多步分離方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及純化多不飽和脂肪酸（PUFA)及其衍生物的改進的色譜分離方法。特 別是，本發明涉及采用混合溶劑系統的改進的色譜分離方法。
【背景技術】
[0002] 脂肪酸（特別是PUFA)及其衍生物是生物學上重要分子的前體，它們在調節諸如 血小板聚集、炎癥和免疫反應等生物學功能中起著重要作用。因此，PUFA及其衍生物可在 治療上可用于治療廣泛的病理病癥，這病理病癥包括CNS病癥、包括糖尿病性神經病變的 神經病變、心血管疾病、包括炎性皮膚疾病的全身免疫系統和炎癥病癥。
[0003] 在諸如蔬菜油和海洋油等天然進料中發現PUFA。然而，這些PUFA經常以飽和脂肪 酸和許多其他雜質的共混物存在于這些油中。因此，在營養性應用或藥物性應用之前，應該 對PUFA進行所需純化。
[0004] 不幸的是，PUFA極易被破壞。因此，當在氧存在下加熱時，它們易于發生異構化反 應、過氧化反應和低聚反應。因此，難以通過PUFA產物的分離和純化來制備純脂肪酸。即 使在真空條件下蒸餾也可能導致不可接受的產物降解。
[0005] 色譜分離技術為本領域技術人員所眾所周知。涉及固定床系統和模擬或真實的移 動床系統的色譜分離技術均為本領域技術人員所熟悉。
[0006] 在常規的固定床色譜系統中，其組分待分離的混合物滲透通過容器。該容器一般 是圓柱形的，并且通常被稱為柱。該柱含有對流體表現出高滲透率的多孔材料的填料（一 般稱為固定相）。混合物中各組分的滲透速度取決于該組分的物理性質，從而使得組分選 擇性地依次從柱中出來。因此，一些組分趨向于牢固地固定到固定相，并且因此將緩慢地滲 出，然而其他組分趨向于薄弱地固定并更快速地從柱中出來。已經提出許多不同的固定床 色譜系統，并且這些固定床色譜系統均被用于分析目的和工業生產目的。
[0007] 模擬和真實的移動床色譜是本領域技術人員所熟悉的已知技術。操作原理涉及液 體洗脫劑相和固體吸附劑相的逆流移動。該操作允許溶劑的最小用量，從而使得該方法經 濟可行。已經發現這種分離技術在不同領域中的若干應用，這些領域包括碳氫化合物、工業 化學品、油、糖和API。
[0008] 因此，模擬移動床系統由串聯連接在一起的含有吸附劑的若干獨立的柱組成。洗 脫劑沿第一方向通過這些柱。在系統中原料和洗脫劑的注入點和已分離組分的收集點依靠 一系列閥門而周期性地切換。整體效應將模擬含有固體吸附劑的移動床的單個柱的操作， 固體吸附劑沿洗脫劑流向的逆流方向移動。因此，如常規的固定床系統中的，模擬移動床系 統由含有洗脫劑從中通過的固體吸附劑的固定床的柱組成；但在模擬移動床系統中，該操 作達到模擬連續逆流移動床的程度。
[0009] 參照圖1，示出了典型的模擬移動床色譜設備。通過考慮被分成多段（section) (更精確地說，從柱的底部到頂部被分成四個重疊的子區域Ι、Π 、ΙΙΙ和IV)的含有固定相 S的豎直的色譜柱來解釋模擬或真實移動床色譜分離方法的概念。借助于泵P在底部的IE 處引入洗脫劑。在子區域II和子區域III之間的IA+B處引入待分離的組分A和B的混合 物。在子區域I和子區域II之間的SB處收集主要含有B的提取物，并且在子區域III和 子區域IV之間的SA處收集主要含有A的提余物。
[0010] 在模擬移動床系統的情況下，通過引入點和收集點相對于固體相的移動來引起固 定相S的模擬向下移動。在真實移動床系統的情況下，通過多個色譜柱相對于引入點和收 集點的移動來引起固定相S的模擬向下移動。在圖1中，洗脫劑向上流動，并且混合物A+B 注入到子區域II和子區域III之間。組分將根據它們與固定相的色譜相互作用（例如在 多孔介質上的吸附）而移動。對固定相表現出較強的親和力的組分B (運動較慢的組分） 將會較慢地被洗脫劑夾帶并且將會由延遲地跟隨著洗脫劑。對固定相表現出較弱的親和力 的組分A (運動較快的組分）將會容易地被洗脫劑夾帶。如果恰當地估計和控制參數的合 適設置（特別是在每個子區域中的流速），那么將在子區域III和子區域IV之間收集對固 定相展示較弱親合性的組分A作為提余物，并且在子區域I和子區域II之間收集對固定相 展示較強親合性的組分B作為提取物。
[0011] 因此，應當理解的是，示意性示出在圖1中的常規的移動床系統僅限于二元分級。
[0012] 在下列若干專利中描述了用于模擬移動床色譜的方法和裝置，這些專利包 括：US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148 和 FR-A-2651149,通過引用將這些專利的全文并入本文中。該主題還在Ganetsos和Barker 編輯的"Preparative and Production Scale Chromatography''，Marcel Dekker Inc, New York, 1993中得以充分論述，通過引用將其全文并入本文中。
[0013] 真實移動床系統在操作上類似于模擬移動床系統。然而，不是借助于閥門系統來 變換進料混合物和洗脫劑的注入點以及被分離的組分的收集點，而是使一系列吸附單元 (即，柱）相對于進料點和排出點進行物理移動。再者，操作達到模擬連續的逆流的移動床 的程度。
[0014] 在以下若干專利中描述了真實移動床色譜的方法和裝置，這些專利包括： US6979402、US5069883和US4764276,通過引用將這些專利并入本文中。
[0015] PUFA產物的純化特別有挑戰性。因此，用于制備PUFA產物的許多合適的原料是極 其復雜的混合物，該極其復雜的混合物含有大量在色譜設備中具有非常相似的保留時間的 不同組分。因此，非常難以將某些PUFA與這些原料分離。然而，特別是對于藥物應用和營 養食品應用來講，需要高純度的PUFA產物。因此，當需要高純度PUFA產物時，歷史上已經 使用了蒸餾。然而，如上所討論，使用蒸餾作為用于難以處理的PUFA的分離技術具有顯著 的缺點。
[0016] 已公布的國際專利申請W0-A-2011/080503,其全部內容通過引用而被并入本文， 公開了一種從進料混合物有效地且以非常高純度的方式回收PUFA產物的SMB分離方法。 然而，已經發現，難以在不使用大體積的含水醇溶劑的情況下從進料混合物有效地移出C18 脂肪酸，特別是α-亞麻酸（ALA)和/或γ-亞麻酸（GLA)。因為許多藥物和食用油的規格 需要這些脂肪酸的含量低，所以有效地除去C18脂肪酸是有利的。例如，在日本使用的某些 油規格需要小于Iwt %的ALA含量。
[0017] 于是，需要一種可以從進料混合物高效地回收PUFA產物，同時最小化所得產物中 存在的C18脂肪酸（例如ALA和/或GLA)的色譜分離方法。

【發明內容】

[0018] 現已驚奇地發現，可以通過使用混合溶劑體系由可商購的原料（諸如魚油）有效 地純化具有低含量的C18脂肪酸的PUFA產物（例如ALA和/或GLA)。
[0019] 因此，本發明提供了一種從進料混合物回收多不飽和脂肪酸（PUFA)產物的色譜 分離方法，包括：
[0020] (a)在第一色譜分離步驟中，使用水和第一有機溶劑的混合物作為洗脫劑來純化 所述進料混合物，以獲得中間產物；以及
[0021] (b)在第二色譜分離步驟中，使用水和第二有機溶劑的混合物作為洗脫劑來純化 所述中間產物，以獲得所述PUFA產物，
[0022] 其中，所述第二有機溶劑與所述第一有機溶劑不同，并且具有與所述第一有機溶 劑的極性指數相差介于〇. 1和2. 0之間的極性指數，
[0023] 其中，所述PUFA產物不是α -亞麻酸（ALA)，γ -亞麻酸（GLA)，亞油酸，ALA甘油 單酯、二酯或三酯，GLA甘油單酯、二酯或三酯，亞油酸甘油單酯、二酯或三酯，ALA Ci~C 4烷 基酯、GLA Ci~C 4烷基酯或者亞油酸C C 4烷基酯，或者它們的混合物。
[0024] 還提供了 一種由本發明的方法獲得的PUFA產物。
[0025] 還提供了一種包含能由本發明的方法獲得的PUFA產物的組合物。
【附圖說明】
[0026] 圖1示出用于分離二元混合物的模擬或真實的移動床方法的基本原理。
[0027] 圖2示出將EPA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0028] 圖3示出將DHA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0029] 圖4示出將EPA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0030] 圖5示出將DHA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0031] 圖6示出將EPA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0032] 圖7示出將DHA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0033] 圖8示出將EPA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0034] 圖9示出將EPA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的包括兩個模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟。
[0035] 圖10示出可以執行包括兩種模擬或真實的移動床方法的色譜分離步驟的三種方 式。
[0036] 圖11示出將EPA與運動較快的雜質和運動較慢的雜質（即，極性較大的雜質和極 性較小的雜質）分開的色譜分離步驟。
[0037] 圖12示出由使用甲醇作為第一有機溶劑的本發明的方法的第一分離步驟所產生 的中間產物的GC-FAMES跡線（trace)。
[0038] 圖13示出由使用乙腈作為第二有機溶劑的本發明的方法的第二分離步驟所產生 的PUFA產物的GC-FAMES跡線。
[0039] 圖14示出由使用乙腈作為第一有機溶劑的本發明的方法的第一分離步驟所產生 的中間產物的GC-FAMES跡線。
[0040] 圖15示出由使用甲醇作為第二有機溶劑的本發明的方法的第二分離步驟所產生 的PUFA產物的GC-FAMES跡線。
[0041] 圖16示出含有55wt% EPA乙酯的常規進料混合物的GC-FAMES跡線。
【具體實施方式】
[0042] 在本發明最一般的意義上，本發明提供了一種從進料混合物回收多不飽和脂肪酸 (PUFA)產物的色譜分離方法，包括：
[0043] (a)在第一色譜分離步驟中，使用水和第一有機溶劑的混合物作為洗脫劑來純化 所述進料混合物，以獲得中間產物；以及
[0044] (b)在第二色譜分離步驟中，使用水和第二有機溶劑的混合物作為洗脫劑來純化 所述中間產物，以獲得所述PUFA產物，
[0045] 其中，所述第二有機溶劑與所述第一有機溶劑不同，并且具有與所述第一有機溶 劑的極性指數相差介于〇. 1和2. 0之間的極性指數。
[0046] 如本文所用的，術語"PUFA產物"是指包含通常具有營養或藥物重要性的一種或多 種多不飽和脂肪酸（PUFA)和/或其衍生物的產物。通常，PUFA產物是單種PUFA或其衍生 物。或者，PUFA產物是兩種或更多種PUFA或其衍生物的混合物。
[0047] 術語"多不飽和脂肪酸"(PUFA)是指含有多于一個雙鍵的脂肪酸。這種PUFA為本 領域技術人員所周知。如本文所用的，PUFA衍生物是甘油單酯、二酯或三酯，酯，磷脂，酰胺， 內酯或鹽的形式的PUFA。優選甘油單酯、二酯和三酯以及酯。更優選甘油三酯和酯。進一 步更優選酯。酯通常為烷基酯，優選C 1-C 6的烷基酯，更優選C1-C 4的烷基酯。酯的實例 包括甲酯和乙酯。最優選乙酯。
[0048] 通常，PUFA產物是至少一種ω-3或〇-6PUFA或者其衍生物，優選至少一種 〇-3PUFA或者其衍生物。
[0049] 〇-3PUFA的實例包括二十碳三烯酸（ETE)、二十碳四烯酸（ETA)、二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。優選EPA、DPA和DHA。最優選EPA 和 DHA。
[0050] co-6PUFA的實例包括二十碳二烯酸、二高-γ-亞麻酸（DGLA)、花生四烯酸（ARA)、 二十二碳二烯酸、腎上腺酸以及二十二碳五（ω-6)烯酸。優選ARA和DGLA。
[0051] 優選地，PUFA產物是EPA、DHA、它們的衍生物或它們的混合物。典型的衍生物包 括EPA和DHA的甘油單醋、二酯和三酯；以及EPA和DHA的醋，優選烷基醋，諸如C 1- C 4烷 基醋。
[0052] 更優選地，PUFA產物是EPA、DHA或它們的衍生物。典型的衍生物包括EPA和DHA 的甘油單酯、二酯和三酯；以及EPA和DHA的酯，優選烷基酯，諸如Ci~C 4烷基酯。
[0053] 更優選地，PUFA產物是二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳六烯酸（DHA)、EPA甘油三 酯、DHA甘油三酯、EPA乙酯或者DHA乙酯。
[0054] 特別優選地，PUFA產物是EPA、DHA、EPA乙酯或DHA乙酯。
[0055] 在一個實施方式中，PUFA產物是EPA和/或EPA乙酯（EE)。
[0056] 在另一個實施方式中，PUFA產物是DHA和/或DHA乙酯（EE)。
[0057] 在又一個實施方式中，PUFA產物是EPA和DHA和/或EPA EE和DHA EE的混合物。
[0058] 在最優選的實施方式中，第二分離步驟中獲得的PUFA產物是EPA或EPA衍生物， 例如EPA乙醋；并且所獲得的純度大于90wt%，優選大于95wt%，更優選大于97wt%，更加 優選大于98wt %，仍更優選大于98. 4wt %。優選地，第二步驟中獲得的PUFA產物是EPA或 EPA衍生物，例如EPA乙醋，并且所獲得的純度介于98wt%和99. 5wt%之間。
[0059] 通常，除了所述PUFA產物，在本發明的色譜分離方法中收集另外的次要PUFA產 物。優選地，PUFA產物是EPA或其衍生物，并且另外的次要PUFA產物是DHA或其衍生物。
[0060] 在本發明的進一步的實施方式中，該方法配置為收集PUFA產物，該PUFA產物是 EPA和DHA或它們的衍生物的濃縮混合物。因此，使用含有EPA、DHA、比EPA和DHA極性更 大的組分以及比EPA和DHA極性更小的組分的進料混合物。
[0061] 通常，PUFA產物含有小于lwt%的α -亞麻酸（ALA)、ALA甘油單酯、二酯和三酯以 及ALA C1-C4烷基酯雜質。更通常，PUFA產物含有小于Iwt %的雜質，該雜質是ALA及其 衍生物。典型的ALA衍生物是如上面關于PUFA衍生物所定義的。
[0062] 通常，PUFA產物含有小于lwt%的γ-亞麻酸（GLA)，GLA甘油單酯、二酯和三酯以 及GLA C1-C4烷基酯雜質。更通常，PUFA產物含有小于Iwt%的雜質，該雜質是GLA及其 衍生物。典型的GLA衍生物如上文關于PUFA衍生物所定義的。
[0063] 通常，PUFA產物含有小于lwt%的C18脂肪酸雜質，C18脂肪酸甘油單酯、二酯和 三酯雜質以及C18脂肪酸烷基酯雜質。更通常，PUFA產物含有小于Iwt %的雜質，該雜質是 C18脂肪酸及其衍生物。典型的C18脂肪酸衍生物是如上文關于PUFA衍生物所定義的。如 本文所使用的，C18脂肪酸是具有直烴鏈或支烴鏈的C18脂肪族單羧酸。典型的C18脂肪 酸包括：硬脂酸（C18:0)，油酸（C18:ln9)、異油酸（C18:ln7)、亞油酸（C18:2n6)、γ-亞麻 酸/GLA(C18:3n6)、α-亞麻酸/ALA(C18:3n3)和十八碳四烯酸/SDA(C18:4n3)。
[0064] 為了避免疑惑，在這些實施方式中，所有指定雜質的最大量為Iwt%。
[0065] 如上所述，PUFA產物中上述雜質的量通常小于lwt%。優選地，上述雜質的量小 于0. 5wt %，更優選小于0. 25wt %，更加優選小于0.1 wt %，仍更優選小于0. 05wt %，仍更 優選小于〇. Olwt %，仍更優選小于0.0 Olwt %，仍更優選小于0.0 OOlwt %，仍更優選小于 0.0 OOOlwt%。
[0066] 在某些優選的實施方式中，PUFA產物基本上不含有上述雜質。
[0067] PUFA產物不是ALA，GLA，亞油酸，ALA甘油單酯、二酯或三酯，GLA甘油單酯、二酯 或三酯，亞油酸甘油單酯、二酯或三酯，ALA C1-C 4烷基酯，GLA C1-C4烷基酯或者亞油酸 (^~C 4烷基酯，或者它們的混合物。通常，PUFA產物不是ALA、GLA、亞油酸，或者它們的衍 生物或混合物。典型的ALA、GLA和亞油酸衍生物是如上文關于PUFA衍生物所定義的。
[0068] 通常，PUFA產物不是C18PUFA，C18PUFA甘油單酯、二酯或三酯，或者C18PUFA烷基 酯。因而，本發明提供了一種從進料混合物回收多不飽和脂肪酸（PUFA)產物的色譜分離方 法，包括：
[0069] (a)在第一色譜分離步驟中，使用水和第一有機溶劑的混合物作為洗脫劑來純化 所述進料混合物，以獲得中間產物；以及
[0070] (b)在第二色譜分離步驟中，使用水和第二有機溶劑的混合物作為洗脫劑來純化 所述中間產物，以獲得所述PUFA產物，
[0071] 其中，所述第二有機溶劑與所述第一有機溶劑不同，并且具有與所述第一有機溶 劑的極性指數相差介于〇. 1和2. 0之間的極性指數，
[0072] 其中，所述PUFA產物不是C18PUFA，C18PUFA甘油單酯、二酯或三酯，或者C18PUFA 烷基醋。
[0073] 更通常，PUFA產物不是C18PUFA或C18PUFA衍生物。典型的C18PUFA包括亞油酸 (C18:2n6)、GLA (C18:3n6)和 ALA (C18:3n3)。
[0074] 適用于通過本發明的方法分離的進料混合物可以由天然來源和合成來源獲得，該 天然來源包括植物油和動物油和脂肪，該合成來源包括從經基因修飾的植物、動物和包括 酵母的微生物獲得的油。實例包括魚油、藻油和微藻油以及植物油，例如琉璃苣油，藍薊油 和月見草油。在一個實施方式中，進料混合物是魚油。在另一個實施方式中，進料混合物是 藻油。當期望的PUFA產物是EPA和/或DHA時，藻油特別合適。當期望的PUFA產物是EPA 時，經基因修飾的酵母特別合適。
[0075] 在特別優選的實施方式中，進料混合物是魚油或魚油衍生的原料。已經有利地發 現，當使用魚油或魚油衍生的原料時，通過本發明的方法能夠以大于90%的純度，優選為大 于95 %的純度，更優選為大于97 %的純度，甚至更優選為大于98 %的純度，更加優選為大 于98. 4%的純度，例如介于98 %和99. 5 %之間的純度生產EPA或EPA乙酯PUFA產物。
[0076] 在