一種柔性篩板固相萃取柱及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新型固相萃取柱，包括固相萃取柱的填料和制備方法，以及使用 該固相萃取柱進行血液中樣品萃取和檢測的方法，特別適應于易分解及易解離型藥物制劑 的分離與提取，屬于生物化學和藥物代謝技術領域。
【背景技術】
[0002] 血液中樣品的提取與分析是藥物代謝動力學和代謝組學等中必要的分析處理方 法。由于血液樣品基質復雜，選擇合適的預處理方法十分重要。固相萃取方法是常用的一 種前處理方法，但目前的商品化固相萃取柱填料致密，難以對大尺寸的物質（如脂質體）進 行有效的萃取分離。而易分解的藥物制劑也會產生不同程度的解離，導致對于代謝過程中 的檢測產生偏差。
[0003] 針對上述問題，在血液樣品處理這一領域，提供一種能有效分離大尺寸、易解離物 質的固相萃取方法，對于一些藥物代謝動力學的研宄有很大意義。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種固相萃取柱及其制備方法和應用，利用該固相萃取柱可 以對血液中復合制劑型藥物，如脂質體包裹小分子藥物等，進行很好地分離，以滿足臨床藥 物代謝的實驗。
[0005] 本發明提供的固相萃取柱包括：位于萃取柱底部的疏水性高穿透性柔性篩板，及 萃取柱內的非極性硅基填料，其中非極性硅基填料干粉的粒徑為10-100 μπι。
[0006] 上述疏水性高穿透性柔性篩板例如硅烷化的脫脂棉、高分子絲狀非紡織材料、聚 乙烯纖維絲棉或聚丙烯纖維絲棉等材料制備成的柔性篩板。
[0007] 所述高穿透性，是指微米級別的物質不會受到阻礙，能夠穿透。
[0008] 上述非極性娃基填料干粉的粒徑優選為40-60 μ m。
[0009] 本發明的固相萃取柱通過下述方法制備得到：
[0010] 在空的固相萃取柱底部放入疏水性的高穿透性柔性篩板（如硅烷化的脫脂棉、高 分子絲狀非紡織材料、聚乙烯或聚丙烯纖維絲棉等制備成的柔性篩板），填入一定質量的非 極性硅基填料干粉（粒徑10-100 μm)，制成固相萃取柱。
[0011] 上述高穿透性柔性篩板的材料中所述的硅烷化的脫脂棉，是通過如下方法制備 的：將脫脂棉用第一有機溶劑（例如丙酮或甲醇）清洗并晾干，在硅烷化試劑溶液（如將二 甲基二氯硅烷溶于正己烷得到的溶液）中浸泡一定時間，使得硅烷化完全，將脫脂棉取出 后用第二有機溶劑沖洗干凈，稍晾干后，在甲醇中浸泡若干小時，晾干后，用第三有機溶劑 (例如正己烷等）浸泡洗凈，最后晾干得到高穿透性柔性篩板。而高分子絲狀非紡織材料、 聚乙烯或聚丙烯纖維絲棉等材料可直接用于本發明中。
[0012] 上述第一有機溶劑優選易揮發的有機溶劑，例如丙酮、甲醇、氯仿等；上述第二有 機溶劑是不含水的非極性有機溶劑，不含有活潑氫，易揮發，例如烷烴，其中正己烷是比較 好的選擇；上述第三有機溶劑是非極性有機溶劑，不含水，不含有活潑氫，例如正己烷等烷 烴類有機溶劑。
[0013] 本發明的固相萃取柱主要應用于分離提取易分解及易解離型大尺寸物質（100納 米-100微米），例如脂質體包裹小分子藥物等藥物制劑。
[0014] 本發明還提供了利用上述固相萃取柱進行固相萃取的方法，具體是：將上述固相 萃取柱洗滌并活化后上樣，用洗滌液在重力條件下洗滌，最后用洗脫液洗脫，實現樣品的富 集和分離凈化。
[0015] 優選的，采用有機溶劑對所述固相萃取柱進行洗滌，再用水溶液活化。通常，上樣 前，洗滌固相萃取柱用的有機溶劑與洗脫液是一致的，根據樣品的性質進行選擇，常用的如 甲醇、二氯甲烷、氯仿、甲苯等；活化固相萃取柱的水溶液與上樣后的洗滌液保持一致。
[0016] 進一步的，洗脫得到的溶液用氮氣吹干儀吹干，再加入復溶液（如高效液相色譜 流動相）溶解，定容，進行相關檢測。
[0017] 本發明提供的新型固相萃取柱以柔性非極性材料為篩板，加入非極性硅基填料制 備而成，填料疏松，便于大分子的通過；非極性柔性篩板使得極性分子極易洗滌。該萃取柱 可用于復雜樣品基質中大尺寸、易解離樣品的提取分離。本發明涉及該固相萃取柱的制備 方法，包括柔性非極性篩板的制備以及填料方法，以及使用該固相萃取柱進行萃取的流程 及檢測方法。本發明應用于血漿中紫杉醇和紫杉醇脂質體的分離，達到很好的分離效果。本 發明的固相萃取柱制備容易、操作簡單、成本較低、穩定性好，在臨床實驗大規模應用中具 有很好的前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1是實施例3采用本發明固相萃取柱及流程分析血漿中游離紫杉醇的工作曲 線。
【具體實施方式】
[0019] 下列實施例所使用的試劑及原料：
[0020] 力樸素-注射用紫杉醇脂質體（南京綠葉思科藥業有限公司）。Flash-ClS填料 40-60 μ m，20-45 μ m (博納艾杰爾科技有限公司）。
[0021] 乙腈，甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司）；甲酸，甲酸銨；正己烷，二甲基二氯硅 烷，丙酮（分析純）；5%葡萄糖注射液（北京雙鶴藥業股份有限公司）。
[0022] 若無特別說明，在實驗過程中使用的純凈水均由Milli-Q水純化系統（Millipore 公司，Molsheim市，法國）制備而成。其余未提到的試劑均為分析純，并且使用前無需進一 步的純化。
[0023] 下列實施例采用的儀器為：
[0024] 超高效液相色譜儀 ACQUITY UPLC (Waters)，質譜儀為 API-5500 (AB SCIEX)，氮氣 吹干儀BF-2000 (北京八方世紀科技有限公司）。
[0025] 液相色譜條件：
[0026] 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18,1. 7 μπι，2· l*50mm
[0027] 柱溫：45°C
[0028] 流動相A : 2mM甲酸銨，0· I % (V/V)甲酸水溶液；B :甲醇
[0029] 流速：0· 4mL/min
[0030] 梯度：0-0· 5min 50% Α，0· 5-2. 5min 5% Α，2· 5-3. Omin 50% A
[0031] 質譜條件：
[0032] 霧化溫度：500 °C
[0033] 紫杉醇 MS/MS :m/z 854. 2- 286. 2
[0034] 內標 MS/MS :m/z 808. 2- 226. 2
[0035] 實施例1固相萃取柱的制備
[0036] 將脫脂棉用丙酮清洗并晾干，在5% (V/V)二甲基二氯硅烷的正己烷溶液中浸泡 14小時，取出后用正己烷沖洗干凈，稍晾干后，在甲醇中浸泡1小時，晾干后，用正己烷浸 泡，最后晾干得到硅烷化的脫脂棉。
[0037] 在ImL注射器（內徑4. 7mm)底部塞入適量硅烷化脫脂棉，填入0· 12g Flash-C18 填料（40-60 μm)干粉，制成固相萃取柱。固相萃取柱先用ImL甲醇洗絳，再用ImL 5% (g/ mL)葡萄糖注射液活化。
[0038] 實施例2血液中紫杉醇和紫杉醇脂質體的固相萃取流程
[0039] 1、向已活化好的的固相萃取柱滴加50 μ L內標工作液（多烯紫杉醇，500ng/mL，甲 醇：水=1:1 (體積比）溶解），自然滴干；
[0040] 2、加入2mL 5%葡萄糖溶液，自然滴干；
[0041] 3、加入200 μ L血漿樣品，自然滴干；
[0042] 4、加入5mL 5%葡萄糖溶液，自然滴干；
[0043] 5、加入I. 2mL 20% (V/V)甲醇-水溶液，自然滴干后，緩慢將其吹干；
[0044] 6、加入ImL甲醇洗脫，自然滴干后再緩慢吹干，收集洗脫液；
[0045] 7、將洗脫液在40°C用氮氣吹干，加100 μ L復溶液（0. 1 %甲酸-甲酸按水溶液： 甲醇=I : 1，體積比），HPLC/MS進樣檢測。
[0046] 實施例3血液中紫杉醇與紫杉醇脂質體定量檢測方法學考核
[0047] 采用內標法進行定量，固相萃取流程同實施例2,利用二級質譜進行定量檢測。對 方法的特異性、標準曲線、定量下限、精密度和準確度、基質效應、回收率進行考核。
[0048] A特異性：采用6個不同健康人的空白血漿樣品，使用本發明的固相萃取和檢測方 法處理和測定，在得到的色譜圖中根據保留時間可以判斷血漿中沒有內源性物質的干擾。
[0049] B標準曲線：配置紫杉醇濃度為0. Ι-lOOng/mL的血漿工作液，采用本發明的固相 萃取和檢測方法處理并測定。以濃度為橫坐標，紫杉醇與內標峰面積比為縱坐標，進行直線 擬合，得到標準曲線見圖1。標準曲線相關系數r>0. 99,線性良好。
[0050] C精密度和準確度：配置3個不同濃度的質控樣品（低濃度質控、中濃度質控、高 濃度質控），采用本發明的固相萃取和檢測方法處理并測定重復5個樣品，連續測定3批，計 算日間和日內精密度和準確度。結果如表1所示，精密度結果RSD〈 15%，3個質控樣品的準 確度均維持在± 15%以內，說明本方法的準確性高，重現性好，是一個穩定的方法。
[0051] 表1.紫杉醇檢測精密度和準確度
[0052]
【主權項】
1. 一種固相萃取柱，包括位于萃取柱底部的疏水性高穿透性柔性篩板，及萃取柱內的 非極性硅基填料，其中非極性硅基填料干粉的粒徑為10-100 μm。
2. 如權利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于，所述疏水性高穿透性柔性篩板是硅 烷化的脫脂棉、高分子絲狀非紡織材料、聚乙烯纖維絲棉或聚丙烯纖維絲棉材料制備成的 柔性篩板。
3. 如權利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于，所述非極性硅基填料干粉的粒徑為 40-60 μ m〇
4. 權利要求1?3任一所述的固相萃取柱的制備方法，在空的固相萃取柱底部放入疏 水性的高穿透性柔性篩板，填入一定質量的非極性硅基填料干粉，制成固相萃取柱。
5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述疏水性高穿透性柔性篩板的材料 為硅烷化的脫脂棉，通過如下方法制備：將脫脂棉用第一有機溶劑清洗并晾干，在硅烷化試 劑溶液中浸泡一定時間，使得硅烷化完全；然后將脫脂棉取出，用第二有機溶劑沖洗干凈； 稍晾干后，在甲醇中浸泡若干小時；晾干后，用第三有機溶劑浸泡洗凈，晾干。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述第一有機溶劑為易揮發的有機溶 劑；所述第二有機溶劑和第三有機溶劑是不含水、不含有活潑氫、易揮發的非極性有機溶 劑。
7. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述第一有機溶劑選自丙酮、甲醇和氯 仿中的一種；所述第二有機溶劑和第三有機溶劑是烷烴類有機溶劑。
8. 權利要求1?3任一所述的固相萃取柱在分離提取100納米-100微米的大尺寸物 質中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述大尺寸物質是藥物制劑。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述藥物制劑是脂質體包裹小分子藥物。
【專利摘要】本發明公布了一種柔性篩板固相萃取柱及其制備方法和應用。該固相萃取柱以柔性非極性材料為篩板，加入非極性硅基填料制備而成，填料疏松，便于大分子的通過；非極性柔性篩板使得極性分子極易洗滌。該固相萃取柱可用于復雜樣品基質中大尺寸、易解離樣品的提取分離。
【IPC分類】G01N1-34, B01D15-22, B01J20-30, B01J20-281
【公開號】CN104606923
【申請號】CN201510021658
【發明人】張新祥, 周穎琳, 張一鳴, 鄭昕
【申請人】北京大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月16日