專利名稱：利用神經元樣本中重復性電活動的分析進行精神活性物質的體外檢測和表征的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測體外神經元組織樣本中的精神活性化合物的方法，其優選通過在將候補樣本引入體外神經元組織樣本中之前和之后檢測細胞外電壓的振蕩來實施，本發明也涉及實現該方法的裝置。對細胞外電壓參數的分析產生對候補樣本中存在精神活性物質的指示和有關它的藥理學活性和化合物的信息。此外，本發明包括在體外樣本中引發和維持重復性神經元活動存在的過程。另外，本發明包括通過在體外神經元組織樣本中引入刺激成分來刺激或引發重復性神經元活動、例如EEG的方法，其中所述刺激成分包括能促進或模仿乙酰膽堿、5-羥色胺或兒茶酚胺作用的化合物，例如卡巴膽堿。
背景技術：
將小型哺乳動物海馬中有節律的活動歸入三個頻帶進行描述4-10Hz(θ)，10-30Hz(β)，和30Hz(γ)以上(Traub等人，1998；1999一個近期討論)。迄今為止，其中研究最多的是θ，θ與其它情況中的運動活性(Vanderwolf，1969)和記憶編碼有關(Landfield等人，1972；Vertes and Kocsis，1997)。根據后一觀點，在θ與長期強化之間存在密切關系(Larson和Lynch，1986；Larson等人，1986；1993)，這可能是某種記憶形式的基質。近來較高頻率節律的功能關聯已成為值得關注的興趣主題。γ活性首先在嗅覺系統進行了分析(Freeman，1975早期評論)，其結論是，它使得氣味到來之前，在嗅球、梨形皮層和內嗅區皮層之間發生聯接(Kay和Freeman，1998)。在暗示表達過程中，在視覺皮層內也出現活動歸入γ范圍(Gray和Singer，1989)，其中建議使細胞與不同的接受域瞬時同步。依照該假說，同步作用使暗示的多個特征組合成相干表達(Singer，1998評論)。在討論高頻海馬活動時β節律通常不能與γ波區別開，盡管它們可以在海馬切片中被選擇性地誘導(Boddeke等人，1997)。在任何情況下，高頻同步對端腦皮層中的相關操作非常必要這一觀點的越來越多的證據強調確定造成β和γ振蕩的通路和神經遞質系統的重要性。
上行膽堿能投射作用提高了包括β和γ范圍內的那些內源性振蕩。盡管早期研究(Stumpf，1965)已經發現膽堿能阻斷劑和隔膜病變(septallesion)不會有明顯影響，但后來的研究顯示，自由運動的小鼠中快波會被膽堿酯酶抑制劑毒扁豆堿增強，并會被拮抗劑顯著降低(Leung，1985)。對海馬或內嗅區切片的膽堿能刺激通常描述為引發幾秒鐘長的θ樣活動的發作(Konopacki等人，1987；Mac Vicar和Tse，1989；Dickson和Alonso，1997；Williams和Kauer，1997)，但近期實驗表明它也可以在皮層和海馬切片中觸發高頻節律(20-40Hz)(Boddeke等人，1997；Fisahn等人，1998)。膽堿能海馬隔纖維使海馬系統的離散區域受神經支配(Lewis和Shute，1967；Mosko等人，1973；Frotscher和leranth，1985；Matthews等人，1987)，其中它們接觸到中間神經元的亞群體并選擇主細胞的樹突區(Mosko等人，1973；Lynch等人，1978；Matthew等人，1987)。毒蕈堿受體的刺激去極化錐體細胞，抑制從某些中間神經元的釋放，并提高其它方面的興奮性(Pitler和Alger，1992；Behrends和Bruggencate，1993)。體外和體內的組合結果產生以下建議在端腦皮層內，乙酰膽堿在產生高頻活動方面起重要作用。
膽堿能驅動的高頻節律如何影響皮層運轉取決于它們是否是區域性專有和它們是怎樣產生的。已經報道卡巴膽堿引發的振蕩是在內嗅區皮層(Dickson和Alonso，1997)和海馬(Fisahn等人，1998)內的有限位置產生的，但更為普遍的答案是需要在內嗅區海馬系統的寬闊區域上進行系統化的映射。本發明利用新近引入的裝置(Oka等人，1999)同時從64個位點進行記錄，以便為海馬皮層內膽堿能引發的高頻節律中的起源和區域變化尋址。
除這些信源的位置以外，我們還發現可以利用各種數學工具研究振蕩自身，以便確定精神活性物質的存在，在至少某些情況下可以識別并表示精神活性物質的藥理學活性或成分的特性。
上面沒有一篇文件利用了體外樣本中發現的高頻振蕩來表示精神活性物質的存在、藥理學活性或成分的特性。
發明概述在此本發明的方法包括檢測體外神經元組織樣本中精神活性化合物的藥理學活性特征，以及確定其成分的方法。聯合的本發明的方法是，通過加入一種成分在不同的刺激引發和刺激重復性神經活動的方法，所述成分能刺激細胞外電壓的振蕩、或利用神經元組織的共植點、或利用電刺激模式刺激神經元樣本。
通常，檢測體外神經元組織樣本中精神活性化合物的優選方法包括引發、然后檢測組織樣本中存在的振蕩，并提供這些振蕩的基線值的步驟。完成這些檢測后，使體外樣本與精神活性化合物或幾種化合物的候補樣本接觸。然后在引入候補樣本的同時(或在這之后)測量振蕩，例如EEG波。然后處理兩組振蕩數據，分別產生兩組所謂的“計算值”。然后比較兩組計算值，使得可檢出并表達樣本中應當存在的一種或多種精神活性化合物的藥理學活性的特征，并確定其成分，表達其特性。
各種振蕩通常是在細胞外電壓中發現的振蕩。例如，它們可以是θ、β或γEEG波。
理想的是使用多電極盤(“MED”)，以便可以同時或先后對神經元樣本上大量不同活動或較少的活動位點進行采樣。利用MED可以測量并計算空間關系；既可以測量又可以計算神經的振蕩值。MED的多電極特性也可以測量和鑒定給定神經元樣本內的區域特異效果。
細胞外電壓振蕩的適當數學分析法包括對單個空間點處測得的振蕩進行快速傅立葉變換(FFT)，以便放大單點測量前后在振幅和頻率上的差別。
類似地，可對在一個陣列中獲得的作為時間函數的細胞外電壓振蕩序列進行電流信源密度(CSD)分析，以產生并描述體外神經元組織樣本內的電流流動特性曲線。
本發明的另一部分包括利用化學或解剖學成分以及電刺激模式，所述電刺激模式易于在體外神經元組織樣本內刺激或引起重復性神經元活動。這些成分可以是能模仿或促進乙酰膽堿、5-羥色胺或兒茶酚胺活動的化合物。它們可以是共沉積的神經元組織。它們可以是類膽堿能化合物。最理想的化合物是卡巴膽堿。也可以使用電刺激。
本發明包括各種檢測藥理學活性并表示其特性，以及確定精神活性待測化合物成分的方法。鑒別這些待測化合物的許多方法都包括在本發明的方法內。
附圖簡述附圖描述并解釋了本發明的原理。它們并不會以任何方式限制本發明的范圍。

圖1在描述測得的低分辯率圖象中描述了“混疊”現象。圖2描述了抗混疊的效果。圖3A和3B分別表示在8×8檢測器陣列上的海馬切片方位和一個電極上引出的突觸后反應。圖4顯示對由圖3A和3B中海馬切片的方位算出的誘發反應進行的連續二維電流信源密度分析。圖5A和5B表示利用公知解剖學結構計算的生理學現象排列。圖6A到6E表示海馬切片的顯微圖和海馬內卡巴膽堿引發的β波分布。圖7A-7C表示利用密集微電極陣列測得的海馬中卡巴膽堿引發的β波。圖8表示對圖7A所示海馬切片進行的卡巴膽堿引發活動的電流信源密度分析。圖9A和9B表示頂部樹突與基部樹突中復現的卡巴膽堿引發振蕩的關系。圖10表示電流信源密度在特定時間的計算演化。圖11表示海馬和皮層中兩個截然不同的卡巴膽堿引發節律。圖12表示對由區域CA3順行激活引發的β樣活動進行的二維電流信源密度分析。圖13表示苯并二氮雜類對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖14A-C表示地西泮對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖15A-C表示氟西泮對卡巴膽堿引發β波的影響。圖16A-C表示ampakine(CX614)對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖17A-C表示ampakine(CX691)對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖18A-C表示比枯枯靈堿對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖19A-C表示木防己苦毒素對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖20A-C表示CNQX對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖21A-C表示DNQX對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖22A-C表示NBQX對卡巴膽堿引發的β波的影響。圖23概括地描述了依照本發明的方法將某類精神活性物質添加到神經元組織前后的振蕩節律比較的預測性結果。
本發明的詳細描述本發明包括檢測或鑒定精神活性成分的方法，優選利用體外神經元組織樣本中細胞外電壓(或電位)的節律振蕩來實施。另外，本發明的方法包括利用下面將詳細描述的某類成分或電刺激技術刺激或誘發這些振蕩的方法。
在神經樣本的空間陣列上測量體外神經元組織中的細胞外電位是公知的。例如，可參見授予Sugihara等人的美國專利第5563067號和第5810725中出現的那些裝置的各種描述。測量裝置優選與本發明的方法一起使用的細胞電位測量電極陣列包括位于絕緣底板上的多個微電極，將微電極與微電極區域外的某些區域連接在一起的導電圖形，與導電圖形的末端連接的電觸頭，覆蓋導電圖形表面的絕緣薄膜，以及封閉包括絕緣薄膜表面上的微電極區域的側壁。參考電極的阻抗與測量電極的阻抗相比較低。它們可以設置在被側壁封閉的區域內的多個位置上，且通常距離微電極指定距離。另外電觸頭通常連接在每個參考電極導線的導電圖形和導電圖形的末端之間。參考電極導線的導電圖形的表面通常覆蓋一層絕緣薄膜。
通常，微電極位于矩形的矩陣排列中，例如所述矩形矩陣的側邊為0.8到2.2mm(在微電極間距為300μm的情況下)或0.8到3.3mm(在微電極間距為450μm的情況下)。四個參考電極設置在一側為5到15mm的矩形的四個角上。更為優選的是，64個微電極以8行和8列、中心間距約為100到450μm、優選為100到300μm的方式設置。
優選地，微電極和參考電極由鍍鎳層、鍍金層和氧化銦-錫(ITO)薄膜上的鉑黑層構成。
絕緣底板(例如玻璃底板)可以是近乎方形的。多個電觸頭可與導電圖形的末端連接，優選設置在絕緣底板的四個側面上。結果是，多個微電極和參考電極的導線圖形布局設計很簡單。因為電觸頭的間距可以做得相對較大，因此通過電觸頭與外部元件的電連接也很簡單。
微電極區域通常很小。當通過顯微鏡觀察樣本時，很難區分位置、豎方向和橫方向。理想的是，將索引微標記設置在微電極區域附近，以便允許通過顯微鏡從各個方向、軸和位置進行目視識別。
更為優選的是執行以下序列的事項，以確定與體外神經元樣本的解剖學關系相對的電極位置。在陣列上的體外神經元樣本上設置一個對照以使陣列覆蓋樣本的重要區域，對陣列上的對照樣本進行拍照，記錄對照樣本的反應，盡可能精確地將測試樣本放置在陣列上與對照樣本相同的相對位置，對陣列上的測試樣本進行拍照，記錄測試樣本的反應，比較對照照片和測試照片，比較對照反應和測試反應。
本領域技術人員可以理解的是，可選擇的方法是利用目標識別算法，其中目標是體外神經元樣本的整個解剖結構，比較目標識別算法數據，并比較對照反應和測試反應。
最優選的細胞電位測量裝置由帶有細胞電位測量電極的細胞放置單元、與電觸頭接觸的接觸部位、和用以通過上下夾持固定絕緣底板的電極支座組成。細胞電位測量電極可與細胞放置組件裝置電連接，以便能夠處理樣本產生和在每個這樣的微電極和參考電極之間測得的電壓或電位信號。細胞電位測量組件可包括被側壁包圍的區域，用以培養樣本神經元的細胞或組織。它也可以優選包括光學裝置，用以光學地放大和觀察被側壁包圍的區域內培養的細胞和組織。該細胞電位測量裝置優選進一步包括圖象存儲裝置，用以存儲通過光學裝置獲得的放大圖象。
通常也包括具有安裝了測量軟件的個人計算機，用以接收測得的細胞電位。為了進行測量，計算機和細胞放置裝置通常通過I/O電路板連接。I/O電路板包括A/D轉換器和D/A轉換器。A/D轉換器通常用于測量和轉換得到的電位；D/A轉換器用于在需要時向樣本提供刺激信號。
計算機內安裝的測量軟件可包括用于為給出刺激信號、形成刺激信號而設定條件的軟件和用于記錄所得的檢測信號的軟件。通過利用這樣的測量軟件，計算機可包括用于向細胞提供刺激信號的裝置和用于處理細胞檢測信號的裝置。計算機也可以控制任何光學觀察裝置(SIT攝像機和圖象存儲裝置)和細胞培養系統。
理想的是，可以實時顯示從細胞檢測得到的細胞外電位。另外，可根據愿望通過在細胞顯微圖象上進行疊置來顯示記錄的自發活動、電位、或誘發電位。可以選擇的是，軟件也可以包括圖象處理，例如特征識別、邊緣檢測、邊緣增強、算法能力。當測量電位時，通常可視地顯示出整個記錄波形與神經元樣本中的波形位置相關。
說到數據分析或處理，快速傅里葉變換(FFT)分析、相干分析、和相關分析也是理想的。在下面討論的變化中，電流信源密度分析(CSD)也是非常理想的。其它可用函數可包括利用波形鑒辨的單尖峰信號分離函數、瞬時輪廓顯示函數、和形態顯示函數。這些分析結果可通過覆蓋在圖象存儲裝置中存儲的神經元樣本的顯示的圖象上來顯示。
當從計算機發出刺激信號時，該刺激信號通過D/A轉換器和隔離器發送到細胞放置裝置。細胞放置裝置包括細胞電位測量電極，例如所述測量電極由玻璃底板上64個的微電極構成，所述微電極以矩陣形式排列，測量電極具有保持神經元樣本(例如細胞或組織部分)與微電極和它們的培養液接觸的封閉側壁。優選地，將發送到細胞放置裝置的刺激信號施加到64個微電極中的任意電極，然后施加給一個樣本或多個樣本。
每個微電極和參考電位(這是培養液所處的電位)之間產生的感應、誘發、或自發電位通過64個通道的高靈敏度放大器和A/D轉換器輸入計算機。放大器的放大因子例如約可以是80-100dB，其頻帶例如約為0.1到10KHz或到20Hz。然而，當利用低截止濾波器測量刺激信號誘發的電位時，頻帶優選為100Hz到40kHz或更多。
理想裝置可包括具有溫度控制器的細胞培養系統、培養液循環裝置和提供諸如空氣和二氧化碳混合氣體的進氣裝置。細胞培養系統可由商用微型培養箱、溫度控制器和CO2氣瓶組成。微型培養箱可借助于Peltier元件將溫度控制在0到50度范圍內，并適用于3.0毫升/分或更低的液體供應速度和1.0升/分或更低的氣體流速。或，可以選擇的是，可以利用結合了溫度控制器的微型培養箱。數據測量與分析通常，此處描述的方法利用同時測量，并優選記錄在空間上和時間上每個這樣的測量部位處的細胞外電壓或電位值。更優選的是觀察空間陣列中每個測量部位處的信號頻率和振幅。進一步優選的是，既可以利用光學裝置也可以利用電傳感裝置觀察樣本中神經元樣本的位置和固有的自然界限，這些邊緣與傳感器的位置有關，所有這些都在選定的計算機內。
神經元樣本被放置在所述體外細胞電位測量電極陣列上，并可以利用本領域普通技術人員公知的方法保持測試過程中神經元樣本的生命力。如果愿意可以培養神經元樣本。下面將根據實施例討論典型方法。為了細胞外電壓或電位的節律振蕩而監控每個微電極，使其作為時間函數和頻率函數。這產生作為時間的函數的頻率和振幅信號的陣列。優選的是測量從接近2Hz的DC區域到35Hz以上區域的振蕩。這允許測量神經元節律活動中建立的典型的三頻帶4-20Hz(θEEG)，15-25Hz(βEEG)，和30Hz(γEEG)以上的保持。10到50Hz的較高頻帶是非常有益的。
我們已經發現，理想的是通過藥理學、生理學、或解剖學方法誘發或刺激不同的細胞外電壓或電位的振蕩。優選的是利用藥物組合物，例如一種或多種化合物，它們能促進或模仿該神經元組織中的卡巴膽堿、5-羥色胺、或兒茶酚胺的活性，然而其它刺激方式也是可以接受的。更為優選的是所述化學刺激成分是一種或多種類膽堿能化合物，其中卡巴膽堿(氯化卡巴膽堿)是非常理想的。
一旦已將提到的物質加到體外神經元組織樣本中，就可得到一組振蕩基線值。
然后使可能包含或不包含精神活性化合物的候補樣本成分與體外神經元組織樣本接觸。接著測量細胞外電壓或電位的陣列。我們發現，在引入精神活性化合物前后對這些細胞外電壓振蕩的比較提供了關于精神活性成分的存在和/或特性的信息。下面在實施例中將提供有關特定化合物的更詳細內容。
一種提供有關精神活性化合物存在或特征的重要信息的方法是利用快速傅立葉變換(FFT)。在各個不同領域都使用FFT，通常在所謂的光譜分析儀裝置中使用FFT。在測量陣列中對特定測量結果應用FFT，并將該結果與導入候補成分之前相同位置處的特定測量結果相比較，這將對有關精神活性化合物的存在、特性或藥理學活性有指導性。明確地說，如果候補物是被分析的神經元樣本區域中的精神活性物質，則這樣分析得到的信號的比較值可顯示出尖峰頻率、振幅、或兩方面結合上的偏移。
同樣有益的另一個分析法是電流信源密度(CSD)分析法。該分析方法的討論可參見例如在Nicholson等人的“電流信源密度分析理論和無尾動物小腦傳導性張量的確定”，神經生理學雜志(Journal ofNeurophysiology)，1975，3月，38(2)356-68。該分析方法可用于轉換上述裝置測得的電位或電壓，并將它們轉換成電流的類似結構的陣列，和更為重要的是電流大小。通過關聯電流的大小和方向，將它們作成時間的函數，可觀察到電流的“吸收”和“信源”。這些“吸收”和“信源”的位置對確定加入到體外神經元樣本中的精神活性藥物的存在、特征、或藥理學活性是有指導性的。
此處所用的術語“吸收”是指電流從細胞外介質吸入神經元中。
此處所用的術語“信源”是指電流從神經元內注入細胞外介質中。
此處所用的術語“海馬”是指端腦的一個區域，其位于顳葉后部，并與人類和動物中的記憶形成和重現有關。
此處所用的術語“海馬切片”是指通常約為100-500微米厚的海馬組織的物理切片，所述海馬切片可放在此處所述的電生理學記錄裝置上。
此處所用的術語“CA1”、“CA2”、“CA3”、和“CA4”是指海馬的四個區域中的一個區域。
此處所用的術語“樹突”是指從神經細胞的細胞體發出的高度分支的結構。
實施例為同時從64個部位進行記錄，以便為海馬皮層內膽堿能引發的高頻節律中的起源和區域變化尋址，該實施例利用多電極盤(MED)。然后實施與振蕩相關的另外的藥理學和生理學研究。多電極陣列的制備(MED探針)上面描述了制備多電極盤(Matsushita電氣工業有限公司，Osaka，Japan“the MED probe”)的一般方法。Oka等人也描述了MED探針的制備方法(1999)。該裝置具有64個平板狀微電極，每個微電極的尺寸為50×50μm，以8乘8的方式設置。探針的極間距離有兩種類型，150μm(PanasonicMED-P515AP)和450μm(PanasonicMED-9545AP)。
為了提供神經樣本切片與MED表面之間有足夠的粘結力，室溫下用含0.1％聚氮丙啶(SigmaP-3143)、PH為8.4的25mM硼酸鹽緩沖溶液將MED探針表面處理8小時。用無菌蒸餾水將探針表面漂洗3次。然后在37℃下至少花1小時用DMEM/F-12混合介質充滿探針(腔)，所述混合介質含有10％的胎牛血清(GIBCO16141-079)和10％的馬血清(GIBCO16050-122)。DMEM/F-12混合介質是Dulbecco改性的Eagle介質和Ham F-12(GIBCOD/F-12介質，12400-024)為1∶1的且添加了N2添加物(GIBCO17502-014)和氫化可的松(20nM，Sigma，H0888)的混合物。
海馬切片的制備在利用氟烷(2-溴-2-氯-1，1，1-三氟乙烷，SigmaB4388)麻醉后，通過斷頭術殺死17-24天大的Sprague-Dawley大鼠，然后小心地取出整個大腦。立即將腦浸入到冰冷的、飽和了氧且具有以下成分(mM)的制備緩沖液中約2分鐘NaCl為124，NaHCO3為26，葡萄糖為10，KCl為3，NaH2PO4為1.25，CaCl2為2，MgSO4為2。修整適當部分的腦，并將其放在振動組織切片機(LeicaVT-1000S)的冰冷臺上。立即用飽和了氧的且經冷凍處理的緩沖液充滿所述臺。每片組織切片的厚度為350μm。用油畫毛筆小心地從刀片上取下每片切片，經過修整，然后在室溫下立即浸入到飽含氧的制備緩沖液中1小時。然后將切片放置到MED探針的中心。切片要放置在能覆蓋8×8陣列的位置。切片定位后，立即將MED探針放置在充滿95％O2和5％CO2的箱子中，使其在32℃下恢復1小時。電生理學記錄電生理學記錄過程中，在32℃下將MED探針上的切片置于小型CO2培養箱(Asahi Lifescience4020型)內1小時。在MED探針上的切片恢復后，用沒有血清的DMEM/F-12混合介質取代介質。切片位于接觸面上并與加了水分的95％的O2和5％的CO2的氣體混合物接觸。在該條件下，記錄反應超過2小時。
從RBI(地西泮、比枯枯靈堿、CNQX，2-hydroxysaclofen)或Sigma(所有其它的化合物)購買藥品。CX614和CX691是由Cortex制藥公司(Irvine，CA)生產的。所有這些藥品都以公知濃度水浴復溫后施用，并日常制備冷凍的等份試樣。
利用多通道記錄系統(Matsushita電氣公業有限公司，“MED64系統”)以20kHz的采樣速度同時記錄所有64個部位處的自發和誘發場勢。在誘發響應的情況下，64個可用微電極中的一個平板微電極可用于刺激陰極。數據采集軟件通過隔離器產生雙極恒定電流脈沖(10到50μA，0.1微秒)。用64位開關盒選擇刺激微電極。然后利用下面討論的CSD分析法(Nicholson等人)分析測得的場勢。電流信源密度(CSD)分析法廣泛研究的電流信源密度分析法對測得的場勢(φ)進行Laplacian變換(2)，用以試圖識別電流信源和吸收(Im)的位置和相對大小(Howland等人，1955；Mitzdorf，1985評論)Im＝-(σx2xφ+σy2yφ+σz2zφ)其中σ是每個正交的三維中的導電率。很少為電生理學測量以完全三維的形式使用該方法(Nicholson，1973；Nicholson和Freeman，1975；Nicholson和Llinas，1975)，而通常是采樣一維的簡略形式(Haberly和Shepherd，1973；Ketchum和Haberly，1993；Kolta等人，1996)。然而，在二維或多維的材料(例如腦切片)中實施一維電流信源密度分析，結果會檢測不到垂直于測量軸產生的任何電流，從而使所得的一維結果另人誤解。由此在一維分析中要小心，以確保在橫向于測量樣本方向的方向上存在極小電流。優選地，當體外神經元樣本是大腦海馬區域的切片時，要作出測量值線性序列的排列，以便使其與頂部樹突生長的方向平行(因為它顯示出橫向于頂部樹突的電流相對于沿頂部鄰近軸產生的電流非常小)。該實施例中所用的技術是二維方法，其中由等距陣列中的多個電極記錄同時產生的樣值，其能保證連續傳感切片平面內任何方向上的電流，而不管陣列的行與列的相對方向和切片中存在的樹突走向。陣列由64個平板電極構成，每個電極尺寸為50×50μm，以8×8的模式設置，兩個電極間的距離為150μm和450μm(Oka等人，1999)。
在100Hz處經低通濾波后，用3×3的加權均數核(01/80，1/81/21/8，01/80)三維地平滑數據，并用3×3Laplacian函數核(010，1-41，010)卷積結果，以產生第二空間導數的離散逼近。優選地，考慮介質具有均勻電導的電阻。在考慮的時間窗(0-3秒)內為所有通道(64個)計算全相關矩陣。通過計算每個時間步長的8×8電流信源密度，并通過雙線性插值法計算想要位置處的值，從而獲得切片中單個點的電流對時間曲線。由電極間距離(采樣分辨率)與切片中出現的電流信源或吸收半徑之間的關系產生電流信源密度分析法可承受的分辨率上的公知限制，本領域的普通技術人員可以理解這一點。計算機圖形界面領域公知的“混疊”現象是指，當采樣點之間的距離大于要被表示的最小現象尺寸時會出現亂真數據“重影”(混疊)。當計算機屏幕分辨率不足以顯示要被顯示的圖形時，在屏幕中就會產生該現象(圖1左邊的畫面——具有平滑邊緣的高分辨率圖象，圖1中間的畫面——相同圖象利用相對較低分辨率的象素間距離采得，其顯得具有高空間頻率(參差不齊的階梯效應)的新特征)。通常用“抗混疊”處理屏幕上出現的亂真圖象，所述抗混疊是將圖象的低通濾波與圖象邊緣處局部陰影象素的導入相結合(圖1的右邊)。抗混疊包括一個能從圖象中去除虛假混疊特征的低通濾波器，由此也會(就象在本例子中一樣)消除一些由原始圖象派生出來的高空間頻率細部。可通過同樣的抗混疊方法(參見后面的圖2)去掉人為因素引入陣列采集到的生理學數據中產生的相應電位，并可消除數據中派生的某些精細的(高空間頻率)細部。優選地，分析法利用低通濾波而不是完全抗混疊。可以選擇的是，如果數據包含了空間頻率太高以致被電極間采樣距離析象的現象，則就要對結果進行低通濾波，以便去除雜散混疊，同時也去除高頻數據(圖2)。
特別地，圖2描述了抗混疊的效果。上面的圖表示足夠分辨采樣數據的傳感器間間隔的例子。混疊表現為非常高的頻率特征；在二分之一傳感器間的空間頻率(傳感器間隔距離的2倍)處的低通濾波消除了所有的混疊，而沒有降低采樣數據的分辨率。另一方面，圖2中左下圖表示這樣一個例子，其中傳感器的間隔不足以分辨采樣數據。混疊的空間頻率與數據中出現的最高頻率重疊。左下圖表示在二分之一傳感器間隔的空間頻率處的低通濾波將不能消除所有的混疊，但會消除數據中一些最細的細部。圖2中的右手圖表示較低空間頻率處的低通濾波成功地消除了所有的雜散混疊，另外還降低了采集數據的分辨率，消除了很多測得數據中可能存在的高頻精細細部。僅保留了較低頻率或較大部分。
結果連續、二維電流信源密度分析法在將Schaffer-聯合刺激輸入海馬切片制品中的區域CA1的環境下實施二維電流信源密度分析。圖3A和3B表示典型實驗。圖3A表示將切片放置在8×8MED電極陣列上，電極間的間隔為150μm，使電極中央位于海馬切片的CA1的頂部樹突區域中。在電極陣列上，電極覆蓋了CA1的基部樹突、CA1的頂部樹突、和齒狀溝回顆粒細胞區域的上葉。為了防止GABAA-和GABAB-介導的抑制成分，用50μM的木防己苦毒素和100μM的2-hydroxysaclofen進行該實驗。圖3B表示通過向暗灰色表示的電極(10)施加單刺激脈沖產生(EPSC)的、并通過亮灰表示的電極(12)測得的典型突觸后電流。對于這些誘發反應，時標是典型的。豎直虛線標記了所有64個電極測量的時間點，其示于下面的圖4中。
圖3B表示所示電極上突觸后電流的時程和大小，該電極位于CA1頂部樹突的鄰近部分內。電流吸收和信源方向正如所表示的；開始纖維齊發(volley)(約持續1微秒)后，在大約5微秒時出現電流吸收增加，并在后來的大約13微秒時回到基線之前的5微秒內減少吸收。它變成一個電流信源，并在大約30-40微秒時回到基線前大約持續另一個15～20微秒。對于這些誘發反應，該吸收和信源的相對大小和時程是典型的。
實施二維電流信源密度分析以獲得同一反應的電流信源和吸收的可比較測量。圖4表示對圖3B中所示誘發反應進行的連續二維電流信源密度分析。圖4中的每個圖都表示在由圖3B中豎直虛線表示的選定時刻處計算出的切片內瞬時信源和吸收。陣列位于如圖3A中所示切片的位置；海馬區域CA1的細胞體層限定了一個離每幅圖頂部四分之一距離的大概水平的曲線。虛線表示CA1的細胞體層(頂部)和頂部樹突區域的最遠范圍(底部)。正如在底部標定條所示，與灰色的電流-淺色背景相比，吸收是黑的，而信源是白的。
能夠看出，開始纖維齊發后(大概持續1微秒)，在大約5微秒的時間段內CA1的頂部樹突中的電流吸收迅速上升(參見標記“6ms”的圖)，并在大約11微秒圖中消失之前的后續5微秒內下降，同時在刺激部位出現奇點。在大約2微秒的過渡期內，其中電流不能與淺色背景區別開，頂部樹突中出現信源(15微秒)，在大約35微秒時的消失之前其大約持續再一個15-20微秒。可以看到單個電極的波形的時程和大小(圖3B)與圖4中計算出的電流信源密度吸收-信源序列緊密對應。
二維電流信源密度法展示的是電流信源和吸收的空間方面，而其它方法很難辨別該空間方面。大概在啟動電流脈沖刺激的Schaffer連合纖維區域內，刺激性突觸后電流吸收遍布CA1的頂部區域(從3微秒到9微秒的圖)；接著的電流信源大致占據同一區域(15微秒到27微秒的圖)。頂部樹突內出現的吸收和后面的信源都伴有CA1基部樹突區域(在每幅圖的頂部附近)內的極性相反的電流。由此可將主要誘發反應的特征表示為電流吸收-信源偶極，它在3到9微秒出現，從15到27微秒反轉形成電流信源-吸收偶極。另外，切片中會出現較小電流，在此不對其加以討論。
在短暫停頓后，這些樹突中出現電流信源，其中心比電流吸收的中心稍遠。頂部信源加強、擴大、消耗，并在大約50微秒時消失，形成了大約50微秒的誘發反應“時間段”。頂部吸收和隨后的頂部信源都伴隨有CA1基部樹突中出現的極性相反的場(每幅圖的頂部)，該極性相反的場增大并消耗，其具有與頂部情況大致相同的時程。
正如所描述的，由于混疊將引起很高空間頻率的數據丟失，因此在這些分析中進行了抗混疊以防止引入人為因素。濾波僅能使空間頻率至多為二分之一采樣頻率的那些數據通過；在本實施例中，電極間的距離為150μm，這不能測量對大約小于300μm(半徑為150μm)的電流信源或吸收。在海馬區域CA1大小的結構中這是一個缺點，可以預期的是，該方法丟掉了精細的空間細部。因此，對于檢測通過該方法測得的CSD的空間分辨率是有益的。
圖5A和5B描繪了疊置在測量區域上的區域CA1的頂部樹突的邊界。
圖5A表示切片和陣列位置(來自圖3A和3B)；右邊是在所示電極刺激后6微秒時電極陣列區域中的瞬時CSD(來自圖4)。陣列頂部與CA1的基部樹突一致；陣列的上部中心部分覆蓋CA1中的頂部樹突區域，而陣列底部三分之一覆蓋齒狀溝回的上葉。虛線表示CA1的細胞體層(頂部)和頂部樹突區域(底部)的最遠范圍。
正如圖5B所示，主要測得的電流吸收(黑色)僅占據了存在頂部樹突的區域，而相反的電流信源(白色，頂部)僅出現在基部樹突的區域內。(在對應于刺激電極位置處的計算圖象中不存在電流；不能從該電極取得記錄，所得的CSD處理留下一個間隙)。在用單電極(用深灰色表示)刺激后的6微秒處通過連續二維電流信源密度分析法計算生理學反應；圖象是來自圖4B的6微秒禎的特寫鏡頭。通過虛線表示CA1的頂部樹突區域的界限。可以看到，誘發電流吸收的范圍與頂部樹突的界限緊密對應。在刺激電極部位處產生電流吸收中的明顯的孔，在該孔內不會進行記錄，也不會計算電流信源密度。在細胞體層本身內部存在很小電流，在基部樹突(畫面頂部)內出現電流信源。在CA1樹突頂端(圖中部)存在很小電流，在齒狀溝回顆粒細胞的頂部樹突內出現不強的電流。
能夠理解的是，計算出的吸收邊界不會與樹突區域的解剖學界限位置精確相符，該不精確是由于該方法的分辨率限制導致的。海馬內卡巴膽堿引發β波的分布和電流信源圖6A包括海馬切片的顯微照片和下伏的64個電極陣列，該陣列的記錄位置之間為450μm(寬陣列)。也可以看到海馬的子域和上覆的皮層。圖6B表示在20個電極部位上卡巴膽堿引發的自發活動譜圖，所述電極部位與切片中的部分海馬相接觸。每個x軸位于1到100Hz的對數比例尺上。在10-30Hz頻率范圍內、特別是在區域CA1和CA3的頂部樹突內可以看到活動，別處的活動電平較低。標定條為5×10-11V2。正如在圖6C中所看到的，基線活動為低壓，其通常缺乏振動活性，在子域之間不存在可靠的差異。
在區域CA1和CA3內，注入卡巴膽堿后跟著是逐步發展的節律活動，55個測試切片中的41切片的所述活性接近或位于(該實施例的圖6D)β帶(10-30Hz)內。四十一個切片中的三十四個切片的β帶振蕩都在區域CA1和CA3內。在剩余7個切片的區域CA1或CA3內可觀察到θ范圍上端的低電壓活動。橫跨切片內CA1對CA3中的相對起伏不是連貫的。在齒狀溝回內也發現了振蕩高頻活動，該活動在結構內側比在外側更多(圖6B，D)。圖6E表示陣列左上電極內卡巴膽堿引發活動的特寫圖，其表示跨越區域CA1細胞體層的反向極性。在圖6E中，標定條為0.1mV；250毫秒。正如在圖6E的較高增益記錄中所看到的，在錐體細胞區域內，頂部樹突的波要大于基部樹突的波，在這兩個位置之間，波的相位通常相反。
可使用快速傅立葉變換對卡巴膽堿引發節律的頻率和分布進行定量分析。對于圖6B中所示的實施例，發現譜圖中大部分能量都位于10和30Hz之間，并在20Hz處有一個明顯的峰。所有切片主CA1頻率的組平均值為18.8±5.7Hz(平均值±標準差)，單獨對于β例子是19.2±4.8Hz。CA3的相當值為16.4±5.7Hz和17.3±4.2Hz。CA1與CA3之間的差值不會達到統計顯著性。10-30Hz帶內具有最高能量的記錄部位位于區域CA3和CA1的頂部樹突內，通常位于較遠區域。
正如圖7A所看到的，間隔為150μm的陣列(密集陣列)提供了精細的節律活動空間分辨率。在離接近尺寸的遠端，位于CA3/CA1邊界中心的記錄展現出絕對電位的驚人陡坡，最大電位占據了與區域CA3a和CA3b分子層對應的離散區域(圖7B)。值得注意的是，電位反向橫跨細胞層邊界(例如圖7B的左上象限)。在CA1內也出現較小的但仍然基本的電壓帶。所有通道的頻譜示于圖7C中。
實施連續二維電流信源密度分析，以進一步限定這些以擬膽堿能方式引發振蕩的信源。圖8表示瞬時信源(白色)和吸收(黑色；與灰色的淺色背景相比)，在圖7所示的密集陣列相同自發活動過程中與任意選擇的起始時刻0間隔4毫秒。CA3和CA1的顆粒和錐體細胞區域的輪廓與它們頂部樹突的范圍重疊，以表示該時間段內產生情況的位置。陣列包括齒狀溝回的部分上葉。每幀都表示電極陣列區域內瞬時的計算電流信源密度。從任意選擇的起始點開始，在區域CA3與CA1之間邊界的頂部樹突中出現吸收，在基部樹突內有橫跨細胞界限層的相關信源。頂部CA1內的大吸收伴隨有CA1基部樹突內的信源。該吸收及其伴隨的基部信源在大概12毫秒過程中增強并擴大，到初次顯現后的大概16微秒為止，它們都衰退到接近基線水平。在短暫的停頓后，其間不能將活動與背景區別開，在大約20毫秒時頂部樹突內出現信源，在基部樹突內出現對應吸收。在消耗以前大約后20微秒(40微秒)為止，它們擴大并增強，之后重新出現頂部吸收以重新開始一個周期，該信源(以及伴隨它的偶極)在消耗前大概持續20微秒。值得注意的是，頂部信源似乎將其中心設置得比先于它的更集中的頂部吸收的中心更遠，位于在電極間間隔為150m的分辨能力范圍內。吸收-信源偶極重復出現，并產生圖7C所示的頻率曲線；從該重復的頂部吸收——信源偶極的一個峰到另一個峰的時程大約為40微秒，其與～25Hz的頻率相符。
圖9A和9B表示切片中由卡巴膽堿引發的重復性振蕩的典型記錄。在許多實驗中，信源-吸收和吸收-信源偶極以及它們的沿體外神經元樣本的錐體細胞體層的信源與吸收之間清晰限定的邊界都重復出現一些特征，諸如從一個頂部吸收通過頂部信源到達下一個頂部吸收的等待時間。
圖9A表示一個電路板(450μm的電極間間隔)陣列上的海馬切片。用淺灰表示用于測量錐體細胞區域基部樹突反應的電極；用于測量頂部樹突反應的電極為深灰色。圖9B表示來自頂部(黑)樹突區域的平均反應，而在圖9A中示出了切片經過500微秒(0.5秒)時間的基部(淺灰)樹突區域。在跨越整個采樣期間內，持續存在卡巴膽堿引發(20μM)的振蕩，正是這種典型反應的形式。平均頂部與基部反應極性相反；即，相位差為180度。在大部分切片內和采樣時間段內可粗略觀察到橫跨CA3和CA1細胞體層持續出現的位于10-30Hz(β)范圍內的交替電流信源-吸收偶極。
采用連續二維電流信源密度分析法并利用電極間隔為450μm的電極陣列可評定較大區域內吸收和信源之間的偏移，所述電極陣列與前面的電流信源密度實施例不同，在前實施例所用的陣列間距為150μm。最后得到的混疊和抗混疊(見圖2)必然留下更多的分辨率損失；對于450m的電極間隔和伴隨而來的抗混疊，能可靠成象的最小現象為其半徑是450μm(直徑為900μm)或更大的現象。
圖10表示計算出的經過42微秒的電流信源密度演變。每幀都表示利用寬(間隔為450μm)陣列記錄自發活動的過程中特定時刻(每幀左上角中表示的微秒)的計算的電流信源密度。黑色表示吸收的最大振幅；白色表示信源的最大振幅。其示出了錐形和顆粒細胞區域的位置。
從任意選定的0微秒時刻開始，區域CA3頂部樹突中的弱電流信源被集中在錐體細胞層上的分散信源所包圍。區域CA3頂部樹突中的強焦點吸收或接近輻射層(S.radiatum)大約開始于6微秒時刻，并伴隨有CA3的細胞和基部樹突層內的信源。吸收增長和充分發展的集中在CA3b上的吸收-信源關系在9微秒的時間點處很明顯。吸收在開始向區域CA1擴展前大概持續12微秒。頂部CA3內的吸收大概在18微秒時消失，接著大約在3微秒后開始CA1中的頂部吸收，在15微秒時所述吸收伴隨出現所述細胞體/基部樹突信源。注意，截止到該時間點為止，CA3中的吸收——信源關系開始衰退。大概在與它們的有關頂部吸收相同的時刻基部信源開始消失。CA3內的頂部信源大約始于24微秒時，在幾毫秒內伴隨有CA3中的輕微基部信源；然后頂部信源向CA1擴張，并伴隨有CA1中的基部吸收。在大約15-25微秒后這些信源——吸收對開始消失。在該切片中不規則地重復出現這樣的周期。波形包含了強烈的頂部樹突吸收，該吸收約持續10微秒，之后是頂部信源，該信源約持續兩倍于前述持續時間段的時間。這些現象始于CA3中，在3-5微秒時間內可在CA1內看到它。概括來說，以膽堿能方式引發的β范圍節律具有位于頂部樹突內的電流信源，所述電流信源通常比定位更近的電流吸收得到更好限定。
這些觀察表示，在持續較長的頂部信源之間插有較短的頂部吸收。平均電流的檢驗表明，在各切片之間，貫穿海馬的錐體細胞亞類的信源和吸收分布會不同。切片間變化性也會出現在系列電流信源密度分析中，它們的主要區別在于CA3對CA1中的現象集中程度。然而，在所有顯示β范圍振蕩的切片中，頂部樹突的簡短的頂部吸收——較長的頂部信源序列是很顯著的。在后海馬皮層內卡巴膽堿引發40Hz的節律利用仔細檢測這些切片致力于解決由卡巴膽堿引發的節律是否存在局域性區別的問題，在所述檢測過程中，電極陣列位于絕大部分后海馬皮層區域以及海馬自身的錐體細胞區域下方。圖11A表示位于寬陣列上的皮層——海馬顯微照片。圖示出了兩個感興趣的部位——一個在CA1(100)內，一個在內嗅區皮層(102)的深層內。在圖11B中比較了卡巴膽堿(50μM)從區域CA1和內嗅區皮層內的所示位置引發的快波。附圖中將能值給定為倍數10-11。正如從圖11所看到的，內嗅區的振蕩頻率比海馬的振蕩頻率高。快速傅立葉變換表明，皮層內占優勢的頻率大約是區域CA1內的兩倍。貫穿海馬錐體細胞區域的頂部樹突可發現峰值接近20Hz的節律活動，而40Hz的活動主要與內嗅部位有關。也可以觀察到，40Hz的振蕩集中在中間內嗅區皮層的深層內(圖11的右上側譜圖)。位于海馬與中間內嗅區皮層之間的區域都顯示出峰。實際上，這顯示出在跨越后海馬皮層中包含的序列的升級以有序方式增加的40對20Hz的相對平衡。在具有適當定位的電極的15個切片中的每個切片內，記錄了內嗅區皮層深層中40Hz的活動；由此這顯示為該區域對膽堿能刺激的特征反應。所有記錄部位的結果都概括在圖11C(切片內代表性活動的分布(標定條0.1mV，500毫秒))和圖11D(切片內低通(0-100Hz)濾波能譜的分布(標定條2×10-11V2))內。卡巴膽堿引發β波所涉及的遞質系統用20μM阿托品能完全消除卡巴膽堿引發的高頻節律，而利用AMPA受體拮抗劑CNQX(20μM)可大大降低該高頻節律。在存在比枯枯靈堿(10μM)時，在錐體層內蕈毒堿的刺激會產生高頻尖峰，在某些方面是癲癇樣放電，但缺乏節律活動。在這些條件下，卡巴膽堿會引發重復性突發行為和偶發癲癇。癲癇樣突發之間的間隔有時接近于β波的時間段(數據未示出)。這些癲癇發作類似于Williams和Kauer(1997)報道的活動。頂部樹突中錐體細胞觸發β樣活動的順行激勵產生頂部信源的γ-氨基丁酸能(GABA能)細胞怎樣被激發無疑對理解β振蕩的起源很重要。如果涉及錐體細胞的側突，則在發現卡巴膽堿引發節律的區域內，足夠引起重復性尖峰的順向刺激應當會導致出現β樣活動。因為(i)輻射層(radiatum)層內的有效前飼(feed-forward)樹突的抑制分流了刺激電流，(ii)軀體周圍(perisomatic)抑制能避免重復性放電，所以Schaffer-聯合纖維的單脈沖刺激通常不會引起重復性尖峰。能部分阻斷GABAa受體郁積的比枯枯靈堿濃度，可用于減少這些抑制反應，由此使錐體細胞響應順向刺激而發射出4-5個尖峰。
圖12A-12D表示對區域CA3的順向激勵誘發的β樣活動進行的二維電流信源密度分析。圖12A表示陣列(電極間間隔為150μm)相對于集中在區域CA3內的海馬切片的位置。將刺激引入到用單色(106)表示的電極上，在圓圈形電極(108)上記錄。正如下面所注解的，圖12B表示對區域CA3的順向刺激的典型反應。該反應表示小尖峰的突發，后面接著的是約持續30-40微秒的正向波。箭頭表示峰吸收(53微秒)和峰信源(83微秒)。圖12C表示切片中能譜的分布最大反應位于CA1的頂部樹突和CA3的頂部和近端樹突內。傅立葉變換表明，反應頻譜的波峰在15-20Hz和100-200Hz(圖12C)范圍內；要注意，使用的對數標尺從1延伸到1000。圖12D表示在兩個時間點(刺激后的53微秒和83微秒，用箭頭表示)上的二維瞬時電流信源密度分析。在遠端頂部樹突內表示出15-20Hz的成分，該成分的分布類似于卡巴膽堿引發β波分布。在53微秒時，引發的電流吸收位于它的波峰上，并可以看到該電流吸收主要在CA3的頂部樹突內產生，并伴隨有基部樹突內的相應信源。在83微秒時，返回信源波峰；可看到該現象也發生在CA3的頂部樹突內，并伴隨有基部樹突內的相應吸收。
圖12B中所述類型的反應對比枯枯靈堿的濃度敏感，其在20μM的比枯枯靈堿處受到阻滯。對后一個誘發反應的電流信源密度分析表明，在錐體層上方約200-400μm的輻射層內，由位于朝向CA1的門附近的刺激部位產生信源；這與細胞體和基部樹突內的密集吸收一致(圖12D)。苯并二氮雜蕈類識別和特征圖13A-13C表示苯并二氮雜類對卡巴膽堿引發β波的影響。正如在比較圖13A(只有20μM卡巴膽堿)和13B(具有卡巴膽堿的相同切片加了3μM地西泮)時所看到的，苯并二氮雜類顯著地增強了β振蕩的振幅。傅立葉變換表明，增大的振幅并沒有伴隨波形頻率上的顯著變化。節律活動得到顯著增強，其擴散到相對不活躍的區域。(圖13A和13B的標定條0.2mV，500微秒)。
圖13C總結了海馬范圍內記錄位置的頻譜，并示出了沒有(黑色)和存在(灰色)地西泮時能譜的重疊。其表明，在20Hz譜帶范圍內，地西泮(灰色譜)產生了三倍于只有卡巴膽堿(黑色譜)時的能量增長，且在頻率上沒有太多偏移。另外，通過加入地西泮可在較高頻率(接近40Hzγ)處增加峰值。(標定條5μV)。
另外，表1總結了8個實驗的結果，其中在注入地西泮前存在著卡巴膽堿引發的高頻節律。對于CA3，波峰頻率處的能量增加是321±170％，對于CA1是217±137％。切片內地西泮的影響是相關的(r＝0.93)，在統計方面，CA3內的增加要大于CA1內的增加(p＜0.05，成對的t檢驗，2個拖尾)。整個切片內，加入地西泮后的振蕩頻率與只有卡巴膽堿時記錄的頻率相關(CA3r＝0.85；CA1r＝0.96)。
表1. 8個實驗的總結，其中在注入地西泮前就在海馬切片中存在卡巴膽堿引發的高頻節律。其示出了區域CA3和CA1內波峰頻率處能量增加的最大百分比。
正如所看到的，使用苯并二氮雜類化合物中的一種能顯著增強β振蕩的振幅。對于圖14A-14C和15A-C中所示的結果，測量只有卡巴膽堿的各樣本的電位，并測量具有卡巴膽堿加上兩類苯并二氮雜類的各樣本的電位一個例子是3μM的地西泮(圖14A-C)，另一個例子是20μM的氟西泮(圖15A-C)。
圖14A是位于MED陣列頂部的海馬切片的顯微照片。類似地，圖15A是位于所用的MED陣列頂部的海馬切片的顯微照片。電極間距離為450μM。示出對兩組數據進行快速傅立葉變換的結果(在圖14B和15B中分別具有淺灰色背景的明顯解剖學界限)。這樣分析得到的數據表明，注入苯并二氮雜類的增大振幅的數據沒有伴隨波形頻率上的顯著變化。正如從圖14C和15C中所看到的，兩種苯并二氮雜類都引起20Hz頻帶范圍內能量的近三倍增大。波峰頻率處能量的增加大約為300％。Ampakine識別和特征在該實施例中，可將寬間隔的MED用于海馬樣本(分別在圖16A和17A中用下伏的微電極表示)。再次測量具有卡巴膽堿的樣本和后來加入了10μM Ampakine(在圖16A-C中為CX614，在圖17A-C中為CX691)的樣本的電位。對兩組數據進行的快速傅立葉變換結果分別示于圖16B和17B中(在淺灰色背景中有顯著的解剖學邊界，由此與數據相關)。所得數據表明，注入Ampakine的數據的增大頻率也伴隨波形振幅上的顯著變化。特別是，圖16C和17C概括了特別選取的記錄位置的頻譜。這表明，Ampakines不僅引起20Hz頻帶(箭頭)內能量的顯著增加，而且導致波峰產生10Hz的偏移。
Ampakines使同步性顯著降低，并使第二波峰略大于10Hz。所得數據表明，注入Ampakines的數據的振幅降低伴隨著波形頻率上的輕微低偏移。兩個在結構上不相似的Ampakines不僅引起了20Hz范圍內能量的顯著降低，而且也導致波峰發生10Hz的偏移。正如所示出的，看起來似乎第二波峰集中在齒狀溝回內，區域CA3象是與前Ampakineβ節律的CA1——下腳位置相對。GABA拮抗劑識別和特征GABA能受體的拮抗劑引起顯著的縮減，并使用復合尖峰信號刺激的活動失去同步。圖18A-C和19A-C分別表示比枯枯靈堿和木防己苦毒素對卡巴膽堿引發的β波的影響。
圖18A是位于MED陣列頂部的海馬切片的顯微照片。類似地，圖19A是位于此處所用MED陣列頂部的海馬切片的顯微照片。電極間的間隔為450μM。測量只有卡巴膽堿的樣本的電位，并測量后來加入了以下兩種類型的GABA能拮抗劑的樣本的電位10μM的比枯枯靈堿(圖18A-C)和50μM的木防己苦毒素(圖19A-C)。
對這兩組數據進行的快速傅立葉變換結果分別示于圖18B和19B中(在淺灰色背景中具有明顯的解剖學界限，由此與數據相關聯)。這樣分析得到的數據表明，在施用任何—種GABA能拮抗劑后，注入拮抗劑中的振幅數據顯著減小。所述拮抗劑不僅引起20Hz頻帶范圍內能量的顯著降低，而且也導致由復合尖峰信號組成的慢成分。這些尖峰信號似乎集中在CA1、腦下腳和皮層內。圖18C和19C表示從圖18B和19B選出的數據。AMPA拮抗劑識別和特征結構不同的AMPA型谷氨酸受體的拮抗劑引起卡巴膽堿預先處理的體外神經元樣本內同步活動的快速損耗。測量僅有卡巴膽堿的樣本的電位，并測量后來加入了三類谷氨酸拮抗劑的樣本的電位，所述三類谷氨酸拮抗劑分別是一個實施例是20μM CNQX(圖20A-C)，—種是20μM DNQX(圖21A-C)，另一種10μM NBQx(圖22A-C)。對每組數據進行快速傅立葉變換的結果示于圖20B、21B和22B中(在淺灰色背景內具有明顯的解剖學邊界，由此與數據相關聯)。所得數據表明了注入了拮抗劑的樣本的振幅數據被顯著降低/和或消除。所有這三種拮抗劑都引起了能量的顯著降低。圖20C、21C和22C表示選自圖20B、21B和22B的數據。
總結圖23以定性方式描述了向神經元組織加入各種影響心理活動的藥物引起的誘發電位中的相對差異。觀察或定量評價這些相對差異，以檢測并鑒定各功能組合和這些組的特定成員，例如，1.GABA拮抗劑，例如比枯枯靈堿、北美黃連堿、木防己苦毒素、SR-95531(Gabazine)2.AMAP拮抗劑，例如CNQX、DNQX、GYKI 52466HCl、Joro蜘蛛毒素、1-萘基-乙酰基精胺、NS257、NBQX。
3.苯并二氮雜類(通常來說，任何具有有效催眠和鎮靜作用的化學性質類似的影響精神活動的藥物組；主要用作抗焦慮和誘發睡眠的藥物)，例如阿普唑侖，氯氮雜，替馬西泮，氟西泮，膽地西泮氧化物(Cholrdiazepoxide)，奧沙西泮，美達西泮，勞拉西泮，氟托西泮，氟地西泮，阿普唑侖，噁唑侖，氯噻西泮，依替唑侖，氟西泮(FlurazepamHloxazolam)，艾思唑侖，硝基安定，硝甲西泮，氟硝西泮，trizolam，rimazafone，氟馬西尼，溴西泮等。
4.AMPA受體調諧劑，例如Ampakine(苯(甲)酰哌啶藥物(BDP))CX516(BDP-12)，CX554(BDP-20)，CX614，CX691，吡拉西坦類的吡乙酰胺(nootropics)-茴拉西坦、奈非西坦。
5.抗精神病藥物，通常例如吩噻嗪衍生物、噻噸衍生物、丙基苯基酮衍生物(多巴胺受體拮抗劑)、亞胺基二苯基衍生物、Dibenzotthiazepine衍生物，苯甲酰胺衍生物、Theipine衍生物、苯并異噁唑衍生物(5-羥色胺和多巴胺拮抗劑)，特別是卡馬西平、氯丙嗪、氯普噻噸、氯氮平、丙戊酸鈉與丙戊酸復合劑、氟奮乃靜、氟哌丁醇、碳酸鋰、枸椽酸鋰、洛沙平、甲砜噠嗪、嗎茚酮、奧氮平、奮乃靜、匹莫其特、quetiapine、利螺環酮、硫利噠嗪、替沃噻噸、三氟啦嗪，以及三氟丙嗪。
6.抗抑郁藥物，通常例如三環或四環類抗抑郁藥、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSIRs)、5-羥色胺和去甲腎上腺素吸收抑制劑、以及單胺氧化抑制劑，其特別例如氨基酮、阿米替林、阿莫沙平、安非他酮、多塞平、地昔帕明、氯米帕明、氟西汀、氟伏沙明、金絲桃屬、貫葉金絲桃屬、丙咪嗪、異卡波肼、馬普替林、米爾塔扎平、奈法唑酮、去甲替林、帕羅西汀、苯哌嗪、苯乙肼、普羅替林、舍曲林、反苯環丙胺、曲唑酮、三唑吡啶、曲米帕明，和文法拉星。
7.中樞神經系統興奮藥，通常例如為黃嘌呤和苯丙胺，特別是例如右旋苯丙胺、麻黃、草麻黃(Ephedra sinica)、Melamphetamine、哌醋甲酯、匹莫林。
8.抗驚厥藥物，通常例如巴比妥酸鹽、噁唑烷二酮衍生物、碳酸酐酶抑制劑，苯丙二氮雜類和GABA遞質抑制劑；特別是例如卡馬西平、氯巴占、地近胺、丙戊酸鈉與丙戊酸復合劑、非氨酯、氟桂利嗪、磷苯妥英、加巴噴丁、拉莫三嗪、左乙拉西坦、咪達唑侖、米拉醋胺、MK-801、奧卡西平、苯巴比妥、撲米酮、氟柳雙胺、司替戊醇、噻加賓、托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸、和唑尼沙胺。
9.抗焦慮藥物，通常例如抗組胺藥、巴比妥酸鹽、苯并二氮類、β阻滯劑、丁螺環酮、1，2-丙二醇、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSIR)、5-羥色胺受體興奮劑、和三環抗抑郁藥；特別例如阿替唑 、丁螺環酮、氯氮、氯米帕明、氯氮、地西泮、氟西汀、氟伏沙明、哈拉西泮、勞拉西泮、甲丙氨酯、奧沙西泮、苯巴比妥、胡椒、卡瓦胡椒素(pipermethysticam)、普拉西平，和普萘洛爾。
10.催眠藥(通常，催眠藥是有關睡眠或催眠的藥物，或是能通過抑制傳入沖動或通過抑制大腦皮層中心內對感覺印象的接受而對疼痛不敏感、由此引起局部或完全不清醒的藥物)，催眠藥通常包括鎮靜劑、鎮痛劑、麻醉藥、和中毒藥物，當用于引起睡眠時有時稱為安眠藥和催眠劑。特定催眠藥包括脂族醇、巴比妥酸鹽、苯并二氮類、金絲桃屬、貫葉金絲桃、褪黑激素、某種非巴比妥酸鹽、胡椒(piper)、卡瓦胡椒素(piper methysticum)、纈草和纈草officinalis。
11.麻醉鎮痛劑，例如鴉片受體興奮劑，特別例如海洛因和嗎啡。
12.多巴胺能試劑，例如金剛烷胺、苯扎托品、卡比多巴/左旋多巴和苯海索。
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權利要求
1.一種檢測體外神經元組織樣本中精神活性化合物的方法，它包括a)將在所述體外神經元組織樣本內的細胞外電位的振蕩與基線作比較，評價所述振蕩與所述基線之間的差值，其中該組織樣本已與精神活性化合物的候補樣本接觸，以及b)根據所述振蕩與所述基線之間的差值檢測所述候補樣本成分內存在或不存在精神活性化合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括使所述精神活性化合物候補樣本成分與所述體外神經元組織樣本相接觸的步驟。
3.根據權利要求2所述的方法，其進一步包括以下步驟在使所述精神活性化合物候補樣本成分與所述體外神經元組織樣本接觸以前，檢測所述體外神經元組織樣本內細胞外電位振蕩的基線。
4.根據權利要求1所述的方法，進一步包括根據所述基線與所述細胞外電位振蕩之間的差值表示所述精神活性化合物的成分特征的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述差值是從以下差值組中選出的細胞外電位的頻率、振幅、以及所述頻率和所述振幅的組合與所述基線之間的差值。
6.根據權利要求1所述的方法，進一步包括對所述獲得的細胞外電位振蕩和所述基線進行快速傅立葉轉換的處理步驟。
7.根據權利要求1所述的方法，進一步包括對所述振蕩和所述基線的時間序列進行電流信源密度分析以產生電流特性曲線的處理步驟。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述比較步驟包括將所述振蕩的振幅或頻率與所述基線作比較以檢測所述候補樣本成分中存在或不存在精神活性化合物的步驟。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述比較步驟包括將大量所述振蕩與對應的大量的所述基線比較以檢測所述候補樣本成分中存在或不存在精神活性化合物的步驟。
10.一種檢測體外神經元組織樣本中的精神活性化合物并表示其特征的裝置，其包括a)細胞電位測量電極陣列，其具有多個可與計算機連接的微電極，所述微電極既適于檢測所述體外神經元組織樣本中的細胞外電位的振蕩，又適于向所述體外神經元組織樣本提供電刺激，b)樣本導引器，用于導入精神活性化合物的候補樣本成分，使其與體外神經元組織樣本接觸，以及c)所述計算機，所述計算機包括以下程序i)在向所述體外神經元組織樣本導入所述精神活性化合物候補樣本前后都檢測所述體外神經元組織樣本內的細胞外電位的振蕩，以及ii)比較所述細胞外電位的前后振蕩，以檢測存在或不存在精神活性化合物，如果檢測到，就根據細胞外電位的所述前后振蕩之間的差值表示所述精神活性化合物的特征。
11.根據權利要求10所述的裝置，其中細胞外電位的所述基線和所述振蕩是從以下組中選擇的值的空間陣列細胞外電位的頻率，細胞外電位的振幅、和細胞外電位的所述頻率和所述振幅的組合，其中所述計算機包括比較所述前后值的空間陣列的比較程序。
12.根據權利要求11所述的裝置，其中所述計算機包括對所述前后值的空間陣列進行快速傅立葉變換的程序。
13.根據權利要求12所述的裝置，其中所述計算機包括數字信號處理器。
14.根據權利要求10所述的裝置，其中所述計算機包括對細胞外電位的時間序列進行電流信源密度分析以產生電流特性曲線的程序。
15.根據權利要求10所述的裝置，其中所述計算機包括比較所述前后值的振幅和頻率以檢測所述候補樣本成分內存在或不存在精神活性化合物的程序。
16.一種檢測體外神經元組織樣本內的精神活性化合物、并表示其特征的方法，其包括以下步驟a)檢測所述體外神經元組織樣本內細胞外電位的振蕩基線值，b)使候補樣本成分與所述體外神經元組織樣本相接觸，c)檢測得到的所述體外神經元組織樣本內細胞外電位的所述振蕩的值，以及d)比較振蕩的所述結果值與所述基線值，以檢測所述候補樣本成分內存在或不存在精神活性化合物。
17.根據權利要求16所述的方法，其進一步包括以下步驟分別處理所述獲得的細胞外電位的振蕩值和細胞外電位振蕩的所述基線值，以獲得計算出的結果值和計算出的基線值，以及其中所述比較步驟包括比較所述計算出的結果值和所述計算出的基線值，以檢測所述候補樣本成分內存在或不存在精神活性化合物。
18.根據權利要求17所述的方法，其進一步包括根據所述計算出的結果值與所述計算出的基線值的差值表示檢測出的精神活性化合物特征的步驟。
19.根據權利要求16所述的方法，其進一步包括在檢測細胞外電位振蕩的所述基線值之前加入刺激成分的步驟。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括能促進或模仿乙酰膽堿、5-羥色胺或兒茶酚胺作用的一種或多種化合物。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括一種或多種類膽堿作用的化合物。
22.根據權利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括卡巴膽堿。
23.根據權利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括共培養的組織樣本。
24.根據權利要求16所述的方法，其進一步包括存儲細胞外電位振蕩的所述基線值的步驟。
25.根據權利要求16所述的方法，其中所述細胞外電位振蕩的所述基線值和細胞外電位的所述獲得的振蕩值選自以下組中θ、β和γEEG波。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述EED波的所述基線值和所述得到的EEF波值是β波。
27.根據權利要求16所述的方法，其中所述細胞外電位振蕩的基線值和細胞外電位的所述得到的振蕩值是從以下組中選出的值的空間陣列細胞外電位的頻率，細胞外電位的振幅，細胞外電位的所述頻率和所述振幅的組合。
28.根據權利要求16所述的方法，其中所述處理步驟包括以下步驟分別對每個細胞外電位的所述得到的振蕩值和細胞外電位振蕩的基線值進行快速傅立葉變換，以產生所述計算出的結果值和所述計算出的基線值。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述處理步驟包括在數字信號處理器內對細胞外電位的所述得到的振蕩值和細胞外電位振蕩的所述基線值進行快速傅立葉變換。
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述處理步驟包括在通用計算機內對細胞外電位的所述得到的振蕩值和細胞外電位振蕩的所述基線值進行快速傅立葉變換。
31.根據權利要求16所述的方法，其中所述處理步驟包括對所述計算出的結果值和所述計算出的基線值的時間序列進行電流信源密度分析以產生電流特征曲線的步驟。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述處理步驟包括在數字信號處理器內對細胞外電位的所述得到的振蕩值和細胞外電位振蕩的所述基線值進行快速傅立葉變換。
33.根據權利要求31所述的方法，其中所述處理步驟包括在通用計算機內對細胞外電位的所述得到的振蕩值和細胞外電位振蕩的所述基線值進行快速傅立葉變換。
34.根據權利要求28所述的方法，其中所述比較步驟包括以下步驟將所述計算出的結果值的頻率或振幅與所述計算出的基線值作比較，以檢測所述候補樣本成分內存在或不存在精神活性物質。
35.根據權利要求28所述的方法，其中所述比較步驟包括以下步驟將大量所述計算出的結果值與對應的大量所述計算出的基線值作比較，以檢測所述體外神經元組織樣本內細胞外電位振蕩的變化，并檢測所述候補樣本成分中存在或不存在精神活性化合物。
36.根據權利要求16所述的方法，其進一步包括以下步驟在檢測細胞外電位振蕩的所述基線值以前，通過對所述體外神經元組織樣本進行電刺激引發細胞外電位的基線振蕩。
37.根據權利要求16所述的方法，其中細胞外電位值的所述得到的振蕩和細胞外電位振蕩的所述基線值是從以下組中選出的值的空間分布細胞外電位的頻率，細胞外電位的振幅，細胞外電位的所述頻率和所述振幅的組合。
38.根據權利要求37所述的方法，其中通過將體外神經元組織樣本的電位陣列與解剖學特征作比較而獲得電位的空間分布。
39.根據權利要求38所述的方法，其中通過顯微鏡觀察所述解剖學特征。
40.根據權利要求38所述的方法，其中通過顯微圖象和圖象處理算法分析所述解剖學特征。
41.根據權利要求16所述的方法，其中所述處理步驟進一步包括計算所述計算出的基線值和所述計算出的結果值的區域性分布的步驟。
42.根據權利要求28所述的方法，其中所述處理步驟進一步包括計算所述計算出的基線值和所述計算出的結果值的區域性分布的步驟。
43.根據權利要求33所述的方法，其中所述處理步驟進一步包括計算所述計算出的基線值和所述計算出的結果值的區域性分布的步驟。
44.根據權利要求41所述的方法，其中通過將計算出的值與體外神經元組織樣本的解剖學特征作比較來獲得計算出的基線值和計算出的結果值的區域性分布。
45.根據權利要求42所述的方法，其中通過將計算出的值與體外神經元組織樣本的解剖學特征作比較來獲得計算出的基線值和計算出的結果值的區域性分布。
46.根據權利要求42所述的方法，其中通過將計算出的值與體外神經元組織樣本的解剖學特征作比較來獲得計算出的基線值和計算出的結果值的區域性分布。
47.根據權利要求44所述的方法，其中通過顯微鏡觀察所述解剖學特征。
48.根據權利要求45所述的方法，其中通過顯微鏡觀察所述解剖學特征。
49.根據權利要求41所述的方法，其中通過顯微鏡觀察所述解剖學特征。
50.根據權利要求44所述的方法，其中通過顯微圖象和圖象處理算法分析所述解剖學特征。
51.根據權利要求45所述的方法，其中通過顯微圖象和圖象處理算法分析所述解剖學特征。
52.根據權利要求40所述的方法，其中通過顯微圖象和圖象處理算法分析所述解剖學特征。
全文摘要
本發明涉及通過在向體外神經元組織樣本導入候補樣本前后檢測細胞外電壓的振蕩來檢測體外神經元組織樣本內的精神活性化合物的方法，以及用于實施該方法的裝置。細胞外電壓參數的分析產生對候補樣本內存在精神活性物質的指示和有關其藥理學活性和/或成分的信息。此外，本發明涉及在體外樣本內激發并維持重復性神經活動的存在的方法。另外，本發明包括通過導入能促進或模擬乙酰膽堿、5－羥色胺或兒茶酚胺作用的促進成分諸如卡巴膽堿，或通過使體外神經樣本遭受電刺激作用，來刺激或激發體外神經元組織樣本內的重復性神經活動、例如EEG的方法。
文檔編號G01N33/94GK1457430SQ00809285
公開日2003年11月19日 申請日期2000年6月21日 優先權日1999年6月21日
發明者G·林克, 竹谷誠, 下野健, 杉原宏和 申請人:松下電器產業株式會社, 加利福尼亞大學董事會