顯示了轉染后48小時具有固縮核的GFP+細胞百分數。圖7報道了特別考察eGFP陽性細胞胞核的數據。同樣，單用eGFP和用Pablo-eGFP融合構建物之間沒有區別。簡言之當Pablo單獨表達時，它既沒有毒性，也沒有早期星形孢菌素攻擊的毒性。
表1HEK 293細胞固縮核GFP+ GFP+和固 固縮核百 GFP+百 GFP+和固縮核縮核 分數 分數百分數對照 7/1100n/a n/a 0.6eGFP 10/690193 1 1.428 0.5單用Pablo 28/1262 318 1 2.225 0.3100nM STS 19/516n/a n/a 3.7Pablo+STS 69/1058 387 3 6.536 0.8對于表1，在用Pablo轉染后48小時觀察細胞；用STS處理24小時，在轉染后24小時加入。
Pablo轉染對神經元和非神經元細胞的效果顯示在圖8中。如該圖所示，除了主要在神經元細胞中表達外，看來Pablo的活性也是神經元細胞特異性的。
關于Pablo在神經元和非神經元細胞中的毒性數據另外列于表II中。該表顯示了在用eGFP空載體或含有編碼Pablo的核酸分子的載體轉染24小時后的凋亡性核酸的百分數。這些數據表明Pablo在所測試的神經細胞中有明顯的促凋亡性(p＜0.01)，而在非神經元細胞中沒有凋亡性。
表II.用Pablo GFP構建物或空白GFP構建物轉染后24小時的凋亡性胞核百分數。
*p＜0.01實施例6.Pablo的Bcl-xL結合區域的鑒定
SEQ ID NO2顯示了這些實驗中所用全長Pablo的氨基酸序列。Bcl-xL酵母雙雜交篩選中分離的三個克隆含有Pablo cDNA的一部分。兩個克隆編碼大約最后130個氨基酸。一個克隆編碼最后213個氨基酸。這提示Pablo與Bcl-xL結合的能力在C端的130個氨基酸(從大約氨基酸429-559)內。
構建缺少C端142個氨基酸(氨基酸418-559)的Pablo(Δ142)缺失突變體來確認這些結果。為了構建Pablo(Δ142)，用現有的Pablo-eGFP融合載體和下列兩個引物進行PCR反應1)tagaattc atg ccg cta gtg aaa aga aac arc g(SEQ ID NO7)2)taggatcc acc ttg tgg gag tgg atg aac tgg(SEQ ID NO8)引物1是5′方向的引物，它在緊靠ATG起始密碼子的5′端有EcoRI位點。引物2是3′方向的引物，它在緊靠Pablo核苷酸#1254(ATG起始密碼子后)的3′端有BamHI位點。這兩個引物將產生編碼Pablo的氨基酸1-418的片段。將該PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen；目錄號K4500-01)中。它的EcoRI-BamHI消化物產生PabloΔ142基因，將其克隆到pEGFP-C2的EcoRI和BamHI位點內(Pablo的N端與讀框2中的GFP的C端相連；Clontech，目錄號為6083-1)。利用合適的引物，對整個Pablo Δ142構建物進行測序和確認。核苷酸序列顯示在SEQ ID NO5中，氨基酸序列顯示在SEQ ID NO6中。
用全長Pablo、Pablo Δ142和eGFP空載體瞬時轉染大鼠小腦顆粒神經元。在轉染后8、24和42小時，用4％多聚甲醛固定培養物，并用Hoechst染色。將GFP熒光細胞的胞核評為凋亡或正常。該實驗的結果顯示在圖9中。該圖表明，Pablo蛋白的大約418-559位氨基酸對凋亡活性負責。
制得第二個Pablo的缺失突變體，它缺少蛋白質羧基端的70個氨基酸，即缺少氨基酸490-559。在引起神經細胞毒性上，該構建物的效果為全長Pablo蛋白的50％。
Δ142突變體(顯示出沒有神經細胞毒性)和Δ70突變體(顯示出有最大活性的50％)中缺失位點之間的區域，即436-489位氨基酸，是Pablo、WAVE2以及WAVE3之間有較大多樣性的區域。根據這些結果，該區域可能包含Pablo的Bcl-xL結合結構域。
實施例7.三種Pablo缺失構建物的活性比較除了Δ142和Δ70構建物外，還制得只有羧基端142個氨基酸(Pablo的氨基酸418-559)的構建物(尾部構建物)。Δ142構建物和Δ70構建物缺少WH-WASP-同源結構域和酸性結構域(如Suetsuyu，S.等人.1999.Biochem.Biophys.Res.Comm.260296-302中所示)。尾部構建物缺少堿性結構域、聚脯氨酸結構域，但是含有Bcl-xL結合結構域、WSAP同源結構域和酸性結構域。這些構建物的示意圖顯示在圖14中。
圖15表明Pablo全長構建物和Δ70構建物對大鼠小腦顆粒神經元培養物有毒性，而Δ142構建物和尾部構建物則沒有毒性。圖16歸納了在PC12細胞中進行的共轉染。進行圖17中所示的四種轉染，并監測轉染細胞隨時間的存活情況。圖16顯示出全長Pablo過度表達所產生的預期毒性。Δ142構建物的共轉染不能減弱毒性。這種轉染中的凋亡具有較慢的開始速度，但是所達到的水平與但單用全長Pablo時相同。相反，Pablo與尾部構建物的共轉染導致Pablo介導的凋亡幾乎完全除去。根據該研究，我們的結論是尾部構建物能以顯性失活方式起減少Pablo促凋亡活性的作用。
實施例8.抗Pablo抗體的制備和Western印跡用Pablo多肽的片段(GIRPSSPVTVLALAHP)作為肽抗原來制備家兔多克隆抗Pablo抗體。親合純化該多克隆抗血清，用于Western印跡。用大鼠腦的幾個區域(紋狀體、皮質、小腦和海馬)的裂解液測試抗體，使抗體識別大鼠Pablo蛋白，結果在合適分子量處顯現出單一條帶。在所測試的兩個神經元細胞系(PC12和SY5Y)中見到了相同分子量的條帶。在所測試的3種非神經元細胞系(HEK 293；CHO和COS)中沒有明顯可檢測的Pablo蛋白。
實施例9.人Pablo的轉基因過度表達以神經元特異性方式表達全長人Pablo蛋白的轉基因模型將用來確認Pablo蛋白的促凋亡作用。該模型將進一步提供測試調節凋亡的先導化合物的效果的方法。為了防止凋亡性因子過度表達可能對胚胎的致死性，采用一種可調節的表達系統，該系統采用了依賴于四環素的表達系統(例如參見，Furth等人.(1994)PNAS 919302-9306；Gossen等人.(1995)Science 2681766-1769)。這里所用的術語“可調節的表達系統”包括調節蛋白表達的系統。為了產生轉基因模型，將該系統的組件建立在分開的轉基因小鼠系中，然后通過交配使它們成為一個系。
在TRE啟動子(四環素響應元件)的方向下產生具有hPablo或hPablo-GFP的cDNA的轉基因構建物。TRE通常包含7個串聯排列的反式激活蛋白識別位點(“tetO”位點)。第二個轉基因構建物插入了在CNS特異性小鼠Thy1啟動子方向下的系統反式激活蛋白(tTA)的cDNA(例如參見Caroni(1997)J-Neurosci.Methods 713-9；Gorden等人.(1987)Cell 50445-452；Vidal等人.(1990)Genes and Development 51136-1148)。在該構建物中，Thy1基因的5′和3′非翻譯區(UTR)接在tTA cDNA的側面，從而賦予轉錄物穩定性。或者，還可用更限制性的神經元特異性啟動子(如神經元特異性烯醇酶啟動子)來指導tTA的表達(NES；例如參見，Forss-Petter等人.(1990)Neuron5187-197；Chen等人.(1998)Mol.Pharmacology 54495-503)。
然后，使攜帶TRE-Pablo構建物和神經元特異性tTA構建物的轉基因動物雜交，以使兩個轉基因基因座在一個基因組中。所得動物將在可調節的條件下在CNS中過度表達Pablo(即，使Pablo在四環素缺陷型條件下表達)。四環素或其類似物(例如脫水四環素、脫氧土霉素或氰基四環素)通常是給予動物的食物和水中，但是也可任選地進行腹膜內(interperitoneal)注射。
實施例10.人Pablo的顯性失活突變體的轉基因過度表達用Pablo蛋白的顯性失活突變體制得內源性Pablo功能被破壞的轉基因模型。在顯性失活突變體系統中，破壞通常是通過編碼結合和/或底物的突變體與內源性蛋白之間競爭來實現的。產生這樣的模型有助于在導致細胞死亡的生理攻擊(如局部缺血、藥劑、切除腎上腺)期間評價Pablo功能。hPablo的142個羧基端氨基酸代表了這樣一種顯性突變體(“Pablo-dm”)。將編碼Pablo-dm的cDNA導入轉基因構建物中，使其CNS-特異性小鼠Thy1.2啟動子方向下。在該構建物中，Thy1.2基因的5′和3′非翻譯區(UTR)接在Pablo-dm cDNA的側面。該構建物產生的轉基因動物系將在整個CNS中組成型地表達該構建物。
另外還產生了該轉基因模型的可調控版本。這是通過采用前述實施例中描述的四環素依賴型表達系統的改進版本來實現的。在該版本中，改進Thy1.2啟動子，使其包括一個tetO識別位點。這是通過將tetO短序列插入Thy1.2啟動子中-270位的Sma位點或-360位的BglII位點來實現的。用該Thy1.2/tetO啟動子來指導Pablo-dm在轉基因動物中直接表達。第二個轉基因構建物編碼了在未修飾的Thy1.2啟動子下的修飾的tTA反式激活蛋白。修飾tTA反式激活蛋白的cDNA，使其包括Kid-1基因的KRAB阻遏蛋白結構域，從而編碼tTA-KRAB。KRAB阻遏蛋白結構域在與tetO識別位點聯系(通過與tTA蛋白融合)后能抑制毗鄰的Thy1.2啟動子的轉錄。類似的tTA-KRAB系統在例如Deuschle等人.(1995)Mol.Cell.Biol.151907-1914中有所描述。Kid-1 KRAB結構域在例如Elser等人.(1997)J.Biol.Chem.27227908-27912中有所描述。
用這些構建物產生兩個轉基因動物系，使它們交配，以使兩個基因座在一個品系中。所得品系將在CNS中以四環素依賴型方式(例如在四環素存在下表達)過度表達Pablo-dm突變體。
實施例11.Pablo的轉基因剔除產生一個內源性Pablo功能被除去的動物品系(“剔除”模型)，這將為理解Pablo在發育中所起的作用提供一個手段。另外，可用缺少Pablo功能的活動物來測試針對Pablo功能的前導化合物以評價其副作用。Pablo剔除通過在克隆庫(OmniBank；Lexicon Genetics，The Woodlands，Texas；例如參見http//www.lexgen.com)中鑒別具有合適缺失的胚胎干細胞克隆來產生。當使該胚胎干細胞在代孕母親動物中足月發育后，它將產生Pablo的轉基因剔除。
等價方案本領域技術人員只需用常規實驗就能認識到或能確定本文描述的發明的具體實施方案有許多等價方案。這些等價方案均包括在下列權利要求中。
序列表<110>美國家庭用品有限公司<120>與BCL-XL相互作用的多肽PABLO及其有關用途<130>GNN-005CPPC<140>09/425,501<141>1999-10-22<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2625<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(243)..(1919)<400>1cttctcttgc acttgcggat gatgaactgg aataacgatg aaagaaagca catccgatct 60caacattcac gtcctgccct ataaccgatt aattaattga tccccagcta gactagtgtt 120ggagaaatca gcatgttaaa acaactgttg atgatagctg ttggagtaaa gttgcagtgg 180aagctatggc tgcaaaatcg ttaaaatctt caaggtgaac tggcacaaag gttaatctca 240ag atg ccg cta gtg aaa aga aac atc gat cct agg cac ttg tgc cac287Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His1 5 10 15aca gca ctg cct aga ggc att aag aat gaa ctg gaa tgt gta acc aat 335Thr Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn20 25 30att tcc ttg gca aat ata att aga caa cta agt agc cta agt aaa tat 383Ile Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr35 40 45gct gaa gat ata ttt gga gaa tta ttc aat gaa gca cat agt ttt tcc 431Ala Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser50 55 60ttc aga gtc aac tca ttg caa gaa cgt gtg gac cgt tta tct gtt agt 479Phe Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser
65 70 75gtt aca cag ctt gat cca aag gaa gaa gaa ttg tct ttg caa gat ata 527Val Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile80 85 90 95aca atg agg aaa gct ttc cga agt tct aca att caa gac cag cag ctt 575Thr Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu100 105 110ttc gat cgc aag act ttg cct att cca tta cag gag acg tac gat gtt 623Phe Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val115 120 125tgt gaa cag cct cca cct ctc aat ata ctc act cct tat aga gat gat 671Cys Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp130 135 140ggt aaa gaa ggt ctg aag ttt tat acc aat cct tcg tat ttc ttt gat 719Gly Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp145 150 155cta tgg aaa gaa aaa atg ttg caa gat aca gag gat aag agg aag gaa 767Leu Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu160 165 170 175aag agg aag cag aag cag aaa aat cta gat cgt cct cat gaa cca gaa 815Lys Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu180 185 190aaa gtg cca aga gca cct cat gac agg cgg cga gaa tgg cag aag ctg 863Lys Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu195 200 205gcc caa ggt cca gag ctg gct gaa gat gat gct aat ctc tta cat aag 911Ala Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys210 215 220cat att gaa gtt gct aat ggc cca gcc tct cat ttt gaa aca aga cct 959His Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro225 230 235cag aca tac gtg gat cat atg gat gga tct tac tca ctt tct gcc ttg 1007Gln Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu240 245 250 255cca ttt agt cag atg agt gag ctt ctg act aga gct gag gaa agg gta 1055Pro Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val260 265 270tta gtc aga cca cat gaa cca cct cca cct cca cca atg cat gga gca 1103Leu Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala
275 280 285gga gat gca aaa ccg ata ccc acc tgt atc agt tct gct aca ggt ttg 1151Gly Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu290 295 300ata gaa aat cgc cct cag tca cca gct aca ggc aga aca cct gtg ttt 1199Ile Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe305 310 315gtg agc ccc act ccc cca cct cct cca cca cct ctt cca tct gcc ttg 1247Val Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu320 325 330 335tca act tcc tca tta aga gct tca atg act tca act cct ccc cct cca 1295Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro340 345 350gta cct ccc cca cct cca cct cca gcc act gct ttg caa gct cca gca 1343Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala355 360 365gta cca cca cct cca gct cct ctt cag att gcc cct gga gtt ctt cac 1391Val Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His370 375 380cca gct cct cct cca att gca cct cct cta gta cag ccc tct cca cca 1439Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro385 390 395gta gct aga gct gcc cca gta tgt gag act gta cca gtt cat cca ctc 1487Val Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu400 405 410 415cca caa ggt gaa gtt cag ggg ctg cct cca ccc cca cca ccg cct cct 1535Pro Gln Gly Glu Val Gln Gly Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro420 425 430ctg cct cca cct ggc att cga cca tca tca cct gtc aca gtt aca gct 1583Leu Pro Pro Pro Gly Ile Arg Pro Ser Ser Pro Val Thr Val Thr Ala435 440 445ctt gct cat cct ccc tct ggg cta cat cca act cca tct act gcc cca 1631Leu Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr Pro Ser Thr Ala Pro450 455 460ggt ccc cat gtt cca tta atg cct cca tct cct cca tca caa gtt ata 1679Gly Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro Pro Ser Gln Val Ile465 470 475cct gct tct gag cca aag cgc cat cca tca acc cta cct gta atc agt 1727Pro Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser480 485 490 495gat gcc agg agt gtg cta ctg gaa gca ata cga aaa ggt att cag cta 1775Asp Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gln Leu500 505 510cgc aaa gta gaa gag cag cgt gaa cag gaa gct aag cat gaa cgc att 1823Arg Lys Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Ala Lys His Glu Arg Ile515 520 525gaa aac gat gtt gcc acc atc ctg tct cgc cgt att gct gtt gaa tat 1871Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr530 535 540agt gat tcg gaa gat gat tca gaa ttt gat gaa gta gat tgg ttg gag 1919Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu545 550 555taagaaaaat gcattgataa atattacaaa actgaatgca aatgtccttt gtggtgcttg 1979ttccttgaaa atgtttggtc attctagtgt tttgctttct tttccttata ataaatgacc 2039cttttcctcc ataacttttg atttctaagg aaaatattag catacatttc aaactaaatg 2099ttttacagtg gcttatcttt tttttccccc tgaaaagact aatttggtca aataaaccac 2159taagtattaa gcatggacag ctgttgttag agtagcagat tcagtttttt gatatatctt 2219aattgtgtac tttgtgaatt ttaatttaaa gaaagcaact gaaattgaaa tcttgagggc 2279agctgtatct actaatgagc cttattccat ttcctgatgt tttaaaagaa gaaacactgc 2339cttgattata cgaatacact cagaaagtac atttagcttg tagtgttgaa ttctcttaaa 2399ggaatgcttg aattttttca ttattgtttt attgttttta tatacttgcc ttatttgaat 2459gtttagcagt atccccttcc cacttatata ttgtgtgata tgattttgct tgcctatagg 2519agttaaaaac ttttccatgt gaaatactct gacttaaaca tacatgtaac ttacataact 2579gttaagaata acagtctgat ttaataaatg gttcatttta aaagtt2625<210>2<211>559<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr1 5 10 15Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile20 25 30Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala35 40 45Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe50 55 60Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val65 70 75 80Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr85 90 95Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe100 105 110Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys115 120 125Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly130 135 140Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu145 150 155 160Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu Lys165 170 175Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu Lys180 185 190Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala195 200 205Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His210 215 220Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln225 230 235 240Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro245 250 255Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu260 265 270Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly275 280 285Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile
290 295 300Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val305 310 315 320Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser325 330 335Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val340 345 350Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val355 360 365Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro370 375 380Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val385 390 395 400Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu Pro405 410 415Gln Gly Glu Val Gln Gly Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu420 425 430Pro Pro Pro Gly Ile Arg Pro Ser Ser Pro Val Thr Val Thr Ala Leu435 440 445Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr Pro Ser Thr Ala Pro Gly450 455 460Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro Pro Ser Gln Val Ile Pro465 470 475 480Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp485 490 495Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gln Leu Arg500 505 510Lys Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu515 520 525Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser530 535 540Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu545 550 555<210>3<211>747<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(21)..(656)<400>3cagctttgac tcatatgaaa atg tct cag agc aac cgg gag ctg gtg gtt gac 53Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp1 5 10ttt ctc tcc tac aag ctt tcc cag aaa gga tac agc tgg agt cag ttt 101Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe15 20 25agt gat gtg gaa gag aac agg act gag gcc cca gaa ggg act gaa tcg 149Ser Asp Val Glu Glu Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser30 35 40gag atg gag acc ccc agt gcc atc aat ggc aac cca tcc tgg cac ctg 197Glu Met Glu Thr Pro Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu45 50 55gca gac agc ccc gcg gtg aat gga gcc act ggc cac agc agc agt ttg 245Ala Asp Ser Pro Ala Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu60 65 70 75gat gcc cgg gag gtg atc ccc atg gca gca gta aag caa gcg ctg agg 293Asp Ala Arg Glu Val Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg80 85 90gag gca ggc gac gag ttt gaa ctg cgg tac cgg cgg gca ttc agt gac 341Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp95 100 105ctg aca tcc cag ctc cac atc acc cca ggg aca gca tat cag agc ttt 389Leu Thr Ser Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe110 115 120gaa cag gta gtg aat gaa ctc ttc cgg gat ggg gta aac tgg ggt cgc 437Glu Gln Val Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg125 130 135att gtg gcc ttt ttc tcc ttc ggc ggg gca ctg tgc gtg gaa agc gta 485Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val140 145 150 155gac aag gag atg cag gta ttg gtg agt cgg atc gca gct tgg atg gcc 533Asp Lys Glu Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala160 165 170act tac cgg aat gac cac cta gag cct tgg atc cag gag aac ggc ggc 581Thr Tyr Arg Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly175 180 185tgg gat act ttt gtg gaa ctc tat ggg aac aat gca gca gcc gag 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Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln145 150 155 160Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Arg Asn Asp165 170 175His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val180 185 190Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu195 200 205Arg Phe Asn Arg210<210>5<211>1254<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(1254)<400>5atg ccg cta gtg aaa aga aac atc gat cct agg cac ttg tgc cac aca 48Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr1 5 10 15gca ctg cct aga ggc att aag aat gaa ctg gaa tgt gta acc aat att 96Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile20 25 30tcc ttg gca aat ata att aga caa cta agt agc cta agt aaa tat gct 144Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala35 40 45gaa gat ata ttt gga gaa tta ttc aat gaa gca cat agt ttt tcc ttc 192Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe50 55 60aga gtc aac tca ttg caa gaa cgt gtg gac cgt tta tct gtt agt gtt 240Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val65 70 75 80aca cag ctt gat cca aag gaa gaa gaa ttg tct ttg caa gat ata aca 288Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr85 90 95atg agg aaa gct ttc cga agt tct aca att caa gac cag cag ctt ttc 336Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe100 105 110gat cgc aag act ttg cct att cca tta cag gag acg tac gat gtt tgt 384Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys115 120 125gaa cag cct cca cct ctc aat ata ctc act cct tat aga gat gat ggt 432Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly130 135 140aaa gaa ggt ctg aag ttt tat acc aat cct tcg tat ttc ttt gat cta 480Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu145 150 155 160tgg aaa gaa aaa atg ttg caa gat aca gag gat aag agg aag gaa aag 528Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu Lys165 170 175agg aag cag aag cag aaa aat cta gat cgt cct cat gaa cca gaa aaa 576Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu Lys180 185 190gtg cca aga gca cct cat gac agg cgg cga gaa tgg cag aag ctg gcc 624Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala195 200 205caa ggt cca gag ctg gct gaa gat gat gct aat ctc tta cat aag cat 672Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His210 215 220att gaa gtt gct aat ggc cca gcc tct cat ttt gaa aca aga cct cag 720Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln225 230 235 240aca tac gtg gat cat atg gat gga tct tac tca ctt tct gcc ttg cca 768Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro245 250 255ttt agt cag atg agt gag ctt ctg act aga gct gag gaa agg gta tta 816Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu260 265 270gtc aga cca cat gaa cca cct cca cct cca cca atg cat gga gca gga 864Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly275 280 285gat gca aaa ccg ata ccc acc tgt atc agt tct gct aca ggt ttg ata 912Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile290 295 300gaa aat cgc cct cag tca cca gct aca ggc aga aca cct gtg ttt gtg 960Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val305 310 315 320agc ccc act ccc cca cct cct cca cca cct ctt cca tct gcc ttg tca 1008Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser325 330 335act tcc tca tta aga gct tca atg act tca act cct ccc cct cca gta 1056Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val340 345 350cct ccc cca cct cca cct cca gcc act gct ttg caa gct cca gca gta 1104Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val355 360 365cca cca cct cca gct cct ctt cag att gcc cct gga gtt ctt cac cca 1152Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro370 375 380gct cct cct cca att gca cct cct cta gta cag ccc tct cca cca gta 1200Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val385 390 395 400gct aga gct gcc cca gta tgt gag act gta cca gtt cat cca ctc cca 1248Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu 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Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala195 200 205Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His210 215 220Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln225 230 235 240Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro245 250 255Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu260 265 270Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly275 280 285Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile290 295 300Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val305 310 315 320Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser325 330 335Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val340 345 350Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val355 360 365Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro370 375 380Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val385 390 395 400Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu Pro405 410 415Gln Gly
權利要求
1.一種分離的核酸分子，它包含選自下列的核苷酸序列a)編碼分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的核苷酸序列，其中所述分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域與SEQ ID NO2所示的Bcl-xL結合結構域有70％的氨基酸序列相同性；b)編碼分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在45℃6X SSC中、然后在50-65℃下用0.2 SSC和0.1％SDS洗滌一次或多次后與編碼Bcl-xL結合結構域的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的互補序列雜交；c)如SEQ ID NO1所示的編碼分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的大約419-559位氨基酸或大約429-559位氨基酸所示的氨基酸序列組成。
3.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的大約436-489位氨基酸所示的氨基酸序列組成。
4.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域調節神經細胞中的凋亡。
5.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼融合蛋白。
6.一種分離的多肽，該多肽選自下列a)包含分離的哺乳動物Bcl-xL結合結構域的多肽，其中所述分離的Bcl-xL結合結構域由與SEQ ID NO2所示的Pablo Bcl-xL結合結構域有至少70％相同性的氨基酸序列組成；b)包含Bcl-xL結合結構域的多肽，其中所述Bcl-xL結合結構域由與SEQ ID NO2所示的Pablo Bcl-xL結合結構域有至少70％相同性的氨基酸序列組成，條件是所述多肽不是全長Pablo多肽；c)包含SEQ ID NO2所示的Bcl-xL結合結構域的多肽。
7.一種多肽，該多肽包含SEQ ID NO2所示的分離的Bcl-xL結合結構域。
8.根據權利要求7所述的多肽，該多肽中已經作了保守性氨基酸置換。
9.一種多肽，它由SEQ ID NO2所示的分離的Bcl-xL結合結構域組成。
10.根據權利要求6所述的多肽，其中所述分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ IDNO2的大約419-559位氨基酸或大約429-559位氨基酸組成。
11.根據權利要求6所述的分離的核酸分子，其中分離的Bcl-xL結合結構域由SEQ ID NO2的大約436-489位氨基酸組成。
12.根據權利要求6所述的多肽，其中所述分離的Bcl-xL結合結構域調節神經細胞中的凋亡。
13.一種融合蛋白，該蛋白包含由分離的Bcl-xL結合結構域組成的第一多肽和非Pablo的第二多肽。
14.一種分離的核酸分子，該核酸分子與編碼Bcl-xL結合結構域的SEQ ID NO1的一部分反義。
15.一種載體，它包含權利要求1所述的核酸分子。
16.一種神經細胞系，它穩定表達SEQ ID NO2所示的分離的Bcl-xL結合結構域或異源Pablo多肽。
17.一種非人轉基因動物，它包含編碼至少一種轉基因Pablo蛋白的轉基因以及至少一個指導至少一種轉基因Pablo蛋白表達的啟動子元件。
18.根據權利要求17所述的轉基因動物，其中Pablo蛋白是人Pablo。
19.根據權利要求17所述的轉基因動物，其中非人轉基因動物是小鼠。
20.根據權利要求17所述的轉基因動物，其中至少一個啟動子元件指導組織特異性的表達。
21.根據權利要求20所述的轉基因動物，其中啟動子元件主要指導神經細胞中的表達。
22.根據權利要求20所述的轉基因動物，其中至少一個啟動子選自Thy1.2啟動子和神經元特異性烯醇酶啟動子。
23.根據權利要求17所述的轉基因動物，其中轉基因Pablo蛋白包含截短的或改變的Pablo蛋白。
24.根據權利要求18所述的轉基因動物，其中轉基因Pablo蛋白是Pablo的顯性失活突變體。
25.根據權利要求17所述的轉基因動物，該轉基因動物包含可調節的表達系統。
26.根據權利要求25所述的轉基因動物，其中可調節的表達系統是四環素依賴型表達系統，它包含四環素敏感型反式激活蛋白和在轉基因啟動子元件中的至少一個四環素敏感型反式激活蛋白的識別位點序列。
27.根據權利要求26所述的轉基因動物，其中四環素敏感型反式激活蛋白還包含轉錄阻遏蛋白結構域。
28.根據權利要求27所述的轉基因動物，其中轉錄阻遏蛋白結構域是KRAB結構域。
29.一種非人轉基因動物，它包含一基因組，該基因組中內源性Pablo蛋白已經缺失或改變，從而使該動物中不發生Pablo的功能性表達。
30.一種調節細胞中凋亡的方法，該方法包括調節Pablo多肽或其Bcl-xL結合結構域的活性。
31.一種調節細胞中凋亡的方法，該方法包括調節Pablo多肽或其Bcl-xL結合結構域的表達。
32.一種治療對象神經系統失調的方法，該方法包括調節對象細胞中Pablo的表達或活性，從而治療該對象體內的神經系統失調。
33.一種鑒定化合物的方法，該化合物調節Bcl-xL結合結構域的調節凋亡的能力，該方法包括使表達Bcl-xL結合結構域的細胞與測試化合物接觸；測定測試化合物調節Bcl-xL結合結構域活性的能力，從而鑒定出能調節Bcl-xL結合結構域的凋亡調節能力的化合物。
34.一種鑒定化合物的方法，該化合物能調節Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL相互作用的能力，該方法包括使含有Bcl-xL結合結構域的無細胞混合物與測試化合物接觸；測定測試化合物對Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL相互作用能力的調節能力，從而鑒定出調節Bcl-xL結合結構域與Bcl-xL相互作用能力的化合物。
全文摘要
本發明至少部分涉及包括BCL－XL結合結構域的多肽,PABLO多肽的新的BCL－XL結合結構域,編碼這些多肽的核酸分子及其應用。例如,這些多肽和核酸分子可用于調節凋亡(尤其是神經細胞中的凋亡),以及用于治療或預防能得益于細胞死亡的調節的失調。
文檔編號G01N33/53GK1382156SQ00814635
公開日2002年11月27日 申請日期2000年10月20日 優先權日1999年10月22日
發明者R·馬克, K·H·楊, A·伍茲 申請人:惠氏