專利名稱：與pea-15相互作用的新型化合物的制作方法
與PEA-15相互作用的新型化合物本發明涉及能夠與PEA-15蛋白(星形膠質細胞中富含的磷蛋白， 其具有15 kDa的分子量)相互作用的化合物，它們的熒光衍生物，和 這些化合物在篩選和診斷方法中的應用，以及藥物組合物。PEA-15是具有130個氨基酸的小的細胞質蛋白質，所述蛋白質在 腦中，特別是星形膠質細胞中大量表達，并且普遍地在許多其他組織 中表達，但表達程度較低。該蛋白質的結構(在脊推動物動物中非常保守)在N-末端包含具 有80個氨基酸的死亡效應結構域(DED)和NES (核輸出信號)結構 域以及在C-末端包含低組織化結構，所述低組織化結構包含通過蛋白 激酶C (PKC)和通過II型依賴于鉤/鉤調蛋白的蛋白激酶進行的磷酸 化的位點。PEA-15的基因組序列是由4個外顯子組成并在基因組DM的大約 10.2 kb上延伸(Wolford等人，2000， Gene， 241:143 )。PEA-15在體內以不同的形式存在非磷酸化形式、單和二磷酸化形式；每一種形式表現出不同的生物學活性。PEA-15是可通過其不同功能結構域以及根據其磷酸化程度與許 多伙伴相互作用的多功能蛋白質(Renault等人，Biochem. Pharmacol, 2003， 66: 1581 )。迄今為止，已鑒定了參與由該蛋白質 執行的多種功能的PEA-15的7個伙伴，即FADD、胱天蛋白酶8、 Omi/HtraA2、 ERK1/2、 Akt、 Rsk2和磷脂酶Dl。通過這些多種相互作 用，PEA-15似乎在許多生理學和/或病理學細胞過程中起著至關重要 的作用。已顯示，該蛋白質尤其具有下列性質抑制凋亡、抑制細胞進入 細胞周期、參與由H-Ras癌基因的表達所抑制的整聯蛋白信號傳導的 重建、抑制細胞增殖以及參與葡萄糖的運輸和胰島素的分泌(Renault等人，Biochem. Pharmacol., 2003， 66: 1581 )。例如，已觀察到，星形膠質細胞中PEA-15的表達的抑制導致星形 膠質細胞對由TNFoc誘導的細胞凋亡的敏感性增加(Kitsberg等人，J. Neurosci.， 1999， 19: 8244 ),以及該蛋白質的表達的減少引起不同 的細胞系例如星形膠質細胞、淋巴細胞和肝細胞的增殖增加 (Formstecher等人，Dev. Cell.， 2001， 1: 239 )。還觀察到，該 蛋白質的表達還抑制細胞遷移。此外，該蛋白質還能夠參與腦原發性腫瘤的發生和/或發展，以及 參與轉移過程。例如，在不同腫瘤例如神經膠質瘤、卵巢癌、腎癌、乳腺癌、肝 細胞癌、淋巴瘤或黑素瘤中已觀察到PEA-15的表達增加(Hwang等人， Genomics, 1997， 42: 540; Bera等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1994， 91: 9789 )。此外，該蛋白質在轉基因小鼠中的過量表達增加了它們對于化學 誘導的皮膚癌的敏感性(Formisano等人，Oncogene, 2005， 24: 7012)。相反地，PEA-15在組織中的表達引起抑制該組織對于腫瘤細胞侵 襲的容許。還顯示了 ，通過減少PEA-15的表達可使乳腺癌細胞對化學療法敏 感(Stassi等人，Cancer Res., 2005， 65: 6668 )。W0 2004/108961提出了 PEA-15作為乳頭狀瘤的標記物和治療靶 標的用途。此外，已在患有II型糖尿病的患者的成纖維細胞、橫紋肌和脂肪 組織中觀察到PEA-15的過量表達(Condorelli等人，EMBO. J. ， 1997， 17: 3858 )，并且顯示了，對該蛋白質的表達的抑制使得能夠恢復響 應于葡萄糖的胰島素分泌。還在某些炎癥過程中觀察到該蛋白質的過量表達。 EP 1，189，060提出了 PEA-15作為神經變性疾病中的標記物和治 療靶標的用途。因此，PEA-15似乎可用作許多病理學狀況的治療耙標。然而，迄 今為止，不存在能夠調節該蛋白質的活性的容易獲得的化合物。 此外，也不存在能夠允許容易地篩選此類化合物的工具。 因此，對于容易地獲得能夠與PEA-15相互作用并調節其活性的化 合物存在需要。還對于擁有能夠調節PEA-15的生物學活性的化合物的篩選工具 存在需要。還對于擁有用于治療病理學狀況例如癌癥和II型糖尿病的新型 化合物存在需要。還對于擁有用于病理學狀況的診斷和/或預后的工具存在需要，所 述病理學狀況牽涉PEA-15,尤其是其表達和甚至其生物學活性的改 變，所述病理學狀況例如為II型糖尿病，癌癥，特別是神經膠質瘤， 癌，或牽涉細胞凋亡或細胞增殖的過度或缺乏的病理學狀況。本發明的目的是滿足這些需要。本發明者出乎意外地觀察到下述通式(I)的化合物可以與PEA-15 相互作用并且調節其活性(I)其中n、 p、 r、 Ri、 R2、 R3、 114和A如下文中所定義的。因此，本發明者已觀察到，本發明的化合物，例如熒光化合物6D6-1 (在下文中詳細描述)，能夠以特異的方式與PEA-15蛋白相互作用并且調節其生物學活性。此外，本發明者還觀察到，可能將本發明的化合物特別是熒光化合物與熒光融合蛋白GFP-PEA-15 (綠色熒光蛋白)相組合地用于開發施行熒光共振能量轉移(FRET)的方法，所述方法允許例如篩選能夠與PEA-15相互作用的試劑以及診斷和/或預后牽涉PEA-15的病理學狀況。還可能將此類化合物(特別是熒光化合物)與融合蛋白GST-PEA 15 相組合地用于施行通過竟爭進行的篩選方法，所述篩選方法使得能夠 鑒定能夠與PEA 15相互作用的試劑。因此，根據本發明的主要方面之一，本發明涉及下式(I)的化合物其中-n可以等于0或1，- p可以表示l至6的整數，特別是2至4的整數，- r可以表示1至12的整數，特別是2至6的整數，特別地等于4，- Ri可以表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的d-"烷 基，飽和或不飽和的C廠d。環烷基，任選地用一個或多個卣素原子取 代的C6-d。芳基， 一個或多個d-C6烷氧基，或者一個或多個d-d。烷 基，- R2可以表示氨基酸或氨基酸衍生物的側鏈，—-COR3可以表示攜帶堿性實體R3的酰基，所述堿性實體R3特別 地選自具有下式的基團其中，*表示與酰基的共價鍵，Y可以表示N或N+R ，以及R6和R 可以相互獨立地表示氬原子，飽和或不飽和的、線性或支化的C廣C2。烷基，飽和或不飽和的C廣d。環烷基，任選地用一個或多個卣素原子 取代的C6-d。芳基， 一個或多個C廣Ce烷氧基，或者一個或多個C「C10 烷基，-IU可以表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的d-d。烷 基，飽和或不飽和的C廣C!。環烷基，任選地用一個或多個離素原子取 代的C廣d。芳基， 一個或多個d-C6烷氧基，或者一個或多個d-d。垸基，-A可以表示源自卩占噸殘基(特別是9-苯基卩占噸殘基)、吖啶殘 基(特別是9-苯基吖啶殘基)或4-硼-3a，4a-二氮雜引達省 (4-bora-3a， 4a-diaza indac6ne )殘基的基團， 以及其f汙生物。在本發明的范圍內，就給定的分子而言，"殘基"意指以基團形 式存在的分子。有利地，A可以表示熒光標記物。根據本發明的另一個方面，本發明涉及用于篩選能夠與PEA-15 蛋白或其類似物之一相互作用的試劑的方法，所述方法至少包括下列 步驟a)將至少一種攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白或其類似物之一與至少一種本發明的化合物特別是熒光化合物在適合于與所述蛋白相 互作用的條件下進行接觸，b) A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能量轉移的 熒光能量受體-給體對，c) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟a》中獲得的集合體(ensemble)所特征性的第一信號Sl5d) 將步驟a)中獲得的集合體與據推測包含至少一種待篩選的試 劑的介質在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸，e) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與S！相同的性質的第二信號 S2，f) 比較第一信號S,和第二信號S2，以便就所述PEA-15蛋白與待 篩選的試劑的可能的相互作用作出結論。在本發明的范圍內，"PEA-15蛋白的類似物"意指呈現出與PEA-15 的序列同源性和相似的生物學活性的肽類型的化合物，以及可由編碼 該蛋白質的raRNA的選擇性剪接產生的變體(例如由Underhill等人(Mamm. Genome, 2001， 12: 172 )描述的)，以及具有結合本發明 的式的化合物的能力的該蛋白質或這些肽類型化合物的片段。"生物 學活性"意指PEA-15蛋白特別是先前指出的蛋白質的生物學性質。"序列的同源性"意指下列序列之間至少85°/。，特別地至少90% 和更特別地至少95%的的序列同一性類似物與PEA-15蛋白，特別是 PEA-15所特征性的序列(Renault等人，Biochem. Pharmacol. 2003， 66: 1581 )，即DED結構域，和特別是RxDLF保守序列，NES結構域(核輸出信號)，參與PEA-15蛋白與其不同的蛋白質伙伴(例如 ERK1/2、 Akt、 FADD、胱天蛋白酶8 )相互作用的肽序列，以及包含通 過蛋白激酶C (PKC)或II型依賴于鈣/鈣調蛋白的蛋白激酶進行的磷 酸化的位點的肽序列，即分別地LTRIPgAKK (S104)和DIRQP^EIIK(S116) (S:磷酸化的絲氨酸)基元。可導入至蛋白質中以獲得上面定義的類似物的修飾的種類和實施它們的方法屬于本領域技術人員的知識和常規實踐的范圍。根據本發明的另一個方面，本發明的目標為用于篩選能夠與PEA-15蛋白或其類似物之一相互作用的試劑的方法，所述方法至少包 括下列步驟(a) 將至少一種連接至支持物的PEA-15蛋白與本發明的化合物 在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸(b) 測量步驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號(c) 將步驟a)中獲得的集合體與待篩選的試劑在適合于與所述 蛋白相互作用的條件下進行接觸，(d) 測量步驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與St相同的性 質的第二信號S2，(e) 比較S,和S2，以便就所述PEA-15蛋白與待篩選的試劑的可 能的相互作用作出結論。根據本發明的另 一個方面，本發明涉及通過檢測和任選地通過定 量在采自個體的生物樣品中的PEA-15來診斷和/或預后可能牽涉 PEA-15的病理學狀況的方法，所述方法至少包括下列步驟(a) 將至少一種攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白或其類似物之一 與至少一種本發明的化合物特別是焚光化合物在適合于與所述蛋白相 互作用的條件下進行接觸，(b) A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能量轉移 的熒光能量受體-給體對，(c) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號(d) 將步驟a)中獲得的集合體與據推測包含至少一種PEA-15蛋 白的生物樣品在適合于本發明的所述化合物與生物樣品中的所述 PEA-15蛋白相互作用的條件下進行接觸，(e) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與Sj目同的性質的第二信號 S2，(f)比較S!和S"以便就在所述生物樣品中PEA-15蛋白的可能 存在作出結論，和任選地就所述蛋白質的量作出結論。根據本發明的另外一個方面，本發明還涉及分離的復合物，其包 含至少一種PEA-15蛋白和至少一種本發明的式的化合物。根據本發明的另外一個方面，本發明還涉及用于篩選能夠與 PEA-15蛋白或其類似物之一相互作用的試劑的試劑盒，所述試劑盒包含-至少一種攜帶熒光標記物D或純化標記物的PEA-15蛋白，和 —至少一種本發明的化合物，如果需要，A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能 量轉移的熒光能量受體-給體對。化合物本發明的化合物是下述通式(I)的化合物其中- n可以等于0或1，- p可以表示l至6的整數，特別是2至4的整數，- r可以表示1至12的整數，特別是2至6的整數，特別地等于4,-^可以表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的d-C2。烷 基，飽和或不飽和的C3-d。環烷基，用一個或多個卣素原子取代的C6-C10 芳基， 一個或多個d-Cs烷氧基，或者一個或多個d-d。烷基，-R2可以表示氨基酸或氨基酸衍生物的側鏈， --COR3可以表示攜帶堿性實體R3的酰基，所述堿性實體R3特別 地選自具有下式的基團<formula>formula see original document page 19</formula>
其中，*表示與酰基的共價鍵，Y可以表示N或N+-R7,以及L和R7可以相互獨立地表示氬原子，飽和或不飽和的、線性或支化的d-C2。烷基，飽和或不飽和的C廣d。環烷基，任選地用一個或多個卣素原子 取代的C廣d。芳基， 一個或多個C廣C6烷氧基，或者一個或多個d-do 烷基，—R4可以表示氬原子，飽和或不飽和的、線性或支化的d-d。烷 基，飽和或不飽和的C廣d。環烷基，任選地用一個或多個卣素原子取 代的"-d。芳基， 一個或多個C廣C6烷氧基，或者一個或多個C廣C!。烷基，- A可以表示源自卩占噸殘基(特別是9-苯基卩占噸殘基)、吖啶殘 基(特別是9-苯基吖啶殘基)或4-硼-3a,4a-二氮雜引達省 (4-bora-3a， 4a-diaza indacene)殘基的基團, 以及其衍生物。根據一個實施方案，A可表示熒光標記物。在本發明的范圍內，就給定的分子而言，"殘基"意指以基團形 式存在的分子。在本發明的范圍內，"衍生物，，意指互變異構體形式、立體異構 體形式、多晶型形式、藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的溶劑化物。在本發明的范圍內，"互變異構體形式"意指這樣的異構體之一， 所迷異構體的結構的差異在于原子(通常為氫原子)的位置以及一個 或多個重鍵的位置，并且其能夠容易且可逆地從一種形式轉變成另一 種形式。在本發明的范圍內，"立體異構體形式"意指組成(constitution) 相同且差異僅在于它們的原子在空間上的不同排列的分子的異構體。在本發明的范圍內，"藥學上可接受的鹽"意指通過通式(I)的化 合物與堿或酸的反應而獲得的化合物。作為適于本發明的堿的實例，可提及在溶劑例如THF(四氫呋喃)、 甲醇、叔丁醇、二喁烷、異丙醇、乙醇、其類似物和其混合物中的氫 氧化鈉、曱醇鈉、氫化鈉、叔丁醇鉀、氫氧化釣、氬氧化鎂和類似物 以及其》'昆合物。還可使用有機堿例如賴氨酸、精氨酸、二乙醇胺、膽堿、氨丁三 醇、胍及其衍生物。作為適于本發明的酸加成鹽的例子，可提及可通過通式(I)的化合 物與酸(例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、對甲基苯磺酸、甲 磺酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、水楊酸、羥基萘甲酸、抗壞血酸、棕 櫚酸、琥珀酸、苯甲酸、苯磺酸、酒石酸和類似物以及其混合物)在 溶劑(例如乙酸乙酯、醚、醇溶劑、丙酮、THF、 二p惡烷、其類似物和 其混合物)中的反應而制備的酸加成鹽。"多晶型形式，，意指在不同的條件(例如使用不同的通常用于結 晶的溶劑)下通過通式(I)的化合物的結晶而獲得的化合物。在不同 溫度下的結晶包括，例如，不同的冷卻模式，例如非常快至非常慢的 冷卻，包括化合物的加熱或熔化步驟，然后逐漸或快速冷卻。可借助 于通過NMR光鐠學、IR (紅外)光鐠學、DSC (差示掃描量熱法)、X-射線衍射或其他相似的技術進行的分析來確定多晶型形式的存在。在本發明的范圍內，"烷基"意指線性或支化的、飽和或不飽和的烴基(radical hydrocarbon",其具有1至20個碳原子，特別地 2至18個碳原子，特別地3至16個碳原子，特別地4至12個碳原子 和更特別地6至10個碳原子，并可用下文中定義的基團取代。作為實例，該定義包括諸如甲基、乙基、異丙基、正丁基、叔丁 基、叔丁基甲基、正丙基、戊基、正己基、2-乙基丁基、庚基、辛基、 壬基或癸基的基團。在本發明的范圍內，"環烷基"意指任選地支化的、飽和或不飽 和的、具有3至10個碳原子(特別地C廣Cs和更特別地a)的亞烷基 環，例如環丙基、環戊基、環己基、環己基甲基、環庚基。在本發明的范圍內，"芳基"意指芳族環，其包含1至3個任選 稠合的、具有6至20個碳原子特別地10至14個碳原子的芳族核，所 述芳族核任選地包含一個或多個選自0、N和S的雜原子，并且如果需 要，用上文和下文中定義的基團進行取代。作為適于實施本發明的芳基的實例，可提及苯基、爺基、苯乙基、 萘基、蒽基，和包含一個或多個選自0、 N和S的雜原子的所有芳香環， 例如p比咬、噻吩、吡咯、呋喃、喹啉、吖啶、咕噸、4-硼-3a，4a-二氮 雜引達省。在本發明的范圍內，"烷氧基"意指-OR基團，其中烷基殘基是 線性、支化或環狀的、稠合或非稠合的、飽和或不飽和的烴基，其具 有1至20個碳原子，特別地2至18個碳原子，特別地3至16個碳原 子，特別地4至12個碳原子和更特別地6至10個碳原子。作為實例，可提及甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、正丁氧基、 異丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、仲戊氧基、叔戊氧基、 己氧基、甲氧乙氧基、甲氧丙氧基、乙氧乙氧基、乙氧丙氧基和類似物。在本發明的范圍內，"酰基"意指線性、支化或環狀的、稠合或 非稠合的、飽和或不飽和的烴基，其包含C-0官能團和具有1至10 個碳原子，特別地2至8個碳原子和優選地3至6個碳原子以及更特 別地具有4個碳原子，例如曱酰基、乙酰基、琥珀酰基、苯甲酰基、1-萘甲酰基或2-萘甲酰基。如果需要，可用一個或多個例如選自0、 N和S的雜原子間斷上述 基團的烴鏈，從而形成例如雜烷基，例如烷基醚基團、烷基酯基團或 雜環。在本發明的范圍內，"雜環基"，例如但非限定性地意指呋喃基、 噻吩基、吡咯基、喁唑基、異嚙唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、 p比峻基、吹咱基、p比喃基、p比咬基、radical pyridadinyle、嘧咬基 或radical pyradinyle、吹喃基、會啉基。如果需要，上面定義的基團可用一個或多個卣素原子進行取代。在本發明的范圍內，"鹵素原子"意指F、 Cl、 Br或I的原子。 本發明中有利地使用的囟素原子是氟和氯。特別地，烷基卣化的基團(radicaux alkylhalog6n6s )可以是通 式CnF^的全氟烷基，其中n可以為l至10，特別地2至8和更特別 地3至6。根據一個實施方案，R!尤其可以表示氫原子、C廣ds烷基、C2-C16 烷基，例如任選地用一個或多個離素原子取代的C廣d。芳基。特別地，R,尤其可以表示氫原子、甲基、乙基、異丙基、正丙基、 千基、苯乙基或式"F^的全氟烷基，其中n可以為l至10,特別地 2至8和更特別地3至6。特別地，R,可以是甲基或節基。根據一個實施方案，R2可表示氨基酸或氨基酸衍生物的側鏈，所 述氨基酸或氨基酸衍生物選自丙氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甘氨酸、 色氨酸、p-丙氨酸、苯丙氨酸、4-氯-苯丙氨酸、哌啶-4-羧酸(acide isonip6cotinique) 、 4-氨基甲基苯曱酸、3-四氫異喹啉酸以及游離 的或千基化的組氨酸。所述氨基酸或氨基酸衍生物可以例如選自<formula>formula see original document page 23</formula>根據一個實施方案，R2可以是下式(VI)的化合物:<formula>formula see original document page 24</formula>其中一 *表示與通式(1)的化合物的殘基的共價鍵，和-Rs可以表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的C廣Cu烷 基，飽和或不飽和的Cr"d。環烷基，任選地用一個或多個卣素原子取 代的C6-d。芳基。根據一個實施方案，可塑造Rs基團的烷基或環烷基還可以用前面 定義的基團進行取代，或者甚至它們的烴鏈被一個或多個前面定義的 雜原子間斷。特別地，Rs可以表示氫原子、C「ds烷基、C廣C"烷基、任選地用 一個或多個囟素原子取代的C「d。芳基。特別地，Rs可以表示氫原子、甲基、乙基、異丙基、正丙基、芐 基、苯乙基、式aF^的全氟烷基，其中n可以為l至10，特別地2 至8和更特別地3至6。特別地，Rs可以是甲基或爺基。R2尤其可以是組氨酸或組氨酸衍生物例如芐基化的組氨酸。 根據一個實施方案，-COR3可以是用前面定義的堿性實體R3取代的酰基，特別是乙酰基。特別地，該堿性實體R3可以是下式(VII)的基團<formula>formula see original document page 24</formula>其中-*表示與酰基的鍵，- Y可以表示N或N+R7，和-Re和R7可以相互獨立地表示氫原子、C廣ds烷基、C廣C"烷基、任選地用一個或多個卣素原子取代的C6-d。芳基。特別地，116和R7可以相互獨立地表示氫原子、甲基、乙基、異丙 基、正丙基、千基、苯乙基、式aF^的全氟烷基，其中n可以為1 至10，特別地2至8和更特別地3至6。特別地，Re和R7可以相互獨立地是曱基或節基。 根據一個實施方案，基團A可以表示通式(Va)的基團<formula>formula see original document page 25</formula>其中-*表示與式(1)的化合物的殘基的共價鍵， - Z-O或NH,一 R8-R9 = N(R')2，其中R'可以表示C廣G烷基，特別地C廠C4烷基，或者Rs-0H和R9-0，一 Id。-Ru-H或X，其中X-F、 Cl、 Br，特別地X-F，-或者， 一方面Rs和R!。和/或另一方面IU和Rn可以分別形成5或6元雜環，其與吖啶或卩占噸殘基稠合，如果需要用1、 2、 3個或甚至更多個曱基取代，并且其中雜原子置于吖啶或咕噸殘基的ot位并選自N或0，-R12 = "NHS0廣或卜NHC0-，其中*表示與式(I)的化合物的殘基的共價鍵，-R13 = H， HS。3一或C00H。特別地，式(Va)的基團可以是例如R8-R9-NMe2或NEt2， 特別地，式(Va)的基團A可以是這樣的，即1112可以位于鄰位、間 位或對位。特別地，當R12 = *-NHS02-時，其可以有利地位于鄰位。 根據一個實施方案，A可以表示通式(Vb)的基團其中—*表示與式(1)的化合物的殘基的共價鍵， 一 R"可以表示C廣C4酰基，- R^可以表示C廣C7雜環基，尤其是噻吩基，和- R16 = R17 = X，其中X-F、 Cl或Br，尤其是F。 根據一個實施方案，式(Va)和(Vb)的基團可以是熒光標記物的基團。作為可適于實施本發明的熒光標記物的實例，可提及羅丹明及其 衍生物例如四甲基羅丹明、Red-X羅丹明(麗絲胺)、Bodipy及其衍 生物、Texas Red⑧及其衍生物、熒光素及其衍生物、Alexa⑧及其衍生 物以及Oregon Greei^及其衍生物。根據一個實施方案，基團A可以表示選自下式的熒光標記物的熒 光標記物Bodipy其中，*表示與根據本發明的式(1)的化合物殘基的共價鍵。根據一個實施方案，熒光標記物A可選自從羅丹明衍生的焚光標記物，例如磺酰基羅丹明B的衍生物。特別地，可將通式(I)的化合物的殘基在鄰位與磺酰基羅丹明(麗絲胺)的衍生物相結合。尤其是，所述從麗絲胺衍生的基團可由下式的基團表示麗絲胺其中，*表示與根據本發明的式(1)的化合物殘基的共價鍵。根據一個實施方案，本發明的化合物可以具有通式(I)，其中n 可以等于0。根據一個實施方案，本發明的化合物可以例如由下述通式(II)表示<formula>formula see original document page 28</formula>其中:-Ri、 R2、 R3、 R4、 A和p可以例如如前面所定義的。 根據一個實施方案，本發明的化合物可以具有通式(I)，其中n 可以等0, p可以等于4， ^可以表示甲基，R2可以表示下式的基團其中，*和Rs可以如前面所定義的， 體R3取代的酰基，尤其是乙酰基和-C0R3可以表示用下式的堿性實<formula>formula see original document page 29</formula>
其中，*表示與酰基的共價健，以及Y和Re可以如前面所定義的，和R4可以是氫原子。根據一個實施方案，本發明的化合物可以具有下述通式(III):
<formula>formula see original document page 29</formula>
其中，A、 R5、 Y和Re可以如前面所定義的。根據一個實施方案，本發明的化合物可以是前面定義的通式(III) 的化合物，其中熒光標記物A可以是例如前面定義的磺酰基羅丹明基 團，并且尤其是這樣的，即式(III)的化合物的該殘基位于磺酰基羅丹 明基團的鄰位，Rs可以是芐基，Y可以是N，以及K可以是甲基。有利地，本發明的化合物不是如此的前面定義的通式(I)的化合 物，其中熒光標記物A是這樣的磺酰基羅丹明基團(麗絲胺)，即式 (I)的化合物的殘基位于磺酰基羅丹明基團的對位。有利地，本發明的化合物不是如此的前面定義的通式(III)的化合 物，其中熒光標記物A是這樣的磺酰基羅丹明基團(麗絲胺)，即式(III) 的化合物的殘基位于磺酰基羅丹明基團的對位，以及R5是節基，Y是 N，和Rs是甲基。根據實施方案的變化形式，本發明的化合物可由下式(IV)表示(III)合成方法可以以各種不同的式的化合物的文庫的形式，或者以作為純的形 式或作為立體異構體的混合物而分離的化合物的形式，來獲得本發明 的化合物。可在REM型的聚苯乙烯樹脂(REgenerated Michael )上進行合成 方法，所述樹脂由通過Michael受體丙烯酸酯官能化的羥曱基聚苯乙 烯樹脂組成。REM型樹脂特別適于通過下述步驟來合成叔胺文庫進行胺的 Michael類型的初始加成以將胺固定至支持物，隨后在支持物上進行 分子的合成，并最后按照胺的季銨化過程將其從支持物上切離，然后 進4亍HOFMANN類型的消除。在將仲胺固定在固體支持物上后，可使用DIC/HOBt (1，3-二異丙 基碳二亞胺/l-羥基苯并三唑)激活，通過常規的肽偶聯方法引入其他 殘基。例如，可將磺基羅丹明類型(例如，麗絲胺)的基團A直接接枝 在胺官能團例如賴氨酸的s-NH2基團之上，或者接枝在通過氨基甲酸酯 鍵(liaison u"thane)而接在賴氨酸的s-冊2基團上的間隔物例如二 氨基丁烷間隔物之上。可在例如烷基卣如甲基碘或千基溴存在下進行仲胺的烷基化，隨 后在Amberlite IRA-95型離子交換堿性樹脂存在下進行處理之后，從樹脂上釋放化合物。根據一個實施方案，可在平板例如96孔平板上，通過使用 FLEXCHEM設備(Robbins Scientific)平行地進行本發明的這樣的合 成方法。根據一個實施方案，可按照在固體支持物上的制備方法獲得本發 明的化合物，所述方法至少包括下列步驟 a.將下式的化合物HN )~"NH——boc偶聯在下式的固體支持物上，<formula>formula see original document page 31</formula>從而獲得下式(l)的化合物:<formula>formula see original document page 31</formula>R,可以如上所定義的；b.使式(l)的化合物去保護，然后將所述去保護的化合物與下式 的化合物偶聯從而獲得下式(2)的化合物:oR2可以如上所定義的；c.使式(2)的化合物去保護，然后將所述去保護的化合物與下式 的化合物偶聯<formula>formula see original document page 32</formula>p可以如上所定義的；d.使式(3)的化合物脫去Fmoc保護基團，然后將所述去保護的化 合物與R3C00H化合物偶聯，從而獲得下式(4)的化合物oC0R3可以如上所定義的；e.使式(4)的化合物去保護，從而獲得下式(5)的化合物:f.任選地，使式(5)的化合物與對硝基苯基氯甲酸酯 (p-nitroph6nylchloroformate )反應，然后與下式的二胺反應，從而獲得下式(6)的化合物:r可以如上所定義的；g.使式(5)的化合物或式(6)的化合物與親電示蹤物，特別是與 A-C1反應，從而獲得下式(7)的化合物R2、 R3、 A、 n、 p和r如前面所定義的；h.用式R1X的化合物切割式(7)的化合物(Rl可以如上所定義的， 并且X可以表示卣素原子，尤其是I或Br)，從而獲得前面所定義的 式(I)的化合物。篩選和it斷方法本發明的目標還在于用于篩選能夠與PEA-15蛋白或其類似物之 一相互作用的試劑的方法，所述方法至少包括下列步驟(a) 將至少一種攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白或其類似物之一 與至少一種本發明的熒光化合物在適合于與所述蛋白相互作用的條件 下進行接觸，其中A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振 能量轉移的熒光能量受體-給體對，(b) 通過在使得能夠激發焚光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號S"(c) 將步驟a)中獲得的集合體與據推測包含至少一種待篩選的 試劑的介質在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸，(d) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與S,相同的性質的第二信號 S2，(e) 比較第一信號Si和第二信號S2，以便就所述PEA-15蛋白與 待篩選的試劑的可能的相互作用作出結論。在本發明的范圍內，"A和D是這樣的，即它們確定了適于進行 熒光共振能量轉移的熒光能量受體-給體對"這一表述意指這樣的熒光標記物對，其中的一種熒光標記物(熒光能量給體)的發射光譜覆蓋 另一種熒光標記物(熒光能量受體)的激發光譜的全部或部分。特別地，給體的激發光i普不覆蓋受體的激發光譜，或只覆蓋其很小部分， 從而避免或減少假陽性的出現。根據一個實施方案，第一和第二信號可以是能量受體和/或給體的 熒光信號。在能夠與攜帶熒光能量給體的化合物相互作用的、攜帶熒光能量 受體的化合物存在的情況下，在熒光能量給體的激發光譜的波長處對 集合體進行輻照可產生熒光共振能量轉移(FRET)。在本發明的范圍內，"熒光能量的轉移"意指依賴于距離的物理 過程，通過該物理過程，能量通過偶極-偶極相互作用以非輻射的方式 從激發的生色團(熒光能量給體)傳輸至另一個生色團(熒光能量受 體)。這樣的轉移的表現可通過調制給體的熒光信號和/或受體的熒光 信號，例如通過減少熒光給體的熒光信號的振幅和/或通過增加受體的 熒光信號的振幅來檢測。給體的熒光信號的振幅變化可伴隨著受體的熒光信號的振幅變 化。備選地，熒光信號之一可在未能檢測到另一個熒光信號的變化的 情況下發生變化。為進行熒光能量的轉移而進行調整的條件和參數屬于本領域技術 人員的實踐的范圍，這可參考例如Sekar和Periasamy( J. Cell. Biol. 2003， 160: 629 )。根據一個實施方案，第一和第二信號的比較可允許檢測熒光信號 的振幅的調制(modulation)。在本發明的范圍內，"熒光信號的振幅的調制"，在熒光共振能 量轉移的情況下，意指給體熒光信號的振幅、激發光譜的振幅或前面 定義的給體發射信號的振幅的任何調制。這些熒光信號的調制可表明待篩選的試劑與攜帶熒光標記物D的 PEA-15蛋白的可能的相互作用。這樣的相互作用可引起攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白/本發明的化合物這種復合物的解離。根據一個實施方案，本發明的篩選方法可進一步包括下列步驟制備至少一個對照樣品，其中在前面定義的本發明方法的步驟c)中加入的所述介質不含待篩選的試劑。可以與用于篩選能夠與PEA-15相互作用的試劑的這種方法的實施同時或獨立地，按照本發明的方法來制備對照樣品。本發明的方法還可以包括下列步驟將從對照樣品測量的信號S3與信號Si和S;(如前面所定義的)進行比較，以獲得關于所述待篩選的試劑的信息。如此比較的信號之間的差異可提供關于待篩選的試劑在樣品中的 存在、量和/或與PEA-15的相互作用的信息。根據一個實施方案，PEA-15蛋白所攜帶的熒光標記物D可以以非 限定性的方式選自下列物質:蛋白質例如熒光蛋白；熒光標記物，其 例如選自熒光素衍生物、羅丹明衍生物、Alexa 532@衍生物、Bodipy 衍生物或Oregon Green⑧衍生物，條件是D和A為如上所定義的。根據一個實施方案，熒光蛋白可以以非窮盡的方式選自綠色熒光 蛋白或其熒光變體之一，例如黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)或紅色熒光蛋白(RFP),或DS紅或其變體之一。根據一個實施方案，攜帶熒光標記物的PEA-15蛋白可以尤其是融 合蛋白，例如GFP-PEA-15。可通過本領域^L術人員已知的任何分子生 物學技術，尤其是在"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, Laboratory Cold Spring Harbor, NY， 1989， 第2版中描述的技術，來獲得這樣的蛋白質。包含融合蛋白例如GFP-PEA-15的表達載體的構建和獲得屬于本 領域技術人員的知識和常規實踐的范圍。這些蛋白質的編碼序列例如 可在www.ncbi.nlm.nih.gov網站或ca.expasy.org網站上的數據庫 中獲得，也可以商購獲得。包含編碼GFP (或其變體之一 )或DS紅的核酸序列的表達載體可 商購獲得，尤其是從公司例如Invitrogen或Clontech商購獲得。此類載體的表達可在任何合適的宿主細胞中進行，并可通過本領 域技術人員已知的任何合適的方法進行融合蛋白的回收，或如果需要，進行該蛋白質的編碼性核酸例如mRNA或cDNA的回收。例如，KITSBERG等人(J. Neurosci.， 1999， 19: 8244 )已描述 了 GFP-PEA-15融合蛋白。根據一個實施方案，可以例如通過使用式(IV)的本發明化合物來 進行本發明的篩選方法。根據一個實施方案，攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白可以是 GFP-PEA-15融合蛋白。根據一個實施方案，可離體或在體外進行本發明的篩選方法。例如，可用采自實驗室動物(所述動物經遺傳改造，從而其細胞 以組織特異性或非組織特異性的方式表達GFP-PEA-15融合蛋白)的組 織來離體進行所使用的本發明方法。可以在體外，尤其是用完整的細胞在細胞內，或者在細胞外例如 在細胞裂解物中或在分離了目的成分例如GFP-PEA-15融合蛋白之后， 進行本發明的方法。可在借助于表達載體(如前面所定義的)轉染原代細胞或細胞系 之后，或者通過培養采自實驗室動物(所述動物經遺傳改造，從而表 達如上定義的構建體)的細胞，或者通過例如借助于微量移液器或本 領域技術人員已知的任何其他工具輸注原代細胞或細胞系、本發明的 融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸序列，來在表達本發明的融合蛋白 的細胞中細胞內地進行本發明的篩選方法。根據本發明的另一個方面，本發明涉及用于篩選能夠與PEA-15 蛋白或其類似物之一相互作用的試劑的方法，所述方法至少包括下列 步驟(a) 將至少一種連接至支持物的PEA-15蛋白與本發明的化合物 在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸(b) 測量步驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號S:，(c) 將步驟a)中獲得的集合體與待篩選的試劑在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸，(d) 測量步驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與Si相同的性 質的第二信號S2，(e) 比較Si和S2,以便就所述PEA-15蛋白與待篩選的試劑的可 能的相互作用作出結論。根據一個實施方案，可借助于稱為"純化標記物"的標記物將 PEA-15蛋白結合至支持物。在本發明的范圍內，"純化標記"意指可用于將PEA-15蛋白與支 持物相結合的任何結構。以非限定性的方式，純化標記物可以是例如FLAG標簽、多組氨酸 標簽或GST蛋白(谷胱甘肽S轉移酶)。與前面定義的純化標記物結合的PEA-15蛋白可以是通過本領域 技術人員已知的任何分子生物學方法，尤其是上面指出的方法，而獲 得的融合蛋白。例如，可按照由Kitsberg等人(J. Neurosci， 1999， 19: 8244 ) 描述的方案來獲得GST-PEA-15融合蛋白。根據所考慮的純化標記物，適于實施本發明的支持物例如且以非 窮盡的方式可以是Sepharose小珠或用谷胱甘肽包被的細胞培養板 (例如由SIGMA (ref. P3233 )銷售的96孔平板)的表面、鎳柱、與 G蛋白或A蛋白柱結合或者與Sepharose小珠的表面結合或者與細胞 培養板的小孔的底部結合的抗FLAG抗體。此外，為了進行本發明的方法，可將PEA-15蛋白與傳感器芯片 (sensor ship)的表面結合，以便按照本領域技術人員已知的方法在 通過表面等離子體共振進行的信號檢測方法中實施。根據一個實施方案，本發明的化合物可以是發熒光的，并且第一 信號Si和第二信號S2可以是熒光信號。可通過本領域技術人員已知的分光熒光法或熒光成像的任何方法 獲得這些信號的測量。根據本領域技術人員已知的不同的因素，例如 且非窮盡地，熒光標記物A的類別、PEA-15蛋白所位于其上的支持物，來調整焚光的激發條件和發射的記錄條件。可通過兩個信號S!和S2之間的熒光強度的差異來檢測PEA-15蛋 白與待篩選的試劑的可能相互作用，該相互作用引起預先結合的本發 明化合物的置換。根據另一個實施方案，第一信號Si和第二信號S2可以是按照本領域技術人員已知的方案，例如借助于Biacore③型裝置，通過表面等離子體共振而獲得的信號。這些信號不依賴于本發明的化合物的焚光類型或非熒光類型。 因此，在前述方法的這種實施中，本發明的化合物可以不是發熒光的。可將PEA-15蛋白固定在前面描述的傳感器芯片上。 可將本發明的化合物與固定在傳感器芯片上的所述蛋白質相接 觸。可通過表面等離子體共振來檢測該化合物與該蛋白質之間的相互 作用。可通過表面等離子體共振來檢測PEA-15蛋白與待篩選的試劑的 可能相互作用，所述相互作用引起預先結合的本發明化合物的置換。根據另一個實施方案，本發明的目標在于通過檢測和任選地定量 在至少 一種據推測包含PEA-15蛋白的生物樣品中的PEA-15蛋白來診 斷和/或預后可能牽涉PEA-15的病理學狀況的方法，所述方法至少包 括下列步驟(a) 將至少一種攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白或其類似物之一 與至少一種本發明的熒光化合物在適合于與所述蛋白相互作用的條件 下進行接觸，(b) A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能量轉移 的熒光能量受體-給體對，(c) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號S1}(d) 將步驟a)中獲得的集合體與據推測包含至少一種PEA-15蛋 白的生物樣品在適合于本發明的所述化合物與生物樣品中的所述 PEA-15蛋白相互作用的條件下進行接觸，(e) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量 步驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與Sj目同的性質的第二信號S2，(f) 比較S:和S2，以便就在所述生物樣品中PEA-15蛋白的可能 存在作出結論，和任選地就所述蛋白質的量作出結論。第一和第二信號的比較可以允許檢測熒光信號的振幅的調制。這 樣的調制可以提供關于可能存在于樣品中的PEA-15蛋白的存在和任 選地其量的信息。任選地與從包含已知量的該蛋白質的對照樣品中或者從健康生物 樣品中獲得的參照值相比較，任選地平行地與前面的測量相比較， PEA-15蛋白的存在和任選地其量的測定，可以提供關于尤其牽涉 PEA-15的病理學狀況和/或該病理學狀況的發展的信息。作為可用本發明的方法進行診斷和/或預測的病理學狀況的實例， 可提及癌癥，尤其是神經膠質瘤、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、黑素瘤， 以及還有II型糖尿病。可從生物組織或體液中獲得生物樣品。本發明的方法可包括下列步驟將從對照樣品中測量的信號S3與 前面定義的信號S,和S2進行比較，從而獲得關于PEA-15在生物樣品 中的存在和任選地其量的信息。根據一個實施方案，可將第一和第二信號與從一個或多個對照樣 品中檢測的一個或多個熒光信號進行比較。可通過實施本發明的方法 并且在步驟c)中用包含已知量的PEA-15蛋白的樣品代替生物樣品來 獲得此類對照樣品。可以與用于檢測和任選地定量在生物樣品中的PEA-15蛋白的本 發明方法的實施同時或獨立地，按照本發明的方法來制備對照樣品。根據一個實施方案，可以改變對照樣品中PEA-15的已知量或者攜 帶熒光標記物D的PEA-15蛋白和/或本發明的熒光化合物的量，以便 獲得標準系列。因而，可獲得熒光信號與前面定義的可變的量之一的相關性。因此，可建立FRET信號與已知量的攜帶熒光標記物D的PEA-15 蛋白、PEA-15蛋白的本發明熒光化合物的相關性。根據一個實施方案，攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白尤其可以是 前面所定義的那些。根據一個實施方案，攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白可以是 GFP-PEA-15類型的融合蛋白。根據一個實施方案，本發明的化合物可以是如前面所定義的，尤 其可以具有上面指定的式(IV)。可以考慮本發明的診斷方法的許多變化形式，并且如果需要，將其與本發明的篩選方法的特征相結合，因此，根據一個實施方案，本發明涉及根據上面對于篩選方法而 指出的原理(例如通過表面等離子體共振進行檢測)施行的用于診斷 和/或預后可能牽涉PEA-15的病理學狀況的方法，其中用生物樣品代 替待篩選的試劑。可能存在于這樣的樣品中的PEA-15將能夠與本發明的化合物結 合，并因而改變所記錄的信號。用于篩選或診斷的試劑盒本發明的目標還在于用于篩選能夠與PEA-15蛋白或其類似物之 一相互作用的試劑或者用于診斷和/或預后可能牽涉PEA-15的病理學 狀況的試劑盒，所述試劑盒包含-至少一種攜帶熒光標記物D或純化標記物的PEA-15蛋白，和-至少一種本發明的化合物，如果需要，A和D是這樣的，即它們可以確定適于進行熒光共振 能量轉移的熒光能量受體-給體對。根據一個實施方案，攜帶熒光標記物D或純化標記物的PEA-15 蛋白可以是如前面所定義的。根據一個實施方案，當本發明的試劑盒更特別地用于診斷和/或預 后病理學狀況時，其還可以包含至少一種未標記的PEA-15蛋白。根據一個實施方案，由PEA-15蛋白與熒光蛋白形成的融合蛋白或 未標記的PEA-15蛋白可以以編碼所述蛋白質的核酸序列(例如cDNA、 mRNA或表達載體)的形式存在于本發明的試劑盒中。藥物組合物根據一個實施方案，本發明的目標還在于用作藥物組合物中的活 性劑的本發明的化合物。在本發明的范圍內，"藥物組合物"是指以對于人或動物的疾病 具有治療或預防性質的形式提供的組合物或物質，以及用于建立病理 學狀況或非病理學狀況的診斷和/或預后或者恢復、修正或改變個體的 器官功能的物質或組合物。可以在體外或離體地進行可通過本發明的藥物組合物來施行的診 斷和/或預后方法。本發明的藥物組合物可包含通式(I)的本發明的化合物或其衍生 物之一，例如互變異構體形式、立體異構形式、多晶型形式、藥學上 可接受的鹽或藥學上可接受的溶劑化物，以及在藥學中通常使用的歉 體、稀釋劑或賦形劑。可以以在該領域中通常使用的蓋侖氏形式例如片劑、膠嚢、粉劑、 糖漿劑、溶液、混懸劑提供本發明的藥物組合物。可以以適于通過其他途徑例如口力良、鼻、舌下、局部、眼、直腸 途徑等施用的蓋侖氏形式提供本發明的藥物組合物。還可以以適于通過胃腸外途徑(例如皮下、經皮、肌內、靜Ji^內、 動脈內、心內途徑等)施用的無菌形式提供本發明的美容組合物。還可以以凍干的形式提供本發明的藥物組合物，使用時將其與無 菌或非滅菌的水溶液相混合。特別地，如果本發明的組合物用于胃腸外施用，則水溶液可以是無菌的o例如根據施用途徑、待治療的個體的類型以及待治療的病理學狀 況的種類來調整藥物組合物中存在的本發明化合物的量。根據這些參數的量和劑量的調整對于本領域技術人員來說是已知的。本發明的組合物通常包含足夠量的本發明的化合物。 "足夠量，，意指對于獲得所尋求的效應所必需的量。在本發明的范圍內，這樣的效應可以例如是由據推測患有病理學狀況例如癌癥或II型糖尿病的個體所表現的癥狀的減輕或治療。癌癥可以例如為神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌或黑素瘤。 根據本發明的另 一個方面，本發明的目標在于本發明的化合物在制備用于治療牽涉PEA-15的病理學狀況的藥物組合物中的用途。PEA-15蛋白可以通過其表達的改變，即例如過表達或表達的缺 乏，或者通過其生物學活性的改變而被牽涉，所述生物學活性的改變 例如表現為其活性的增加或其活性的減少，并且可能是PEA-15蛋白序 列中的突變(例如置換、插入或缺失)的結果或者是由于調節PEA-15 蛋白的生物學活性和/或表達的細胞信號的改變而引起的。關于可能牽涉PEA-15的病理學狀況，術語"治療"意指疾病的嚴 重度的減輕，例如癥狀的減輕或這些癥狀的預防。因此，在該最后的情況下，可在病理學狀況形成之前施用本發明 的化合物。本發明所考慮的病理學狀況可以尤其是前面定義的那些，例如癌 癥，尤其是神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤以及還有II 型糖尿病。在本發明的范圍內，"個體"意指人，非人靈長類動物以及實驗 室動物例如嚙齒類動物(例如小鼠、在鼠、豚鼠或倉鼠)，農場動物， 特別是在經濟上有益的動物例如家禽、牛、綿羊、豬、山羊和魚，特 別是生產適于人消費的產品例如肉、蛋和奶的動物。該術語還指家畜 例如貓和狗。本發明的目標還在于前面定義的藥物組合物。根據一個實施方案，本發明的目標還在于分離的復合物，其包含 至少 一種攜帶焚光標記物D或純化標記物的PEA-15蛋白和至少 一種本發明的式的化合物，其中A和D是這樣的，即它們可以確定適于進行 熒光共振能量轉移的熒光能量受體-給體對。根據實施方案的一個變化形式，本發明的復合物可以包含 GFP-PEA-15融合蛋白作為攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白，以及包 含前面定義的式(IV)的化合物作為本發明的式的化合物。可由本領域技術人員考慮上面公開的本發明的許多修飾而不背離 本發明的范圍。本申請包括此類修飾。通過下列實施例來舉例說明本發明，所述實施例不應當解釋為限 定了本發明的范圍。


圖1:顯示了在用50 pM 6D6-1處理之前和之后通過共聚焦成像 獲得的ERK和PEA-15蛋白的細胞內化合物定位。使用6D6-1化合物處 理細胞表現為ERK蛋白在細胞核中的重新定位，然而PEA-15蛋白仍保 持在細月包質中。標度尺相應于40圖2:顯示了在1和5 pM6D6-l存在下溫育的、攜帶GST-PEA-15 融合蛋白的、用谷胱甘肽包被的Sepharose小珠的平均熒光強度。實施例實滋辦J(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯的合成在反應器中，使REM樹脂(REgenerated Michael,聚苯乙烯樹 脂)(5 g， 4 mmol， 0. 8 mmol. g. mo1—1的理論負荷)在最低量的二甲 基曱酰胺(DMF)中膨脹。將在DMF (50 ml)中的三丁氧基羰基氨基 哌啶(8 g， 40 mmol)的溶液加熱至80'C，然后將其加至懸浮的樹脂 中。在80'C下攪拌混合物16小時，然后過濾，并按照DMF、 CH2C12、 MeOH順序洗滌三次。在Supelco注射器中，將樹脂(2. 3 g， 1. 5 mmol ) 在20 mL DMF中進行膨脹，并加入曱基硪(3, 81 mL， 61 mmol )。通 過旋轉攪拌混合物24小時，過濾樹脂，用3個系列的DMF/DCM進行洗 滌。在相同的條件下，重復進行使用甲基碘的烷基化的第二步驟。在 具有40 mL DCM的球形瓶中和在IRA-95樹脂(3. 16 g， 1. 5 mmol ) 存在下，切割樹脂上的哌啶。在用磁力棒攪拌24小時后，過濾樹脂， 用DCM/MeOH洗滌。收集濾液，并在減壓下干燥。通過在硅膠上的快速 色譜法(DCM/MeOH: 9/1)進行的純化產生以白色粉末形式存在的(1-甲基-哌啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯。產率=100%;力NMR (CDC13， 200 MHz): 4.43 (m， IH)， 2.77 (m， 2H)， 2.26 (s， 3H)， 2.13-1.87 (m, 4H) ， 1.53-1.46 (m， 2H) ， 1.42 (s， 9H). 13C NMR (CDC13， 50 MHz) 155.60， 110.00， 54.86， 46.47， 32.90， 28.80。l-甲基-哌啶-4-His(Bzl)-NHBoc的合成在環境溫度和磁力攪拌下，用TFA/DCM ( 1 mL/1 mL )溶液處理(l-甲基-哌啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯(0.07 g， 0.34 mmol) 90分鐘。 然后在減壓下蒸發千燥溶液，并將獲得的產物真空干燥18小時。將去保護的N-甲基哌咬溶解在lmL,中，并相繼加入Boc-His(Bzl)-OH (0. 12 g， 0. 32 mmol )、六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯烷基餺 [PyBop] (0.17 g， 0.32 mmol )和二異丙基乙基胺[DIEA〗(0.27 mL， 1.6 mmol)。在環境溫度下磁力攪拌3小時后，蒸發干燥反應體系， 然后用HPLC純化，并在冷干后產生半透明的油。產率=100%; tr-15.74分鐘；X- 220 nm;梯度t = 0分鐘0% 的溶劑B，至t-5分鐘0%的溶劑B，至t-35分鐘100°/。的溶劑B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H):根據[C"H35N503+H]的計算值為442;測定值 為442。Fmoc-Lys (^-麗絲胺)-OH的合成在環境溫度和磁力攪拌下，用TFA/DCM ( 5mL/5mL )溶液處理 Fmoc-lys(Boc)-OH (0.57 g， 1. 23 mmol ) 2小時。然后在減壓下蒸發 干燥溶液，并使所獲得的產物真空千燥18小時。然后，將Fmoc-lys-OH 溶解在17 mL DCM中，隨后加入三乙胺[TEA] (1.38 mL， 9.84 mmol )以將pH調節至大約8-9，從而觀察到凝膠的形成，該凝膠當于ox:下在30分鐘內添加麗絲胺(0. 78 g， 1. 35 mmol)時消失。回到環境溫 度，將反應體系在磁力攪拌下放置5小時。然后，用50 mL DCM稀釋 反應混合物，用10% HC1 (10 mL)洗滌兩次，隨后用硫酸鈉干燥有機 相，蒸發干燥。在硅膠(二氯甲烷/甲醇/乙酸94/5/1)上獲得兩種 位置異構體的純化和分離，從而產生兩種紫羅蘭色粉末。產率40%的對位異構體和5%的鄰位異構體。MS (ESI-TOF) m/z(M+H):根據[C"H5晶0^2+H]的計算值為909;測定值為909。 l-曱基-旅咬-4-His (Bzl)-Lys (c^麗絲胺)-NHFmoc的合成在環境溫度和磁力攪拌下，用TFA/DCM ( 1 mL/1 mL )溶液處理l-甲基-哌咬-4-His(Bzl)-NHBoc (0.03 g， 0.08 mmol) 90分鐘。然后 在減壓下蒸發干燥溶液，并將產物真空干燥18小時。將如此獲得的胺 溶解在0. 5 mL DMF中，并相繼力口入Fmoc—Lys (O"麗絲胺)一0H ( 0. 06 g， 0. 07睡l )、 PyBop( 0. 03 g， 0. 07 mmol )和TEA( 0. 01 mL， 0. 07mmo1)。 在環境溫度下磁力攪拌4小時后，蒸發干燥反應體系，然后用HPLC 純化，并在冷干后產生紫羅蘭色粉末。產率=15%; tr-18. 97分鐘；X- 220 nm;梯度t = 0分鐘5% 的溶劑B，至t-30分鐘100%的溶劑B。 MS (ESI-TOF) m/z (M+H): 根據[(Ul77N^。S2+H]的計算值為1232;測定值為1232。1-甲基-哌啶-4-His (Bzl) -Lys (0~麗絲胺)-l-甲基-lH-咪唑-4-基)-乙酰胺的合成<formula>formula see original document page 47</formula>在第一步驟中，在環境溫度下用在0. 5 mL DMF中的0. 12 mL哌啶 處理l-曱基-哌咬-4-His(Bzl)-Lys(0"麗絲胺)-NHFmoc (0.01 mg， 0.01 mmol) 1小時。然后，將溶液直接注射至半制備型HPLC上，并 導致獲得在末端胺上去保護的產物，產率為40%。在最后一個偶聯步 驟中，在0. 3 mL DMSO中，在PyBop ( 0. 003 g， 0. 007 mmol )和DIEA (0, 005 mL， 0. 033 mmol )存在下，將如此獲得的胺(0. 004 g， 0. 004 mmol )與l-曱基-4-咪唑乙酸鹽酸化物(0. 001 g， 0. 007 mmol )連接 在一起。在環境溫度下攪拌90分鐘后，將溶液直接注射至半制備型 HPLC上，并在冷干后產生紫羅蘭色粉末。產率30%; tr-17.70分鐘；X = 220 nm;梯度t = 0分鐘5%的 溶劑B，至t = 35分鐘:100°/。的溶劑B。 MS (ESI-TOF) m/z (M+H): 根據[C5j^NnO,S+H]的計算值為1132;測定值為1132。遽《尸i^r檢刺7 "-f,尸如FORMSTECHER等人(Dev. Cell., 2001， 1:239 )所描述的， 通過用pEGFP-PEA-15質粒(根據KITSBERG等人(J. Neurosci., 1999， 19: 8244 )的描述而獲得的)轉染NIH3T3細胞而獲得表達GFP-PEA-15的細胞系3T3 ( 3T3-GFP-PEA-15細胞)。選擇抗新霉素(G418)的克隆，并且將基培養在補充有10°/。胎牛 血清、2raM谷氨酰胺、青霉素(5 IU/ml )和鏈霉素(5 g/ml )的DMEM 培養基(Roche)中。通過測量活細胞的熒光和使用抗-GFP抗體(Roche,目錄號 1, 814, 460，獲自小鼠的兩種單克隆抗體(克隆7.1和克隆13.1)的 混合物)和抗-PEA-15抗體(兔多克隆抗體，Sharif等人，Neuroscience 126: 263， 2004 )經WESTERN轉移進行分析來檢查GFP-PEA-15蛋白 的表達。然后，在經歷熒光共振能量轉移(FRET)之前，將3T3-GFP-PEA-15 細胞在包含青霉素(10 000 U/ml) /鏈霉素(10 000 pg/ml ) 、 7%胎 牛血清(BIOWHITTAKER)的HAM-F12培養基中培養至匯合。在以10倍于終濃度的濃度于PBS中使用之前，對以大約20 mM 的濃度溶解在DMSO中的6D6-1化合物的儲液進行稀釋。于10一 M和l(T5 M檢測6D6-1化合物。在加入6D6-1化合物后，在讀取熒光之前，輕輕地攪動(100rpm) 細胞60分鐘，以使得化合物能夠擴散和進入細胞中。 在465 nm的激發波長處對細胞進行輻照。 在465 nm處激發的GFP蛋白在"5 nm處發射熒光信號。 6D6-1化合物與GFP-PEA-15蛋白的結合使得能夠進行熒光共振能 量轉移(FRET),從而導致在590 nm處發射熒光信號。f/^-J ^合教考于五A/時定在^教詢如ARAUJO等人(J. Biol. Chem., 1993， 268: 5911 )所描述的， 從小鼠胚胎U6天)的皮層和紋狀體制備原代星形膠質細胞培養物。將原代星形膠質細胞培養物在血清不存在下以及在已知誘導ERK 主要在細胞質中定位的條件下維持24小時。然后，用50 pM 6D6-1化合物處理或不處理細胞2小時15分鐘。 在用熒光抗體標記細胞后，使用共聚焦顯微鏡觀察ERK和PEA-15 的亞細胞定位。用PBS (Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水，不含CaCl2和MgCl2， Sigma) 洗滌細胞兩次，用4。/。的在PBS (pH 7.5)中的多聚曱醛固定15分鐘， 然后在環境溫度下用包含0. 1 M甘氨酸的PBS洗滌兩次。然后，將細胞在包含O. 2% Triton X-100的PBS中溫育5分鐘。在環境溫度下，用包含10%正常山羊血清(NGS)的PBS封閉非特 異性位點1小時。然后，在4C下將細胞與PEA-15的特異性抗體(兔多克隆抗體， Sharif等人，Neuroscience， 2004 )或ERK的特異性抗體(兔多克隆 抗體，Santa Cruz K-23 (ref. Sc-94)) —起溫育過夜，在包含1.5% NGS的PBS中進行稀釋。在PBS中進行3次洗滌后，將細胞在環境溫度下與用Alexa-488 (Molecular Probes)標記的抗-兔抗體一起溫育1小時。按照廠商(H0ECHST)的說明書，用T0PR(T的碘化物標記細胞核。將薄片置于在F副畫OUNT培養基(Southern Biotechnology) 中的載玻片上，并使用具有合適的濾光片的共聚焦顯微鏡(TCS SP2， LEICA)進行檢查。關于共聚焦分析，激發波長對于Alexa 488為488 nm，和對于TOPRO 為633 nm，發射波長對于Alexa-488為510-525 nm，和對于T0PR0 為647 nm。使用50 j^M 6D6-l化合物處理星形膠質細胞導致ERK在細胞核中 的重新定位，然而PEA-15仍然在細胞質中(圖1)。""/ UJ f絲i輛按照Kitsberg等人(J. Neurosci， 1999， 19: 8244 )描述的方案獲得GST-PEA-15融合蛋白。在裂解細菌后回收GST-PEA-15融合蛋白，并將其在用谷胱甘肽包 被的Sepharose小珠存在下進行溫育。在20 mM Tris-HCi， pH 7. 4; 100 mM NaCl; ImMMgCh; 1% Triton X-100緩沖液中，在1或5 6D6-1存在下，溫育如此獲得的小珠。在一系列的三次洗滌后，在纖維素膜上千燥小珠，并借助于磷光 成像儀(phospholmager ) (Biorad)，通過測量經在543 nm處激發 而引起的麗絲胺的熒光和測量在590 nm處的發射來定量熒光。結果是3個獨立實驗的平均值。結果表明熒光的平均強度依賴于化合物的濃度，并因而暗示了 6D6-1化合物和PEA-15蛋白之間的特異的相互作用。
權利要求
1.下述通式(I)的化合物其中-n等于0或1，-p表示1至6的整數，特別是2至4的整數，-r表示1至12的整數，特別是2至6的整數，特別地等于4，-R1表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的C1-C20烷基，飽和或不飽和的C3-C10環烷基，任選地用一個或多個鹵素原子取代的C6-C10芳基，一個或多個C1-C6烷氧基，或者一個或多個C1-C10烷基，-R2表示氨基酸或氨基酸衍生物的側鏈，--COR3表示攜帶堿性實體R3的酰基，所述堿性實體R3特別地選自具有下式的基團其中，*表示與酰基的共價鍵，Y表示N或N+R7，以及R6和R7相互獨立地表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的C1-C20烷基，飽和或不飽和的C3-C10環烷基，任選地用一個或多個鹵素原子取代的C6-C10芳基，一個或多個C1-C6烷氧基，或者一個或多個C1-C10烷基，-R4可以表示氫原子，飽和或不飽和的、線性或支化的C1-C10烷基，飽和或不飽和的C3-C10環烷基，任選地用一個或多個鹵素原子取代的C6-C10芳基，一個或多個C1-C6烷氧基，或者一個或多個C1-C10烷基，-A表示源自呫噸殘基、吖啶殘基或4-硼-3a，4a-二氮雜引達省殘基的基團，以及其衍生物。
2. 權利要求l的化合物，其中A表示熒光標記物。
3. 權利要求1或2的化合物，其中R!表示氫原子、d-d8烷基、C2-d6烷基、任選地用一個或多個卣素原子取代的C「d。芳基。
4. 權利要求1至3中任一項的化合物，其中^表示甲基、乙基、 異丙基、正丙基、千基、苯乙基或式CnF^的全氟烷基，其中n可以為 1至10。
5. 權利要求1至4中任一項的化合物，其中R2表示氨基酸或氨基 酸衍生物的側鏈，所述氨基酸或氨基酸衍生物選自丙氨酸、谷氨酰胺、 亮氨酸、甘氨酸、色氨酸、P-丙氨酸、苯丙氨酸、4-氯-苯丙氨酸、哌 啶-4-羧酸、4-氨基甲基苯甲酸、3-四氫異喹啉酸以及游離的或芐基化 的組氨酸。
6. 權利要求1至4中任一項的化合物，其中R2是下式(VI)的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>-*表示與通式(1)的化合物的殘基的共價鍵，和一 Rs表示飽和或不飽和的、線性或支化的d-C2。烷基，飽和或不飽 和的Cfd。環烷基，任選地用一個或多個卣素原子取代的。-d。芳基。
7. 前一個權利要求的化合物，其中Rs表示甲基、乙基、異丙基、 正丙基、芐基、苯乙基、式aF^的全氟烷基，其中n可以為l至10。
8. 前述權利要求中任一項的化合物，其中-C0R3是用下式(VII)的 堿性實體R3取代的酰基其中- *表示與酰基的鍵，- Y可以表示N或N+R"和-Re和R7相互獨立地表示氫原子、C廣d8烷基、C廣d6烷基、任選地用一個或多個卣素原子取代的C廣d。芳基。
9. 前一個權利要求的化合物，其中R6和R7相互獨立地表示氫原子、 曱基、乙基、異丙基、正丙基、芐基、苯乙基、式CnF^的全氟烷基， 其中n可以為1至10。
10. 前述權利要求中任一項的化合物，其中A表示通式(Va)的基團其中-*表示與式(1)的化合物的殘基的共價鍵， 一 Z二0或NH，-R8 = R9 = N(R02，其中R'表示C「C6，特別地C2-C,烷基，或者R8 =0H和R9 = 0，—Id。-Rn-H或X，其中X-F、 Cl、 Br，-或者， 一方面Rs和K。和/或另一方面R9和Ru分別形成5或6元 雜環，其與吖啶或站噸殘基稠合，如果需要用1、 2、 3個曱基取代，并 且其中雜原子置于吖啶或卩占噸殘基的ot位并選自N或O,—Ru-卜NHS0廣或卜NHC0-，其中*表示與式(I)的化合物的殘基的 共價鍵，- R13 = H， HS03—或C00H, 或者通式(Vb)的基團其中-*表示與式(1)的化合物的殘基的共價鍵，—L表示c2-。酰基，—R"表示c5-c,雜環基，和一 R16 = R17 = X,其中X-F、 Cl或Br。
11. 前一個權利要求的化合物，其中R"立于鄰位。
12. 權利要求2至11中任一項的化合物，其中基團A表示選自 Bodipy及其衍生物、羅丹明及其衍生物、Texas Re(^及其衍生物、熒 光素及其衍生物、Alexa⑧及其衍生物和Oregon Green⑧及其衍生物的熒 光標記物。
13. 前一個權利要求的化合物，其中熒光標記物A選自下式的熒光 標記物Bodipy其中，*表示與通式(1)的化合物的殘基的共價鍵。
14. 前述權利要求中任一項的化合物，其中n等于0。
15. 前一個權利要求的化合物，其由下列通式(II)表示:<formula>formula see original document page 6</formula>-R!、 R2、 R3、 R4、 A和p具有權利要求1至13中任一項之中的定義。
16.權利要求9的化合物，其由下列通式(III)表示其中，A、 R5、 Y和R6具有權利要求1、 2和6至13中任一項之中的 定義。
17.前一個權利要求的化合物，其由下式(IV)表示
18.用于篩選能夠與PEA-15蛋白或其類似物之一相互作用的試劑 的方法，所述方法至少包括下列步驟a) 將至少一種連接至支持物的PEA-15蛋白與權利要求1至17中 任一項的化合物在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸，b) 測量步驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號SMc) 將步驟a)中獲得的集合體與待篩選的試劑在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸，d) 測量步驟C)中獲得的集合體所特征性的、具有與S:相同的性質的第二信號s2，e) 比較S!和S2,以便就所述PEA-15蛋白與待篩選的試劑的可能的 相互作用作出結論。
19. 用于篩選能夠與PEA-15蛋白或其類似物之一相互作用的試劑 的方法，所述方法至少包括下列步驟a) 將至少一種攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白或其類似物之一與 至少一種權利要求2至17中任一項的化合物在適合于與所述蛋白相互 作用的條件下進行接觸，b) A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能量轉移的熒 光能量受體-給體對，c) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量步 驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號d) 將步驟a)中獲得的集合體與據推測包含至少一種待篩選的試劑的介質在適合于與所述蛋白相互作用的條件下進行接觸，e) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量步 驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與Si相同的性質的第二信號S2，0比較第一信號S,和第二信號S2，以便就所述PEA-15蛋白與待篩 選的試劑的可能的相互作用作出結論。
20. 前一個權利要求的方法，其中熒光標記物D選自下列物質蛋 白質例如熒光蛋白；選自熒光素衍生物、羅丹明衍生物、人16乂& 532@衍 生物、Bodipy^t生物或Oregon Greei^^f生物的熒光標記物。
21. 前一個權利要求的方法，其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白 或其熒光變體之一，例如黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP) 或紅色熒光蛋白(RFP)，或DS紅或其變體之一。
22. 權利要求20或21的方法，其中攜帶熒光標記物D的PEA-I5 蛋白是GFP-PEA-15融合蛋白。
23. 權利要求19至22中任一項的方法，其特征在于，在細胞內施行該方法。
24. 前一個權利要求的方法，其特征在于，在表達GFP-PEA-15融 合蛋白的細胞中施行該方法。
25. 通過檢測和任選地定量在至少一種據推測包含PEA-15蛋白的 生物樣品中的PEA-15蛋白來診斷和/或預后可能牽涉PEA-15的病理學 狀況的方法，所述方法至少包括下列步驟a) 將至少一種攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋白或其類似物之一與 至少一種權利要求2至17中任一項的化合物在適合于與所述蛋白相互 作用的條件下進行接觸，b) A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能量轉移的熒 光能量受體-給體對，c) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量步 驟a)中獲得的集合體所特征性的第一信號Snd) 將步驟a)中獲得的集合體與據推測包含至少一種PEA-15蛋白 的生物樣品在適合于本發明的所述化合物與生物樣品中的所述PEA-15 蛋白相互作用的條件下進行接觸，e) 通過在使得能夠激發熒光能量給體的波長處進行輻照來測量步 驟c)中獲得的集合體所特征性的、具有與S,相同的性質的第二信號S2，f) 比較S,和S2，以便就在所述生物樣品中PEA-15蛋白的可能存在 作出結論，和任選地就所述蛋白質的量作出結論。
26. 前一個權利要求的方法，其中攜帶熒光標記物D的PEA-15蛋 白具有權利要求20至22中任一項之中的定義。
27. 分離的復合物，其包含至少一種PEA-15蛋白和至少一種權利 要求1至17中任一項所定義的式的化合物。
28. 用于篩選能夠與PEA-15蛋白或其類似物之一相互作用的試劑 或者用于診斷和/或預后可能牽涉PEA-15的病理學狀況的試劑盒，所述 試劑盒包含—至少一種攜帶熒光標記物D或純化標記物的PEA-15蛋白，和 —至少一種權利要求1至17中任一項所定義的式的化合物，如果需要，A和D是這樣的，即它們確定了適于進行熒光共振能量轉移的熒光能量受體-給體對。
29. 權利要求1至17中任一項的化合物，所述化合物用作藥物組 合物中的活性劑。
30. 藥物組合物，其包含至少一種權利要求1至17中任一項的化 合物。
31. 權利要求1至17中任一項的化合物在制備用于治療牽涉PEA-15 的病理學狀況的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及能夠與PEA-15蛋白相互作用的、確定的式的新型假肽化合物，和涉及其在篩選方法中的用途，和涉及可能牽涉PEA-15的病理學狀況的診斷方法。
文檔編號C07K5/06GK101336248SQ200680052412
公開日2008年12月31日 申請日期2006年12月15日 優先權日2005年12月16日
發明者D·博內, F·雷諾-米哈拉, H·希內維斯, H·沙巴內, J·哈伊克, M·希伯特 申請人:國家健康醫學研究所