專利名稱：探針介質的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種將探針固定于基材的探針介質及其固定方法。本發明還涉及一種檢測方法，它是利用將探針介質固定于基材上得到的探針固定基材來檢測靶向物質。
背景技術：
作為將探針固定于基材上的方法，已知各種方法。詳細地說，有通過在基材上合成探針實現在基材上固定的方法，也有用針狀物或貼附物將事先準備好的探針賦予于基材上來實現固定的方法。具體地，如美國專利第51438545號公報(USP5143854)記載，現已已知一種方法，它是通過反復利用活化劑由基材上所選區域除去保護基，使具有可除去保護基的單體與前述區域結合，來合成基材上具有種種序列的單體。此外，如特開平8-23975記載，現還已知一種方法，它是使具有基材及基材上載有的碳化二亞胺的高分子化合物組成的固定用材料，與具有碳化二亞胺反應性的生物活性物質相接觸，從而實現固定。同樣地，特開平8-334509記載了在檢測生物學活性物質時，在具有碳化二亞胺的化合物上，通過碳化二亞胺基進行固定，由此進行檢測的方法。再有，特開記載了一種方法，它通過使末端具有巰基的DNA片斷與固相載體(具有能與巰基反應形成反應性取代基的鏈狀分子一端固定于表面)以液相接觸，使該DNA片斷與鏈狀分子之間形成共價鍵，從而實現將DNA片斷固定于固相載體表面。
另外，作為生物體成分的檢測方法，也已知很多方法。特開記載了一種方法，該方法在排除背景噪聲影響的同時能夠以高靈敏度、高精度且簡便地檢測RNA、cDNA、寡核苷酸等生物體成分等物質。再有，特開記載了一種方法，它用噴嘴將含有反應性物質的溶液噴于反應基板上所希望的位置，由此將反應性物質固定于基板上。基板為玻璃或硅制，反應性物質為DNA片斷、cDNA、RNA、酶、抗原、抗體、表位、蛋白質、多核苷酸、肽等組成的組中選出的至少一種。
在基材上固定探針時，已知使用水溶性高分子材料進行封閉處理。具體地，特許第2794728號記載了將樣品核酸固定在膜上之后，浸泡在含有PVA或/及PVP的溶液中進行封閉處理的方法。此外，對于將核酸固定于膜上之后的處理，已知使用脫脂乳等進行封閉處理。具體地，特公平06-034756記載了將核酸固定于膜上之后，在使該膜與脫脂乳及N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯反應的溶液中進行封閉處理的方法。
另外，對于將探針固定于基材上的探針固定基材，在將探針賦予在基材上之后，已知要防止DNA探針的干燥。具體地，特開記載了在DNA片斷溶解或分散而成的水溶液中添加高沸點溶劑。
再者，關于用高分子材料(聚合物)涂覆醫療用具，已知用聚合物及藥劑涂覆醫療用具。具體地，特表記載了一種用來涂覆醫療用具、并含有生物適應性生物分解性聚合物及藥劑的組合物。
但是，作為含有可特異性結合以往使用的靶向物質的探針的探針介質，還沒有將探針及探針可結合部位、及基材上可結合部位包含在1個介質中的物質。而且，作為將可特異性結合以往使用的靶向物質的探針固定于基材上的方法，是通過將含有探針可結合部位的材料涂覆于基材上、或處理基材表面而形成探針可結合部位等方法，在基材上形成結合層后，通過賦予至少含有探針的介質來固定探針。為此，在將探針介質賦予于基材上之前，為了事先在基材上形成探針可結合部位，有必要進行處理。進而，以具有探針可結合部位的化合物與基材為探針固定材料，通過在探針固定材料上予處理基材表面來固定探針。該方法在進行探針固定化前，需要在探針固定材料上處理基材。
另外，作為含有可特異性結合以往使用的靶向物質的探針介質，還沒有將探針及水溶性高分子材料包含在1個介質中的物質。作為使用探針固定基材來檢測靶向物質的檢測方法中的1個步驟的封閉處理中，已知使用水溶性高分子材料，但是還沒有在探針介質中含有水溶性高分子材料的物質，也沒有在基材上固定探針時混合探針及水溶性高分子材料的物質。而且，作為將可特異性結合以往使用的靶向物質的探針固定于基材上的探針固定基材，已知在基材上固定作為1種探針的DNA片斷之后，需要防止DNA片斷干燥。為此，需要在DNA片斷溶解或分散而成的水溶液中添加高沸點溶劑等。

發明內容
本發明提供一種探針介質，其中，包括可特異性結合靶向物質的探針、探針可結合部位及基材可結合部位。
本發明還提供一種探針介質，其中，包括可特異性結合靶向物質的探針、水溶性高分子材料及高沸點溶劑。
本發明還提供一種固定探針的固定方法，其中，該方法是通過點樣法(spotting)將前述探針介質賦予基材上來實現的。通過該探針固定方法制造的探針固定基材的探針，提供作為DNA探針的DNA序列。提供一種檢測靶向物質的檢測方法，其中，該方法使用探針固定基材，它是通過點樣法將探針介質賦予在基材上來固定并得到的。
本發明還提供了一種探針介質，其中，在容器中分別收納了前述探針及將探針固定于基材上的物質，并在固定于基材上時進行混合。
本發明還提供了一種探針介質，它是在容器中分別收納前述探針與水溶性高分子材料及高沸點溶劑，并在固定于基材上時進行混合而成的。
作為本發明的第一實施方式，將探針固定于探針介質及基材上的方法中使用含有具有探針與探針可結合部位的物質、及具有基材上可結合部位的物質的介質。作為本發明的第二實施方式，將探針固定于探針介質及基材上的方法中使用含有探針與水溶性高分子材料及高沸點溶劑的介質。
探針包括單鏈核酸探針、單鏈DNA探針、單鏈RNA探針、單鏈PNA探針等。如果考慮到作為探針介質的核酸探針的穩定性，介質中含有的探針的量，在介質中，例如優選將2mer～500mer、特別是2mer～80mer的核酸探針濃度調整為0.05～500μmol/l、特別是0.05～50μmol/l。這些探針也可以是探針單體，優選在探針末端進行了連接子(linker)修飾的探針。作為連接子修飾，可列舉出生物素化、官能團修飾等。作為官能團，可列舉出胺(NH2)基、羧(COOH)基、巰基(SH)、羥(OH)基等。特別是作為探針官能團，如果考慮到探針官能團合成的難易程度，優選氨基；如果考慮到探針官能團的反應性，優選巰基。
作為探針的可結合部位，沒有特別的限制，但優選與探針末端的連接子結合。作為與探針末端的連接子結合的形態，可列舉出各種例子，但優選化學鍵。作為探針連接子的可結合部位，可列舉出抗生物素蛋白、官能團等。作為官能團，可列舉出環氧基(CHOCH2)、氨基(NH2)、巰基(SH)、順丁烯二酰亞胺基、氯丙基(C3H6Cl)、異氰酸酯基(NCO)等。特別是作為探針可結合的官能團，如果考慮到與探針官能團的結合，優選環氧基、順丁烯二酰亞胺基、氯丙基、異氰酸酯基。作為介質中含有探針的可結合部位的量，由于探針可結合部位不同該量也不同，沒有特別的限制，但如果考慮到與探針的結合性，優選將探針量調整至100～100000當量。
作為基材上可結合部位，沒有特別的限制，但優選牢固地結合于基材上的部位。可結合部位也可為官能團，優選與基材形成化學鍵的官能團。作為結合在基材上的官能團，包括烷氧基甲硅烷基(SiOR)、硅醇基(SiOH)、烷氧基(OR)等。特別是由于容易固定于基材上，優選烷氧基甲硅烷基、硅醇基，但是，當基材上形成氨基、羰基時，優選具有與其有反應性的官能團。硅醇基也可以是通過烷氧基甲硅烷基的水解形成的硅醇基。探針及將探針固定于基材上的物質可以為在介質中通過反應發生結合的物質，但優選在官能團間發生化學反應形成共價鍵的反應。
作為這些探針、探針可結合部位、基材上可結合部位的各種組合，可列舉出各種例子，但作為官能團的具體的組合，可列舉出例如，探針官能團為氨基、探針可結合部位的官能團為環氧基、基材上可結合部位的官能團為硅醇基的組合。此外，還可列舉出探針官能團為巰基、探針可結合部位的官能團為順丁烯二酰亞胺的組合，探針官能團為羰基、探針可結合部位的官能團為氨基、基材上可結合部位的官能團為硅醇基的組合，探針官能團為氨基、探針可結合部位的官能團為異氰酸酯基、基材上可結合部位的官能團為硅醇基的組合。其中，特別是如果考慮到探針官能團合成的難易程度、探針可結合部位的官能團的反應性，優選探針官能團為氨基、探針可結合部位的官能團為異氰酸酯基。這些組合優選通過在介質中混合而進行反應，為了使其反應，也可在一定的條件下進行處理。
單一物質中具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團，且基材上可結合部位的官能團為烷氧基甲硅烷基、硅醇基的情況下，具體的單一物質可列舉出硅烷偶聯劑。硅烷偶聯劑中，烷氧基甲硅烷基通過水解形成硅醇劑。硅烷偶聯劑中與烷氧基甲硅烷基不同的另外1種官能團為上述列舉的環氧基、異氰酸酯基、巰基、氯丙基時，硅烷偶聯劑分別為環氧基硅烷、異氰酸酯基硅烷、巰基硅烷、氯丙基硅烷。這些硅烷偶聯劑根據需要進行水解，并使之與探針混合。
不同的物質中分別含有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團，且探針可結合部位的官能團為順丁烯二酰亞胺基、基材上可結合部位的官能團為烷氧基甲硅烷基、硅醇基時，具體的各種物質的組合可列舉出二元性試劑與硅烷偶聯劑。具體的二元性試劑名稱可列舉出，N-(4-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺、N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺、N-(8-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺、N-(11-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺等。特別是將這些物質作為探針介質處理時，如果適合為水溶性，也可以將它們變為水溶性的N-(4-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)硫代琥珀酰亞胺鈉鹽、N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)硫代琥珀酰亞胺鈉鹽、N-(8-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)硫代琥珀酰亞胺鈉鹽、N-(11-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)硫代琥珀酰亞胺鈉鹽。此外，對于硅烷偶聯劑，硅醇基可以為烷氧基甲硅烷基水解形成的產物。可以列舉出各種可與二元性試劑反應的硅烷偶聯劑，但優選具有氨基的氨基硅烷。這些硅烷偶聯劑根據需要進行水解，并使之與探針混合。
作為水溶性高分子材料，有聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、paogen(パオゲン)、羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素(HEC)、右旋糖苷、支鏈淀粉等。其中，聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為常用材料，且對探針穩定，為優選。當為常用材料的聚乙烯醇(PVA)時，優選根據需要調整聚合度、皂化度。通過調整聚合度、皂化度，調整聚乙烯醇在探針介質中的溶解性、探針介質的粘度、將探針介質點樣于基材上之后的斑點強度、吸濕性等成為可能。具體地說，如果在基材上賦予探針介質沒有問題，優選適當地調整聚合度、皂化度。另外，可將通過在基材上賦予探針介質而形成的探針固定基材的斑點形狀特性、吸濕性等調整至適當的狀態。但是，在聚乙烯醇的聚合度高的情況下，不僅探針介質的粘度會上升，而且由于聚乙烯醇在探針介質中的溶解性下降，將穩定的探針介質賦予在基材上也將變得困難。在聚乙烯醇的皂化度高的情況下，不僅聚乙烯醇在探針介質中的溶解性將下降，由于探針介質的粘度增加，賦予在基材上也將變得困難。作為避免其的方法，可列舉出降低聚乙烯醇濃度的方法，但由于濃度下降會引起探針穩定性、斑點形狀特性、吸濕性等下降，有必要選定適當的聚乙烯醇、并調整其濃度。優選將探針介質中聚乙烯醇的濃度調整至0.001～1wt％。特別優選調整至0.01～0.2wt％。當探針介質中聚乙烯醇的濃度位于上述范圍內時，優選降低聚乙烯醇的聚合度、增加聚乙烯醇的皂化度。作為聚乙烯醇的聚合度、皂化度，優選例如，聚合度200～1700、皂化度87～99mol％。
也可將這種聚乙烯醇事先溶解，并混合于探針介質中。溶解的溶劑可以為乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等有機溶劑，如果考慮到溶解性，優選水、乙醇。溶解方法為將聚乙烯醇混合于水中之后，可通過加溫使不溶物快速溶解。優選在過濾后與探針介質混合，其中，過濾是為了消除溶解的聚乙烯醇中的不溶物。對于溶解了聚乙烯醇的溶液，如果考慮到與探針混合時的探針穩定性，優選pH值為6.0～9.0，特別優選pH值為7.0～8.0。
作為含有探針及將探針固定于基材上的物質的探針介質的介質，優選含水。除水之外介質中含有的有機溶劑可列舉乙二醇、硫二甘醇、甘油、異丙醇、乙醇等。具體的介質可列舉出含水70～95wt％、硫二甘醇0.1～3％、異丙醇5～30wt％。更優選的介質含水80～90wt％、硫二甘醇1～2.5％、異丙醇10～20wt％。
作為高沸點溶劑，有乙二醇、丙二醇、三甘醇、二甘醇、雙丙甘醇、硫二甘醇等。其中，硫二甘醇、雙丙甘醇為常用的材料，也適用于用作點樣用介質，為優選。由于乙二醇類高沸點有機溶劑為高粘性液體，混合時介質的稱量會變得困難。為此，也可事先與異丙醇等低粘性液體混合。這時，作為混合的低粘性液體，可列舉出異丙醇之外的醇類溶劑、水等。作為高沸點溶劑的添加，優選將探針介質賦予于基材上時的斑點形狀特性、吸濕性、干燥性、干燥狀態等調整至適當的狀態。
作為具體的介質，可列舉出含有水70～95wt％、硫二甘醇0.1～3％、異丙醇5～30wt％、聚乙烯醇0.001～1wt％。優選含有水80～90wt％、硫二甘醇1～2.5wt％、異丙醇10～20wt％、聚乙烯醇0.01～0.2wt％。
進而，為了在探針介質中將探針高效地固定于基材上，也可以含有探針固定物質。探針固定物質可以含有底涂劑(primer)、偶聯劑、密封劑、表面處理劑、表面改性劑、偶聯劑與交聯劑的結合物質、偶聯劑與二元性試劑的結合物質等。作為介質中含有物質的量，如果考慮到探針在基材上的固定性，優選在介質中例如，將濃度調整至0.05～50000μmol/l，特別優選10～500μol/l。這些物質也可以是具有探針或與探針官能團可結合的官能團的物質，官能團可以包括環氧基(CHOCH2)、氨基(NH2)、巰基(SH)、順丁烯二酰亞胺基、氯丙基(C3H6Cl)、異氰酸酯基(NCO)。特別是探針官能團優選氨基(NH2)、羧基(COOH)、巰基(SH)、羥基(OH)等。如果考慮到與探針官能團的結合，探針可結合官能團優選環氧基、順丁烯二酰亞胺基、氯丙基等。另外，這些將探針固定于基材上的物質也可以是具有為了固定于基材上的官能團的物質，官能團也可以包括烷氧基甲硅烷基(SiOR)、硅醇基(SiOH)、烷氧基(OR)等。從容易固定于基材上方面考慮，優選烷氧基、硅醇基。硅醇基也可以是通過烷氧基甲硅烷基水解而形成的硅醇基。探針與將探針固定于基材上的物質也可以是在介質中通過反應進行結合的物質，優選在官能團間發生化學反應形成共價鍵。
作為向探針介質中混合水溶性高分子材料的方法，是事先使水溶性高分子材料完全溶解，配制成規定濃度的溶液。優選將調整好的水溶性高分子溶液稱量至規定濃度，并進行混合的方法。邊加溫混合溶液，邊使聚乙烯醇溶解后，過濾，以除去不溶物、異物。由此來配制水溶性高分子水溶液。優選將該水溶性高分子水溶液混合于探針介質中，以使其在探針介質中的濃度為0.01～0.2wt％。
作為混合探針介質的順序，可以列舉出若干。作為第1種方法，是將具有探針及探針可結合部位的官能團與具有基材上可結合部位的官能團的物質事先混合后，添加一定量的作為介質的水、有機溶劑等溶液，混合。根據需要，也可以調整溫度并放置一定的時間，重復進行介質的添加混合。最后，增加未添加或添加量少的溶液至一定比例，由此調制探針介質的方法。混合探針及物質時，要考慮混合會導致反應進行，根據需要，優選調整混合狀態的溫度、混合時間、pH值等。混合探針及物質導致反應進行時，通過預先混合可使物質間的反應更容易充分進行。進而，調整混合可以使探針及物質更容易充分地結合，為優選。另外，在向探針及物質的混合介質中添加、混合溶液時，可在混合探針及物質后，采用依次滴加、混合、調整作為溶液的部分或全部構成介質的水、有機溶劑等的方法，也可以預先混合水、有機溶劑等構成介質的一部分或全部，然后采用依次滴加、混合、調整該混合介質的方法。當探針及物質在混合介質中反應時，如果添加溶液可以進一步促進反應，那么優選調整所添加構成介質的順序、間隔、添加時的狀態。第2種方法僅僅適用于在不同的物質中具有與探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的情況，它是將具有探針可結合部位的官能團的物質，及具有探針或基材上可結合部位的官能團的物質中的任何一方，與介質的部分或全部為水、有機溶劑的溶液混合后，再混合剩下的另一方。當難于將探針或物質混合、溶解于溶液中時，由于該方法可調整混合、溶解的條件，為優選，而且當同時混合會引起預定反應以外的作用時，該方法為優選。特別是當物質為硅烷偶聯劑，且可穩定地混合或/及溶解探針可結合官能團時，由于事先將物質混合、溶解于溶液中可形成足夠的硅醇基，所以優選。作為第3種方法，是分別稱量含有探針及探針可結合部位的官能團與基材上可結合部位的官能團的物質，及溶液的部分或全部的構成介質，放入一個容器中，進行一次混合。該方法適用于不會由于探針、物質及溶液的混合順序不同而引起探針介質特性的變化的情況，由于可以簡化混合步驟，為優選。
另外，雖然將水溶性高分子材料混合于探針介質的順序沒有特別的限制，但優選在將探針與其他的介質混合后，最后進行。
將高沸點溶劑混合于探針介質的方法優選事先稱量至規定濃度，然后進行混合。
雖然將高沸點溶劑混合于探針介質的順序沒有特別的限制，但優選在將探針與其他的介質混合后，最后與水溶性高分子一起混合。
由此得到的探針介質適合作為檢測靶向物質的探針介質。
通過將得到的探針介質點樣于基材上，可以制造探針固定基材。雖然作為用于固定探針的基材沒有特別的限制，但是如果考慮到靶向物質的檢測和材料的常用性，優選玻璃或石英基板材料。具體的材料優選1英寸×3英寸大小的載玻片，如果考慮到探針固定的固定特性等，優選玻璃材質中不合堿性成分的無堿材料載玻片基板或石英玻璃材料。另外，雖然檢測靶向物質的方法不會限制基板形狀等，但是基于檢測方法及裝置等的常用性，優選基板狀態。進而，希望為表面平滑度高的基板材料。
另外，為了將探針均勻且可靠地固定在基材上，優選用來固定探針的基材具有清潔表面。希望在固定探針前，事先清洗基材表面，從而確保表面足夠清潔。作為清潔基材表面的方法，已知有用水洗、用藥液洗、用等離子體洗、用UV臭氧洗等多種方法，作為簡易且均勻的清洗方法，優選用藥液洗。例如，可列舉出使用規定濃度的氫氧化鈉水溶液充分清洗基材表面，以除去附著在基材上的污漬。具體地說，準備好加溫至50℃左右的1mol/l的氫氧化鈉水溶液，在水溶液中擦洗基材表面或邊淋洗水溶液邊刷洗，以確實地除去污漬。除去污漬后，用水充分沖洗殘余的氫氧化鈉。最后，可用氮氣吹拂等除去水分。由此，可得到可均勻且可靠地固定探針介質的基材。
另外，如果探針介質中不含有探針固定物質，優選在基材上進行了探針固定化處理的基材。具體地說，例如有如上述記載的在充分清洗了的基材表面使用硅烷偶聯劑進行過處理的基材。例如，在水、乙醇的混合溶劑中充分攪拌硅烷偶聯劑，在該溶液中浸漬清洗過的基材，之后用水洗去殘留的硅烷偶聯劑，干燥后得到的基材。另外，通過充分攪拌在乙醇中添加了硅烷偶聯劑的溶液，來調制硅烷偶聯劑溶液，利用旋涂法(spin-coating)在清洗過的基材上涂布該溶液。
作為將探針介質點樣在基材上的方法，已知的有幾種。具體的方法有針(pin)法、噴墨(inkjet)法、針和環(pin&ring)法。其中噴墨法可高密度且正確地點樣，為優選的點樣方法。
對于利用噴墨法進行的點樣方法，作為上述探針介質，從噴墨頭噴出探針介質中含有的成分時，只要對將探針及將探針固定在基材上的物質不會有實質性的影響，且是利用噴墨頭就能正常噴在基材上，就沒有特別的限制。例如，噴墨頭可給與介質熱能且具有噴出結構時，作為探針介質中含有的成分，優選甘油、硫二甘醇、異丙醇的液體。更具體地說，作為探針介質，優選含有甘油5～10wt％、硫二甘醇5～10wt％的液體。另外，噴墨頭為利用壓電器件噴出介質的噴墨頭時，作為探針介質中含有的成分，優選含有乙二醇、異丙醇的液體。更具體地說，作為探針介質，優選含有乙二醇5～10wt％、異丙醇0.5～2wt％的液體。
由噴墨頭噴出如此得到的探針介質，并使之附著在基材上時，斑點的形狀為圓形，且噴出的范圍不會擴大。高密度點樣探針介質時，也可有效地抑制與相鄰斑點的連接。另外，添加了水溶性高分子與高沸點溶劑的探針介質即使在點樣后進行干燥，且斑點處于干燥狀態，探針也可沒有問題地進行保存，可檢測靶向物質。進而，在干燥后也可容易地觀察斑點狀態，且可確認在點樣中是否沒有問題地形成了斑點。需要注意的是，本發明的探針介質的特性并不限于上述例子。
對于探針與基材，優選通過在探針與基材間發生反應而結合。通過反應，探針被牢固地固定在基材上。結果，探針被固定在基材上，且可在預定的位置上形成探針的斑點。水溶性高分子材料不會影響探針在基材上的固定，通過將水溶性高分子材料添加在探針介質中，可以延遲點樣后斑點的干燥，因此具有使探針與基材間的反應充分進行的效果。
為了將賦予在基材上的探針介質中所含有的探針固定在一定的位置上，并更確實地防止污染相鄰斑點中所含有的探針，以及將探針牢固地固定在基材上，其有效的手段是利用基材上可結合部位與基材上雙方互相通過化學作用進行結合的方法。作為通過化學作用進行的結合可列舉出各種例子，例如，共價鍵、離子鍵等。為了將探針牢固地固定在基材上，優選共價鍵。
作為優選的官能團，可列舉出，物質側具有硅醇基(SiOH)、基材上具有羥基(OH)的組合。該組合可使通過點樣賦予在基材上的探針介質中所含物質的硅醇基與基材上的硅醇基反應，并將物質固定在基材上。具體的基材優選基材上具有羥基的上述玻璃材料、石英基板材料。
進而，優選探針與探針可結合部位間也通過化學作用進行結合。通過化學作用進行的結合可列舉出共價鍵、離子鍵。為了將探針牢固地固定在基材上，優選共價鍵。結果，探針被固定在基材上，且可在一定的位置上形成探針的斑點。特別是調制了一種探針介質，其中包含具有官能團為氨基的探針、及具有探針可結合部位的官能團為環氧基、基材上可結合部位的官能團為硅醇基的物質，并調制了按規定比例含有甘油、硫二甘醇、異丙醇等的探針溶液。用噴墨頭將該探針溶液點樣在含有官能團為羥基的基材上時，探針溶液在基材上形成穩定大小的斑點。這樣就可以將探針固定在基材上一定的位置。另外，調制了另一種探針介質，其中包含具有官能團為氨基的探針、及具有探針可反應官能團為異氰酸酯基、可與基材上官能團反應的官能團為硅醇基的物質，并調制了含有規定比例的甘油、硫二甘醇、異丙醇等的探針溶液。用噴墨頭將該探針溶液點樣在具有官能團為羥基的基材上時，探針溶液在基材上形成穩定大小的斑點。這樣就可以將探針固定在基材上一定的位置。
另外，優選事先在探針介質中混合水溶性高分子材料聚乙烯醇(PVA)。更優選事先完全使之溶解。將水溶性高分子材料混合在探針介質中，使基材上的斑點狀態更容易觀察，使點樣后的斑點中的探針介質更難于干燥，從而可更確實地使探針介質與基材表面反應，并進行固定。進而，考慮到通過點樣制造的探針固定基材的保存狀態，即使當通過點樣形成的探針介質斑點干燥時，也可高效、且穩定地檢測靶向物質。
例如，調制含有探針的探針介質，使探針濃度達到8μmol/l，其中探針的堿基長為20mer。探針介質使用的是氣泡噴墨打印機(BubbleJet Printer，商品名BJF850；Canon(株)會社制造，但將其改造為可在平板上打印)，將固相與氣泡噴墨頭的噴嘴的間隔設為1.2～1.5mm左右，由該噴嘴噴出時(噴出量約為4微微升(picoliter)，在固相上可形成直徑約50～80μm左右的斑點，而且用放大鏡進行肉眼觀察完全沒有發現液體著彈在固相表面時飛沫產生的斑點(下面稱為隨體斑點(satellite spot))。
另外，用顯微測定用傅立葉變換紅外分光光度計(顯微FT-IR)對上述探針固定基材(固定了不含水溶性高分子材料的探針介質的基材)進行了分析。在斑點以外的部位，可檢測基材中的Si-O鍵峰，但幾乎沒有發現其他的鍵峰。與此相對，在斑點形成部位，不僅可檢測基材的寬峰，而且可檢測極少量的、將探針介質中含有的探針固定在基材上的物質的-CH2-鍵峰。
另外，用熱脫附譜(TDSThermal Desoption Spectrometry)對上述探針固定基材進行了分析。分析時，切斷、提取含有形成了斑點的部位的7mm見方的基板片與未形成斑點的斑點外周部位的7mm見方的基板片，并進行了比較。溫度為25～500℃，升溫速度為每分鐘5℃。比較兩基板片的脫離成分質量的結果為，在斑點形成部位，在150℃以上檢測出大量的CH4、CH3OH等探針及將探針固定在基材上物質的質量。由此，確認了探針介質僅被點樣在斑點部位，而在斑點部位之外沒有賦予探針介質及介質中含有的物質。
另外，用飛行時間二次離子質譜(TOF-SIMSTime ofFlight-Secondary Ion Mass Spectrometer)分析了上述探針固定基材。分析時，對斑點形成部位的附近進行了面掃描、比較。結果，在斑點形成部位檢測出源于DNA的PO2-、PO3-離子。與此相對，在未形成斑點的部分、斑點間隙部，不僅沒有檢測出PO2-、PO3-離子，連源于探針結合部位的官能團的二次離子也沒有檢測到。
這里，利用該探針固定基材，例如以提高檢測靶向物質時的檢測精度(S/N之比)為目的，也可在將該探針固定在固相表面后進行封閉(blocking)，以使該基材上的探針非結合部分不與樣品中含有的靶向物質結合。例如，在2％牛血清白蛋白水溶液中，通過例如2小時左右的浸泡，進行封閉。但是，為了防止標識物質吸附在基材上的探針固定部位之外，考慮到這種防止效果，優選牛血清白蛋白水溶液。需要注意的是，可根據需要實施該封閉步驟，例如，相對于各斑點限定性地將樣品供給于該探針固定基材，且實質上樣品沒有附著在斑點以外的部位時，可不實施該步驟。作為基材的材料不同，斑點以外的部位上樣品的附著也不同。特別是當基材為玻璃、石英時，可不進行封閉處理。但是，當探針介質中不含探針固定物質、在基材上進行了探針固定化處理時，優選進行封閉處理。
這樣制造的探針固定基材，根據其用途，例如可構成為具有含相同探針的多個斑點的形式，也可構成為具有含不同種探針的多個斑點的形式。根據需要，探針的種類、數量、配置可進行適當的變更。然后，可將用這種方法高密度配置了探針的探針固定基材用于之后的靶向物質的檢測、靶向物質堿基序列的推定。例如，用于檢測樣品中可能含有的、堿基序列為已知的靶向物質的單鏈核酸時，以單鏈核酸為探針，其中，該單鏈核酸具有與該靶向物質的單鏈核酸的堿基序列互補的堿基序列。準備好在固相上配置了含有該探針的多個斑點的探針固定基材，在能夠向該探針固定基材的各斑點供給樣品、并使該靶向物質的單鏈核酸與探針雜交的條件下放置后，利用熒光檢測等已知的方法檢測各斑點中有無雜交物。這樣，就可以檢測樣品中有無靶向物質。
另外，用于推定樣品中含有的靶向物質的單鏈核酸中堿基序列時，設定該靶向物質的單鏈核酸中堿基序列的多個候補，以具有該堿基序列組各互補堿基序列的單鏈核酸作為探針，在該基材上點樣。接下來，在能夠向各斑點供給樣品、并使該靶向物質的單鏈核酸與探針雜交的條件下放置后，利用熒光檢測等已知的方法檢測各斑點中有無雜交物。這樣，就可以確定靶向物質的單鏈核酸的堿基序列。另外，作為本發明涉及的探針固定基材的其他用途，例如有適用于篩選識別DNA結合蛋白質的特異性堿基序列和篩選具有可與DNA結合性質的化學物質。
探針介質不僅僅包含上述探針及將探針固定于基材上的物質，也可以在各容器中收納探針及將探針固定于基材上的物質、并在將它們固定于基材上時進行混合。
探針包括單鏈核酸探針、單鏈DNA探針、單鏈RNA探針、單鏈PNA探針等。考慮到作為探針介質的核酸探針的穩定性，作為介質中含有探針的量，在介質中例如，優選將2mer～500mer的核酸探針濃度調整至0.05～500μmol/l，特別優選將2mer～80mer的核酸探針濃度調整至0.5～50μmol/l。這些探針可以具有官能團，例如，可列舉出氨基(NH2)、異氰酸酯基(NCO)、巰基(SH)、羥(OH)基等官能團。特別是作為官能團，考慮到探針官能團的合成難易程度，優選氨基，考慮到探針官能團的反應性，優選巰基。
將探針收納在容器中時，優選不會混入其他雜質的可密閉的容器，而且，為了在固定時容易混合，有必要是可以開封的容器。對于容器的開封沒有特別的限制。作為容器中收納的探針的狀態，沒有特別的限制，既可以是溶液狀，也可以是粉末狀。當官能團為巰基等時，考慮到探針的穩定性，優選保存通過冷凍干燥法進行了粉末化的探針。作為保存狀態，為了確保探針的穩定性，優選冷凍保存，根據保存期間、探針種類、探針官能團等可變更保存狀態。由此，在將探針收納在容器中、并進行保存的狀態下，可在固定在基材上時進行混合。
具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質包括，底涂劑、偶聯劑、密封劑、表面處理劑、表面改性劑等。這些探針可結合部位的官能團包括，環氧基(CHOCH2)、氨基(NH2)、巰基(SH)、順丁烯二酰亞胺基、異氰酸酯基(NCO)、氯丙基(C3H6Cl)等。特別是作為探針可結合部位的官能團，考慮到與探針官能團的結合，優選環氧基、順丁烯二酰亞胺基、異氰酸酯基、氯丙基。另外，這些基材上可結合部位的官能團包括，烷氧基甲硅烷基(SiOR)、硅醇基(SiOH)、烷氧基(OR)等。特別是考慮到固定在基材上的難易程度、反應性，優選烷氧基甲硅烷基、硅醇基。硅醇基也可以是通過烷氧基甲硅烷基水解而形成的硅醇基。探針及探針可結合部位的官能團也可以在介質中通過反應進行結合，但優選在官能團間發生化學反應形成共價鍵。
將具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質收納在容器中時，優選不會混入其他雜質、進而不會由于物質揮發而減量的可密閉或密閉容器，而且，為了在固定時容易混合，優選可容易開封的容器。但是，容器的開封沒有特別的限制。不同的物質具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團時，是將各種物質收納在同一容器中，還是收納在不同容器中，對此沒有特別的限制，但在形成探針介質時優選適當地收納。對容器中收納物質的狀態沒有特別的限制，既可以是溶液狀，也可以是粉末狀。進而，硅醇基為用來固定在基材上的官能團的例子之一，為了形成硅醇基也可以是水解溶液。作為保存狀態，為了確保物質的穩定性，優選室溫保存，根據保存期間等可變更保存狀態。特別地，當為水解溶液時，優選保存中的溫度不上升。另外，根據將探針固定在基材上的物質的官能團，水解時，優選通過調整水解后的pH值來獲得穩定性。
將探針固定在基材上時，混合這些容器中收納的具有探針及探針可結合部位的官能團、基材上可結合部位的官能團的物質時，根據需要也可以添加水等溶液。另外，為了制成探針介質，事先將用來充分混合的物質，例如水等溶劑收納在不同容器中，在調制探針介質時進行混合。
水溶性高分子材料有聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Paogen(パオゲン)、羧甲基纖維素(CMC)、羥乙基纖維素(HEC)、右旋糖苷、支鏈淀粉等。其中，聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為常用材料，且對探針穩定，為優選。作為常用材料的聚乙烯醇(PVA)的情況下，根據需要，優選調整聚合度、皂化度。通過調整聚合度、皂化度，使調整聚乙烯醇在探針介質中的溶解性、探針介質的粘度成為可能。具體地說，如果在基材上賦予探針介質沒有問題，則優選調整聚合度、皂化度以使探針介質具有適當的穩定性。但是，在聚乙烯醇的聚合度及皂化度高的情況下，不僅探針介質的粘度會上升，而且由于聚乙烯醇在探針介質中的溶解性下降，調整探針介質時溶解也將變得困難。作為避免該問題的方法，可列舉出降低聚乙烯醇濃度的方法，但由于濃度下降會引起探針穩定性、斑點形狀特性、吸濕性等下降，有必要選定適當的聚乙烯醇、并調整其濃度。優選將探針介質中聚乙烯醇的濃度調整至0.001～1wt％并收納在容器中。
當這種溶解有困難時，也可將水溶性高分子材料事先溶解，混合于探針介質中。溶解的溶劑可以為乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等有機溶劑，如果考慮到溶解性，優選水、乙醇。溶解方法為將聚乙烯醇混合于水中之后，可通過加溫使不溶物快速溶解。優選在過濾后與探針介質混合，過濾是為了消除溶解的聚乙烯醇中的不溶物。對于溶解了聚乙烯醇的溶液，如果考慮到與探針混合時的探針穩定性，優選調整pH值至6.0～9.0，特別優選調整pH值至7.0～8.0。
將水溶性高分子材料收納在容器中時，優選不會混入其他雜質、進而不會由于物質揮發而減量的可密閉或密閉容器，而且，為了在固定時容易混合，優選可容易開封的容器。作為保存狀態，為了確保物質的穩定性，優選室溫保存，根據保存期間等可變更保存狀態。特別是，當是溶液化的水溶性高分子材料時，優選保存中的溫度不上升。另外，根據將探針固定在基材上的物質的官能團，水解時優選通過調整水解后的pH值來獲得探針穩定性。
作為高沸點溶劑，有乙二醇、丙二醇、三甘醇、二甘醇、雙丙甘醇、硫二甘醇等。其中，硫二甘醇、雙丙甘醇為常用的材料，也適用于用作點樣用介質，為優選。添加高沸點溶劑時，優選進行適當調整以使探針介質賦予在基材上時斑點形狀特性、吸濕性、干燥狀態等為合適的狀態。
將高沸點溶劑收納在容器中時，優選不會混入其他雜質、進而不會由于物質揮發而減量的可密閉或密閉容器，而且，為了在固定時容易混合，優選可容易開封的容器。作為保存狀態，為了確保物質的穩定性，優選室溫保存，根據保存期間等可變更保存狀態。特別是，當是高沸點溶劑時，優選保存中的溫度不上升。
將探針固定在基材上時，混合容器中收納的探針及固定探針物質時，根據需要也可以添加水等溶液。另外，為了制成探針介質，事先將用來充分混合的物質例如水等溶劑收納在其他容器中，在調制探針介質時進行混合。
下面，通過實施例對本發明進行更詳細的說明。
實施例1
(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了序列號為1的單鏈DNA，在其5’末端的羥基上通過磷酸基與六亞甲基結合了氨基，準備式(1)的18倍體的低聚物，用于下面的實驗。
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(1)(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，使用了含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)，將其500μmol/l水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制將上述式(1)的單鏈DNA探針溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液中，使其最終濃度達到約40μmol/l，調制成單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。
然后，在純水中溶解水溶性高分子材料聚乙烯醇(PVA)，使其濃度達到0.5wt％。為了使其完全溶解，在熱水浴中邊加溫至80℃邊攪拌60分鐘。確認沒有不溶物后，過濾，以使點樣時噴嘴不會發生堵塞，調制成PVA水溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加按照上述方法調制的探針結合物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加純水700μl、按照上述方法調制的PVA水溶液100μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板將1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度1.1mm)放入盒中，在事先加溫至60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡玻璃基板10分鐘。接著用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的氫氧化鈉。充分涮洗后，在純水中連盒一起浸泡玻璃基板，超聲清洗10分鐘。超聲清洗后，用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的顆粒。將水洗后的玻璃基板一張一張的用氮氣吹干。為了確認基板是否洗凈，測定了基板上純水的接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。
(5)探針介質的點樣將上述(3)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(4)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，測定了斑點形成部位外周的純水接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)充分清洗上述(5)中制造的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(7)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(1)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(6)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，InC.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為14830。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為614。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例2(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，準備含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)。將該硅烷偶聯劑用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例1的方法，調制成單鏈DNA探針溶液，及PVA溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液10ml，在其中滴加上述硅烷偶聯劑11μl后，混合20分鐘。將混合溶液放置30分鐘后，每次滴加純水5ml，邊反復混合邊滴加總計80ml的純水。接著，滴加按照上述方法調制的PVA水溶液10ml，混合10分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質(由吸收強度計算出正確的濃度)。
(4)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例1的方法，點樣了上述(3)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成了探針固定基材。
(6)封閉處理完全按照上述實施例1的方法，進行了封閉處理。
(7)雜交處理完全按照上述實施例1的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為23400。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為672。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例3(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了序列號為1、2、3及4的單鏈核酸。序列號2～4的單鏈DNA以實施例1中使用的序列號1為基礎，將1個堿基變化的作為序列號2，3個堿基變化的作為序列號3，6個堿基變化的作為序列號4。在序列號1～4的單鏈DNA的5’末端羥基上通過磷酸基與六亞甲基結合了氨基，得到式(1)、(2)、(3)及(4)的18倍體的低聚物，用于下面的實驗。
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3’(2)5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3’(3)5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3’(4)(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，準備含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)。將該硅烷偶聯劑用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制利用與上述實施例2的(3)中記載的方法相同的方法，用上述序列號1～4的單鏈DNA調制成4種探針介質(由吸收強度計算出正確的濃度)。
(4)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣將上述(3)中調制的4種探針介質分別填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的4個墨盒中，將各墨盒裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(4)中準備的玻璃基板，將4種探針介質分別點樣在玻璃基板上4個3×3mm的區域內。需要注意的是，各區域內的點樣圖案與實施例1相同。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理完全按照上述實施例1的方法，進行了封閉處理。
(7)雜交處理完全按照上述實施例1的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為14380。與此相對，對于具有1個堿基錯配序列的式(2)的DNA探針的斑點，其熒光量為8960。而對于具有3個堿基錯配序列的式(3)的DNA探針的斑點，其熒光量僅為完全配對時的一半以下，為2032；對于具有6個堿基錯配序列的式(4)的DNA探針，幾乎觀察不到熒光斑點，斑點相應部分的熒光強度為876。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為637。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。由此可見，可以在DNA陣列基板上特異性檢測出完全互補的單鏈DNA。
實施例4(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，準備含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)。將該硅烷偶聯劑用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例1的方法，調制成單鏈DNA探針溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液10ml，在其中滴加上述硅烷偶聯劑11μl后，混合20分鐘。將混合溶液放置30分鐘后，每次滴加含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％及硫二甘醇7.5wt％的水溶液5ml，邊反復混合邊滴加總計90ml的純水。接著，混合10分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例1的方法，點樣上述(3)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理從1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，取出上述(5)中制造的探針固定基材。接著，將玻璃基板浸漬在盛滿了2％牛血清白蛋白水溶液的容器中，放置2小時，進行了封閉處理。
(7)雜交處理完全按照上述實施例1的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為23400。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為628。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例5(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，將含有具有氯丙基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-703；信越化學工業(株)會社制)的500μmol/l水溶液的pH值調整至4.0，之后室溫下混合30分鐘，調制成探針固定物質溶液。將調制成的探針固定物質溶液用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例1的方法，調制成單鏈DNA探針溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加上述調制的探針固定物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加純水800μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例1的方法，點樣了上述(3)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿了1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理與上述實施例4完全相同，進行了封閉處理。
(7)雜交處理完全按照上述實施例1的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為11320。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為641。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例6(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，準備含有具有氯丙基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-703；信越化學工業(株)會社制)。將該硅烷偶聯劑用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例1的方法，調制成單鏈DNA探針溶液，及PVA溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液10ml，在其中滴加上述硅烷偶聯劑10μl后，混合20分鐘。將混合溶液放置30分鐘后，每次滴加純水5ml，邊反復混合邊滴加總計80ml的純水。接著，滴加按照上述方法配制的PVA水溶液10ml，混合10分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例1的方法，點樣了上述(3)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器內。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理完全按照上述實施例1的方法，進行了封閉處理。
(7)雜交處理完全按照上述實施例1的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為15790。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為608。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例7(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例1的方法準備具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，之后用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例1的方法，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例1的方法，制成探針固定基材。
(6)封閉處理完全不需進行上述實施例1中的封閉處理，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液清洗，潤濕探針固定基材表面，使其可進行均勻的雜交處理。
(7)雜交處理完全按照上述實施例1的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為23400。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為658。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。也沒有發現由于未進行封閉處理而引起的斑點部位以外的熒光強度的增加。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例8(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了序列號為5的單鏈核酸，在用DNA自動合成器合成時，通過使用巰基修飾劑(Thiol-Modifier)(Glen Reaearch公司制造)在其末端引入了巰基(SH)。然后進行了通常的脫保護，回收DNA，在高效液相色譜中純化，得到了式(5)的低聚物，用于下面的實驗。
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’ (5)(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團的物質，將具有順丁烯二酰亞胺基、羥基琥珀酰亞胺酯基(hydroxy-succinimide ester)的二元性試劑N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名sulfo-EMCS；(株)同仁化學研究所制)的500μmol/l水溶液在室溫下攪拌5分鐘，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有基材上可結合部位的官能團的物質，將含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-603；信越化學工業(株)會社制)的20mmol/l水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成基材結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制將上述式(5)的單鏈DNA探針溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中，使其最終濃度達到約40μmol/l，調制成單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加上述(2)中調制的探針結合物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％及硫二甘醇7.5wt％的水溶液700μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(5)清洗基板將1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度1.1mm)放入盒中，在事先加溫至60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡玻璃基板10分鐘。接著用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的氫氧化鈉。充分涮洗后，在純水中連盒一起浸泡玻璃基板，超聲清洗10分鐘。超聲清洗后，用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的顆粒。將水洗后的玻璃基板一張一張的用氮氣吹干。為了確認基板是否洗凈，測定了基板上純水的接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。
(6)探針介質的點樣將上述(4)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(5)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，測定了斑點形成部位外周的純水接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿了1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成探針固定基材。
(7)封閉處理從1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中取出上述(6)中制造的探針固定基材。然后，在盛滿2％牛血清白蛋白水溶液中的容器中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行了封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(5)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理2小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為25730。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為639。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例9(1)探針的合成完全按照上述實施例8的方法準備式(5)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團的物質，準備具有順丁烯二酰亞胺基的二元性試劑N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名sulfo-EMCS；(株)同仁化學研究所制)。將該探針結合物質用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例8的方法，調制成基材結合物質溶液。將調制的基材結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制完全按照上述實施例8的方法，調制成單鏈DNA探針溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液10ml，稱量上述探針結合物質約2.1mg并添加在其中后，混合5分鐘。將混合溶液放置30分鐘后，在探針、探針結合物質的混合溶劑中，每次滴加純水10ml，邊反復混合邊滴加總計80ml的純水。然后，滴加上述(3)中調制的基材結合物質溶液10ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(5)清洗基板完全按照上述實施例8的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例8的方法，點樣了上述(4)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿了1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成探針固定基材。
(7)封閉處理完全按照上述實施例8的方法，進行了封閉處理。
(8)雜交處理完全按照上述實施例8的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為25100。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為769。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例10(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了序列號為5、6、7及8的單鏈核酸。需要注意的是，序列號6～8的單鏈DNA以實施例8中使用的序列號5為基礎，將1個堿基變化的作為序列號6，3個堿基變化的作為序列號7，6個堿基變化的作為序列號8。在用DNA自動合成器合成時，通過巰基修飾劑(Thiol-Modifier)(Glen Reaearch公司制造)在序列號5～8的單鏈DNA末端引入了巰基(SH)。然后進行了通常的脫保護，回收DNA，在高效液相色譜中純化，得到了式(6)、(7)及(8)的低聚物，用于下面的實驗。
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3’(6)5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3’(7)5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3’(8)(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例8的方法，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例8的方法，調制成基材結合物質溶液。將調制的基材結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制完全按照上述實施例8的方法，調制成單鏈DNA探針溶液。
按照上述實施例8中(4)記載的方法，使用上述序列號5～8的單鏈DNA，調制成4種探針介質(由吸收強度計算出正確的濃度)。
(5)清洗基板完全按照上述實施例8的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣將上述(4)中調制的4種探針介質分別填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)用的4個墨盒中，將各墨盒分別裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(5)中準備的玻璃基板，將4種探針介質分別點樣在玻璃基板上4個3×3mm的區域內。需要注意的是，各區域內點樣圖案與實施例8相同。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿了1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成固定了4種探針的探針固定基材。
(7)封閉處理完全按照上述實施例8的方法，進行了封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述實施例8中記載的式(5)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理2小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；AxonInstruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為26120。與此相對，對于具有1個堿基錯配序列的式(6)的DNA探針的斑點，其熒光量為12870。而對于具有3個堿基錯配序列的式(7)的DNA探針的斑點，其熒光量僅為完全配對時的一半以下，為4220；對于具有6個堿基錯配序列的式(8)的DNA探針，幾乎觀察不到熒光斑點，斑點相應部分的熒光強度為791。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為675。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。由此可見，可以在DNA陣列基板上特異性檢測完全互補的單鏈DNA。
實施例11(1)探針的合成完全按照上述實施例8的方法準備式(5)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例8的方法，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例8的方法，調制成基材結合物質溶液。將調制的基材結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制完全按照上述實施例8的方法，調制成探針介質。
(5)清洗基板完全按照上述實施例8的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例8的方法，制成探針固定基材。
(7)封閉處理完全不需進行上述實施例8中的封閉處理，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針固定基材表面，使其可進行均勻的雜交處理。
(8)雜交處理完全按照上述實施例8的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為24380。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為783。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。也沒有發現由于未進行封閉處理而引起的斑點部位以外的熒光強度的增加。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例12(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了序列號為9的單鏈DNA探針，在其5’末端的羥基上通過磷酸基及六亞甲基結合了氨基，準備式(9)的18倍體的低聚物，用于下面的實驗。
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(9)(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團的物質，將具有順丁烯二酰亞胺的二元性試劑N-(8-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名sulfo-HMCS；(株)同仁化學研究所制)的500μmol/l水溶液在室溫下攪拌5分鐘，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有基材上可結合部位的官能團的物質，將含有具有巰基的硅烷化合物(γ-巰丙基甲基二甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-802；信越化學工業(株)會社制)的20mmol/l水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成基材結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制將上述式(9)的單鏈DNA探針溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液中，使其最終濃度達到約40μmol/l，調制成單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。
然后，在純水中溶解水溶性高分子材料聚乙烯醇(PVA)，使其濃度達到0.5wt％。為了使其完全溶解，在熱水浴中，邊加溫至80℃邊攪拌60分鐘。確認沒有不溶物后，過濾，以使點樣時噴嘴不會發生堵塞，調制成PVA水溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加上述(2)中調制的探針結合物質溶液100μl后，混合5分鐘。然后，滴加上述(3)中調制的探針溶液100μl，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加純水600μl、按照上述方法調制的PVA水溶液100μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(5)清洗基板完全按照上述實施例8的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣將上述(4)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(5)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，測定了斑點形成部位外周的純水接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(7)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)充分清洗上述(5)中制造的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述記載的式(9)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理2小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為18710。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為664。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例13(1)探針的合成完全按照上述實施例12的方法準備式(5)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)完全按照上述實施例12的方法，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)
完全按照上述實施例12的方法，調制成基材結合物質溶液。將調制的基材結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制完全按照上述實施例12的方法，調制成單鏈DNA探針溶液及PVA溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液10ml，稱量上述探針結合物質約2.1mg并添加在其中后，混合5分鐘。將混合溶液放置30分鐘后，在探針、探針結合物質的混合溶劑中，每次滴加純水10ml，邊反復混合邊滴加總計70ml的純水。然后，滴加上述(3)中調制的基材結合物質溶液10ml，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，之后滴加按照上述方法調制的PVA水溶液10ml，混合5分鐘。混合結束后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(5)清洗基板完全按照上述實施例8的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例8的方法，點樣上述(4)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器內。由此制成探針固定基材。
(7)封閉處理完全按照上述實施例12的方法，進行了封閉處理。
(8)雜交處理完全按照上述實施例12的方法，進行雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為17970。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為723。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例14(1)探針的合成完全按照上述實施例12的方法準備式(9)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)具有探針可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團的物質，將具有順丁烯二酰亞胺基、羥基琥珀酰亞胺酯基的二元性試劑N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名sulfo-EMCS；(株)同仁化學研究所制)的500μml/l水溶液在室溫下攪拌5分鐘，調制成探針結合物質溶液。將調制的探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)具有基材上可結合部位的官能團的物質(基材結合物質)為了調制具有基材上可結合部位的官能團的物質，將含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-603；信越化學工業(株)會社制)的20mmol/l水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成基材結合物質溶液。將調制的基材結合物質溶液用于下面的實驗。
(4)探針介質的調制將上述式(9)的單鏈DNA探針溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中，使其最終濃度達到約40μmol/l，調制成單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加上述(2)中調制的探針結合物質溶液100μl后，混合5分鐘。然后，滴加上述(3)中調制的基材結合物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％及硫二甘醇7.5wt％的水溶液700μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(5)清洗基板將1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度1.1mm)放入盒中，在事先加溫至60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡玻璃基板10分鐘。接著用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的氫氧化鈉。充分涮洗后，在純水中連盒一起浸泡玻璃基板，超聲清洗10分鐘。超聲清洗后，用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的顆粒。將水洗后的玻璃基板一張一張的用氮氣吹干。為了確認基板是否洗凈，測定了基板上純水的接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。
(6)探針介質的點樣將上述(4)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(5)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，測定了斑點形成部位外周的純水接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿了1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成探針固定基材。
(7)封閉處理從1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中取出上述(6)中制造的探針固定基材。然后，在盛滿2％牛血清白蛋白水溶液的容器中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行了封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(9)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理2小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(9)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為25730。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為639。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例15(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。使用單鏈DNA探針時，將其分注在微管中。分注使每根微管的單鏈DNA探針量達到17.53nmol后，使之干透，得到單鏈DNA探針。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，準備含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)。將上述環氧硅烷偶聯劑作為探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制在分注了上述式(1)的單鏈DNA探針的、完全干燥的微管中，滴加探針結合物質環氧硅烷偶聯劑10μl，并混合。然后，滴加純水50μl，并混合。充分混合5分鐘后，靜置30分鐘。
然后，在上述微管中滴加高沸點溶劑乙二醇500μl、乙醇500μl，之后混合1分鐘。
接下來，滴加濃度為0.5wt％的水溶性高分子溶液聚乙烯醇(PVA)水溶液100μl，之后，混合1分鐘。最后，滴加純水，使探針介質的總量達到2000μl，混合5分鐘。混合后放置60分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板將1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度1.1mm)放入盒中，在事先加溫至60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡玻璃基板10分鐘。接著用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的氫氧化鈉。充分涮洗后，在純水中連盒一起浸泡玻璃基板，超聲清洗10分鐘。超聲清洗后，用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的顆粒。將水洗后的玻璃基板一張一張的用氮氣吹干。為了確認基板是否洗凈，測定了基板上純水的接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。
(5)探針介質的點樣將上述(3)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(5)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，測定了斑點形成部位外周的純水接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)充分清洗上述(5)中制造的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(7)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(1)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(6)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為15750。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為108。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例16(1)探針的合成完全按照上述實施例15的方法，將單鏈DNA探針分注在微管中，并使其干透。
(2)具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質(探針結合物質)為了調制具有探針可結合部位的官能團及基材上可結合部位的官能團的物質，使用了含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(3-異氰酸丙酯基三乙氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBE-9007；信越化學工業(株)會社制)。將上述異氰酸酯硅烷偶聯劑作為探針結合物質溶液用于下面的實驗。
(3)探針介質的調制在分注了上述式(1)的單鏈DNA探針的、完全干燥了的微管中，滴加探針結合物質異氰酸酯硅烷偶聯劑20μl，并混合。然后，滴加純水50μl，并混合。充分混合5分鐘后，靜置30分鐘。
然后，在上述微管中滴加高沸點溶劑乙二醇500μl、乙醇500μl，之后混合1分鐘。
接下來，滴加濃度為0.5wt％的水溶性高分子溶液聚乙烯醇(PVA)水溶液100μl，之后，混合1分鐘。最后，滴加純水，使探針介質的總量達到2000μl，混合5分鐘。混合后，放置60分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例15的方法清洗基板，得到了基板。
(5)探針介質的點樣將上述(3)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(4)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，測定了斑點形成部位外周的純水接觸角。結果，在基板的所有部位都約為5°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)充分清洗上述(5)中制造的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(7)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(1)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(6)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為15750。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為108。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
比較例1(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了序列號為10的單鏈核酸，在用DNA自動合成器合成時，通過巰基修飾劑(Thiol-Modifier)(Glen Reaearch公司制造)在其末端引入了巰基(SH)。然后進行了通常的脫保護，回收DNA，在高效液相色譜中純化，得到了式(10)的低聚物，用于下面的實驗。
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(10)(2)探針介質的調制完全按照上述實施例1的方法，調制式(10)的單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。將調制的探針溶液用于下面的實驗。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％及硫二甘醇7.5wt％的水溶液900μl。混合5分鐘后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(3)清洗基板完全按照上述實施例1的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(4)探針固定化處理將含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-603；信越化學工業(株)會社制)的1wt％水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成硅烷偶聯劑水溶液。接下來，室溫(25℃)下，在該水溶液中浸泡上述(3)中清洗的玻璃基板20分鐘后，用流水充分沖洗，除去殘留的硅烷偶聯劑水溶液。用氮氣吹拂沖洗過的基板兩面，使其干燥。然后，在加熱至120℃的烘箱中烘烤基板1小時，使其完成硅烷偶聯處理。然后，稱量N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名EMCS；(株)同仁化學研究所制)2.7mg，將其溶解于1∶1的二甲基亞砜(DMSO)/乙醇溶液中，使其最終濃度達到0.3mg/ml，將EMCS溶液備用。室溫下，在該EMCS溶液中浸漬進行了硅烷偶聯處理的基板30分鐘。用DMSO及乙醇的混合溶劑及乙醇依次清洗從EMCS溶液中取出的基板，之后，在氮氣環境下使其干燥。由此完成了探針固定化處理。為了確認探針固定化處理的效果，測定了純水接觸角。結果發現，基板上的接觸角為25～30°。由該結果確認了在基板上確切地進行了固定化處理。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例1的方法，點樣上述(2)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。另外，為了確認探針固定化處理的效果，測定了純水接觸角。結果發現，基板上的接觸角為25～30°。由該結果確認了在斑點部位之外，沒有發生探針介質等引起的污染。將點樣結束后的玻璃基板浸漬在盛滿了1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)的容器中，連容器一起放入冰箱，冷藏保存(4℃)。由此制成探針固定基材。
(6)封閉處理完全按照上述實施例1的方法，進行了封閉處理。
(7)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(10)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(6)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(8)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為12790。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為792。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例17(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用與實施例8相同的方法，合成了式(5)的單鏈DNA探針。
(2)水溶性高分子材料選擇聚乙烯醇(PVA)作為水溶性高分子材料。稱量5g含有聚乙烯醇(PVA)的Poval(商品名Poval PVA-117；(株)Kuraray公司制)放入燒杯中。該聚乙烯醇的聚合度為1700，皂化度為98.0～99.0mo1％。在其中加入495g純水，使之溶解，制成了濃度為1.0wt％的Poval水溶液。溶解時，為了使其完全溶解，在熱水浴中邊加溫至80℃邊攪拌60分鐘。確認沒有不溶物后，過濾，以使點樣時不會發生噴嘴堵塞的現象。過濾使用的是0.22μm的膜過濾器。如上所述，調制成PVA水溶液。
(3)探針介質的調制將上述式(5)的單鏈DNA探針溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中，使其最終濃度達到約40μmol/l，調制成單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。
然后，作為探針固定物質，將含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-603；信越化學工業(株)會社制)的500μmol/l水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成氨基硅烷水溶液。然后，將具有順丁烯二酰亞胺基、羥基琥珀酰亞胺酯基的二元性試劑N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名sulfo-EMCS；(株)同仁化學研究所制)的500μmol/l水溶液在室溫下攪拌5分鐘，調制成EMCS水溶液。等容量混合上述氨基硅烷水溶液與EMCS水溶液，攪拌5分鐘，由此得到了探針固定物質溶液。將調制的探針固定物質溶液用于下面的實驗。準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加按照上述方法調制的探針固定物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加純水700μl、按照上述方法調制的水溶性高分子材料PVA水溶液100μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板將1英寸見方的玻璃基板放入盒中，在事先加溫至60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡玻璃基板10分鐘。接著用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的氫氧化鈉。充分涮洗后，在純水中連盒一起浸泡玻璃基板，超聲清洗10分鐘。超聲清洗后，用流動的純水充分涮洗，水洗除去附著在玻璃基板及盒上的顆粒。將水洗后的玻璃基板一張一張的用氮氣吹干。
(5)探針介質的點樣將上述(3)中調制的探針介質填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)的墨盒中，裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(4)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(6)保存在干燥器內保存上述(5)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(7)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗上述(6)中保存的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(5)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經封閉處理的探針固定基材，室溫(25℃)下進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為15830。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為611。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例18(1)探針的合成完全按照上述實施例17的方法準備單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料完全按照上述實施例17的方法，配制了水溶性高分子材料水溶液。水溶性高分子材料使用的是含有聚乙烯醇(PVA)的Poval(商品名PovalPVA-117；(株)Kuraray公司制)。該聚乙烯醇的聚合度為1700，皂化度為98.0～99.0mol％。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例17的方法，調制成探針溶液。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％及硫二甘醇7.5wt％的水溶液800μl。滴加按照上述方法調制的水溶性高分子材料水溶液100μl后，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，得到了探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針固定化處理將含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-603；信越化學工業(株)會社制)的1wt％水溶液在室溫下攪拌30分鐘，調制成硅烷偶聯劑水溶液。接下來，室溫(25℃)下，在該水溶液中浸泡上述(4)中清洗的玻璃基板20分鐘后，用流水充分沖洗，除去殘留的硅烷偶聯劑水溶液。用氮氣吹拂沖洗過的基板兩面，使其干燥。然后，在加熱至120℃的烘箱中烘烤基板1小時，使其完成硅烷偶聯處理。然后，稱量N-(6-順丁烯二酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺鈉鹽(商品名EMCS；(株)同仁化學研究所制)2.7mg，將其溶解于1∶1的二甲基亞砜(DMSO)/乙醇溶液中，使其最終濃度達到0.3mg/ml，將EMCS溶液備用。室溫下，在該EMCS溶液中浸漬進行了硅烷偶聯處理的基板30分鐘。用DMSO及乙醇的混合溶劑及乙醇依次清洗從EMCS溶液中取出的基板，之后，在氮氣環境下使其干燥。由此完成了探針固定化處理。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，點樣了上述(3)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(7)保存在干燥器內保存上述(6)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(8)封閉處理完全按照上述實施例17的方法，進行了封閉處理。
(9)雜交處理完全按照上述實施例17的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(10)結果解析上述(9)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為11520。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為659。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例19(1)探針的合成合成了實施例(10)中所用的式(5)～(8)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料完全按照上述實施例17的方法，調制成PVA水溶液。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例17的方法，調制成單鏈DNA探針溶液。
按照上述實施例17中(3)記載的方法，用上述式(5)～(8)的單鏈DNA，調制成4種探針介質(由吸收強度計算出正確的濃度)。
(4)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣將上述(3)中調制的4種探針介質分別填充至氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)用的4個墨盒中，將各墨盒分別裝在氣泡噴頭上。需要注意的是，這里使用的氣泡噴墨打印機(商品名BJF850；Canon(株)會社制造)已經被改造為能夠在平板上打印。然后，在該打印機上裝上上述(4)中準備的玻璃基板，將探針介質點樣在玻璃基板上。這里，氣泡噴頭的液體噴出面與玻璃基板的液體附著面間的距離為1.2～1.5mm。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成固定了4種探針的探針固定基材。
(6)保存在干燥器內保存上述(5)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(7)封閉處理完全不需進行上述實施例17中的封閉處理，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗基材表面，使其可進行均勻的雜交處理。
(8)雜交處理完全按照上述實施例17的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(7)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為15120。與此相對，對于具有1個堿基錯配序列的式(6)的DNA探針的斑點，其熒光量為9030。而對于具有3個堿基錯配序列的式(7)的DNA探針的斑點，其熒光量僅為完全配對時的一半以下，為3423；對于具有6個堿基錯配序列的式(8)的DNA探針，幾乎觀察不到熒光斑點，斑點相應部分的熒光強度為973。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為653。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。由此可見，可以在DNA陣列基板上特異性檢測完全互補的單鏈DNA。
實施例20(1)探針的合成作為可特異性結合靶向物質的探針，使用了實施例1中使用的式(1)的單鏈DNA探針。利用DNA自動合成器合成了式(5)的單鏈DNA探針。需要注意的是，在式(1)的單鏈DNA末端的5’末端的羥基上通過磷酸基與六亞甲基結合了氨基，準備其18倍體的低聚物，用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料選擇聚乙烯醇(PVA)作為水溶性高分子材料。稱量5g含有聚乙烯醇(PVA)的Poval(商品名Poval PVA-217E；(株)Kuraray公司制)放入燒杯中。該聚乙烯醇的聚合度為1700，皂化度為87.0～89.0mol％。在其中加入495g純水，使之溶解，制成了濃度為1.0wt％的Poval水溶液。溶解時，為了使其完全溶解，在熱水浴中邊加溫至80℃邊攪拌60分鐘。確認沒有不溶物后，過濾，以使點樣時不會發生噴嘴堵塞的現象。過濾使用的是0.22μm的膜過濾器。如上所述，調制成PVA水溶液。
(3)探針介質的調制將上述式(5)的單鏈DNA探針溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中，使其最終濃度達到約40μmol/l，調制成單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。
然后，作為探針固定物質，將含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)的500μmol/l水溶液在室溫下攪拌30分鐘，得到了探針固定物質溶液。將調制的探針固定物質溶液用于下面的實驗。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加按照上述方法調制的探針固定物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加純水700μl、按照上述方法調制的水溶性高分子材料PVA水溶液100μl，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，在探針介質的基材上進行了點樣，制成探針固定基材。
(6)保存在干燥器內保存上述(5)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(7)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗上述(6)中保存的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(1)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經過了封閉處理的探針固定基材，在室溫下(25℃)進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；AxonInstruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為17110。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為731。與此相對，對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例21(1)探針的合成完全按照上述實施例17的方法準備式(1)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料完全按照上述實施例17的方法，調制成PVA水溶液。
(3)高沸點溶劑選擇丙二醇(1，2-丙二醇；Kishida化學(株)會社制)作為高沸點溶劑。稱量丙二醇5.2 g、異丙醇(2-丙醇；Kishida化學(株)會社制)4g，相互混合。考慮到調制探針介質時的萃取、混合性，混合了異丙醇。如上所述，調制成高沸點溶液。
(4)探針介質的調制將上述式(1)的單鏈DNA探針分注在微管中，使平均每根微管中的濃度達到17.53nmol，使其干燥，準備裝有單鏈DNA探針的微管。
準備好1根裝有上述分注了單鏈DNA探針的微管，在其中滴加50μl純水后，攪拌3分鐘，使DNA充分溶解。在其中滴加作為探針固定物質的含有具有環氧基的硅烷化合物(γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBM-403；信越化學工業(株)會社制)20μl后，混合10分鐘。將混合溶液靜置20分鐘后，滴加上述水溶性高分子材料PVA水溶液100μl、高沸點溶液1400μl，混合5分鐘。最后滴加純水430μl，混合5分鐘后，靜置30分鐘。由此調制成探針介質。
(5)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，在探針介質的基板上進行了點樣，制成探針固定基材。
(7)保存在干燥器內保存上述(6)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
另外，為了確認作為探針固定基材的干燥保存特性，80℃下在熱板上干燥固探針固定基材5分鐘后，同樣在干燥器中保存7天。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(1)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬探針固定基材，在恒溫箱中(45℃)進行雜交處理2小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為12970。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為131。與此相對，對于80℃下熱板上干燥了5分鐘的探針固定基材而言，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針斑點在532nm處的熒光強度為13540。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為96。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
實施例22(1)探針的合成完全按照上述實施例20的方法準備式(1)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料完全按照上述實施例17的方法，調制成PVA水溶液。
(3)高沸點溶劑選擇二甘醇(1，2-丙二醇；Kishida化學(株)會社制)作為高沸點溶劑。稱量丙二醇5.6g、異丙醇(2-丙醇；Kishida化學(株)會社制)7.9g，相互混合。考慮到調制探針介質時的萃取、混合性，混合了異丙醇。如上所述，調制成高沸點溶劑。
(4)探針介質的調制將上述式(1)的單鏈DNA探針分注在微管中，使平均每根微管中的濃度達到17.53nmol，使其干燥，準備裝有單鏈DNA探針的微管。
準備好1根裝有上述分注了單鏈DNA探針的微管，在其中滴加50μl純水后，攪拌3分鐘，使DNA充分溶解。作為固定物質，在其中滴加含有具有異氰酸酯基的硅烷化合物(γ-異氰酸丙酯基三乙氧基硅烷)的硅烷偶聯劑(商品名KBE-9007；信越化學工業(株)會社制)20μl后，混合10分鐘。將混合溶液靜置20分鐘后，滴加上述水溶性高分子材料PVA水溶液100μl、高沸點溶液1400μl，混合5分鐘。最后滴加純水430μl，混合5分鐘后，靜置30分鐘。由此調制成探針介質。
(5)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，在探針介質的基板上進行了點樣，制成探針固定基材。
(7)保存在干燥器內保存上述(6)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
另外，為了確認作為探針固定基材的干燥保存特性，80℃下在熱板上干燥探針固定基材5分鐘后，同樣在干燥器中保存7天。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(1)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬探針固定基材，在恒溫箱中(45℃)進行雜交處理2小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，對于在干燥器中保存了7天的探針固定基材而言，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)DNA探針的斑點在532nm處的熒光強度為17790。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為89。與此相對，對于80℃下在熱板上干燥了5分鐘的探針固定基材而言，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針斑點在532nm處的熒光強度為18340。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為81。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
比較例2(1)探針的合成完全按照上述實施例17的方法準備式(5)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料為了確認水溶性高分子材料產生的效果，不使用水溶性高分子材料制成探針固定介質基材。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例17的方法，調制成式(5)的單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。然后，按照實施例17的方法，調制成由氨基硅烷及二元性試劑組成的探針固定物質溶液。將調制的探針固定物質溶液用于下面的實驗。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加按照上述方法調制的探針固定物質溶液100μl后，混合5分鐘。將混合溶液放置10分鐘后，滴加800μl的純水，混合5分鐘。混合后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，在探針介質的基板上進行了點樣，制成探針固定基材。
(6)保存在干燥器內保存上述(5)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(7)封閉處理用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液充分清洗上述(6)中保存的探針固定基材，潤濕探針固定基材，使其可進行均勻的封閉處理。然后，在2％牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板，放置2小時，進行封閉處理。
(8)雜交處理用DNA自動合成器合成了單鏈DNA，它具有與上述(1)中記載的式(5)的單鏈DNA探針互補的堿基序列，在5’末端結合了若丹明(rhodamine)，得到了標記的單鏈DNA探針。將該標記過的單鏈DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，使其最終濃度達到1μM，在該溶液中浸漬上述(7)中得到的、經過封閉處理的探針固定基材，室溫下(25℃)進行雜交處理3小時。之后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(9)結果解析上述(8)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為1427。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為697。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。由此可見，當使用不含水溶性高分子材料的探針介質時，未得到完全配對時斑點部位的熒光強度，未能有效地進行檢測。
比較例3(1)探針的合成完全按照上述實施例1的方法準備式(5)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料為了確認水溶性高分子材料產生的效果，不使用水溶性高分子材料制成探針固定介質材料。
(3)探針介質的調制完全按照上述實施例17的方法，調制成式(5)的單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。將調制的探針溶液用于下面的實驗。
準備好按照上述方法調制的探針溶液100μl，在其中滴加含有甘油7.5wt％、尿素7.5wt％及硫二甘醇7.5wt％的水溶液900μl。混合5分鐘后，放置30分鐘，調制成探針介質。
(4)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(5)探針固定化處理完全按照上述實施例18的方法，在洗凈了的玻璃基板上進行了探針固定化處理。
(6)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，點樣了上述(3)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
(7)保存在干燥器內保存上述(6)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(8)封閉處理完全按照上述實施例17的方法，進行了封閉處理。
(9)雜交處理完全按照上述實施例17的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(10)結果解析上述(9)中的熒光掃描儀評價結果發現，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為1527。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為792。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
比較例4(1)探針的合成完全按照上述實施例20的方法準備式(1)的單鏈DNA探針，之后用于下面的實驗。
(2)水溶性高分子材料為了確認水溶性高分子材料產生的效果，不使用水溶性高分子材料制成探針固定介質材料。
(3)高沸點溶劑為了確認高沸點溶劑產生的效果，不使用高沸點溶劑制成探針固定介質基材。
(4)探針介質的調制完全按照上述實施例20的方法，調制成式(1)的單鏈DNA探針溶液(由吸收強度計算出正確的濃度)。替代上述(2)中使用的水溶性高分子材料PVA而使用純水，替代上述(3)中的高沸點溶劑而使用異丙醇。將調制的探針溶液用于下面的實驗。
(5)清洗基板完全按照上述實施例17的方法清洗基板，并準備玻璃基板。
(6)探針固定化處理完全按照上述實施例17的方法，在洗凈了的玻璃基板上進行了探針固定化處理。
(7)探針介質的點樣完全按照上述實施例17的方法，點樣了上述(4)中調制的探針介質，制成探針固定基材。點樣結束后，用顯微鏡觀察玻璃基板，確認了在玻璃基板表面上形成了矩陣狀的斑點排列。將點樣結束后的玻璃基板靜置在干燥器中。由此制成探針固定基材。
另外，對于部分探針固定基材，80℃下進行熱板處理5分鐘后，靜置于干燥器內。
(8)保存在干燥器內保存上述(7)中制造的探針固定基材7天。在此期間，將濕度、溫度分別調整至35％以下和25℃。
(9)雜交處理完全按照上述實施例17的方法，進行了雜交處理。之后，用1MNaCl/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗探針陣列，沖洗未與探針核酸雜交的單鏈DNA探針。然后，用純水除去多余的鹽分后，用氮氣吹干探針固定基材。接下來，用熒光掃描儀(商品名GenePix 4000B；Axon Instruments，Inc.制造)評價了該探針固定基材的斑點的熒光強度。評價時，將激光功率設為100％，PMT設為400V。
(10)結果解析上述(9)中的熒光掃描儀評價結果發現，對于在干燥器中保存了7天的探針固定基材而言，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(1)的DNA探針的斑點，在532nm處的熒光強度為4276。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為89。與此相對，對于80℃下在熱板上干燥了的探針固定基材而言，與標記過的單鏈DNA探針完全配對的式(5)的DNA探針斑點，其在532nm處的熒光強度為1286。另外，觀察DNA探針斑點以外的熒光強度，為81。對于熒光下觀察到的各DNA探針斑點的狀態，各斑點形狀大致為圓形，在點樣了同一探針介質的斑點間，幾乎看不到熒光強度的差異。另外，可觀察到相鄰斑點的間隔大致均等，斑點間隔約為200μm，成格子狀排列。
需要注意的是，作為序列號1～10的其他特征，附件序列表記載的序列表內容如下。
序列表<110>佳能株式會社<120>探針介質<130>CFO16889WO<140>
<141>
<150>JP <151>2001-12-26<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<220>
<223>發明人岡田良克；龜山誠；巖田研逸<400>1actggccgtc gttttaca 18<210>2<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>2actggccgtt gttttaca18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>3actggccgct tttttaca18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>4actggcatct tgtttaca18
<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>5actggccgtc gttttaca 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>6actggccgtt gttttaca18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物
<400>7actggccgct tttttaca 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>8actggcatct tgtttaca 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>9actggccgtc gttttaca 18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述用于探針的低聚物<400>10actggccgtc gttttaca 18
權利要求
1.一種探針介質，它是用來配置在基板上的探針介質，其中含有具有可特異性結合靶向物質的探針及探針可結合部位的物質，及具有基材表面可結合部位的物質。
2.權利要求1所述的探針介質，其中所述具有探針可結合部位的物質與所述具有基材表面可結合部位的物質為同一物質。
3.權利要求1所述的探針介質，其中所述具有探針可結合部位的物質與所述具有基材表面可結合部位的物質為不同物質，為單一化合物。
4.權利要求1所述的探針介質，其中所述可結合部位為官能團。
5.權利要求1所述的探針介質，其中所述結合為通過化學作用形成的共價鍵、離子鍵、包括靜電吸附的物理吸附中的任一種。
6.固定了探針的基材的制造方法，包括以下步驟準備基材的步驟；將探針介質賦予在基材上的步驟，其中探針介質含有具有可特異性結合靶向物質的探針及探針可結合部位的物質及/或具有基材表面可結合部位的物質。
7.DNA陣列的制造方法，包括以下步驟準備基板的步驟；將DNA探針介質賦予在基材上的步驟，其中DNA探針介質含有具有可特異性結合靶向物質的DNA探針及與所述DNA探針可結合部位的物質及/或具有基材表面可結合部位的物質。
8.靶向物質的檢測方法，包括以下步驟準備基材的步驟；將探針介質賦予在基材上的步驟，其中探針介質含有具有可特異性結合靶向物質的探針及探針可結合部位的物質及/或具有基材表面可結合部位的物質；及利用固定了所述探針的基材來檢測靶向物質的步驟。
9.探針介質的制造方法，包括以下步驟準備探針、及所述具有探針可結合部位的物質、及/或具有基材表面可結合部位的物質的步驟；及將分別含有包含前述可結合部位的物質的溶液收納在容器中的步驟；當將所述探針固定在基材上時，混合探針和所述具有可結合部位的物質的步驟。
10.探針介質，其中含有可特異性結合靶向物質的探針、水溶性高分子材料及高沸點溶劑。
11.權利要求10所述的探針介質，其中所述水溶性高分子材料為聚乙烯醇。
12.權利要求10所述的探針介質，其中所述高沸點溶劑為乙二醇類高沸點有機溶劑。
13.權利要求10所述的探針介質，其中所述探針為DNA探針。
14.探針的固定方法，包括以下步驟準備基材的步驟；將探針介質賦予在基材上的步驟，其中所述探針介質含有可特異性結合靶向物質的探針、水溶性高分子材料及高沸點溶劑。
15.DNA陣列的制造方法，包括以下步驟準備基板的步驟；將探針介質賦予在基板上的步驟，其中所述探針介質含有可特異性結合靶向物質的探針、水溶性高分子材料及高沸點溶劑。
16.檢測方法，其中，使用通過點樣法將權利要求10記載的探針介質賦予在基材上而固定得到的探針固定基材，來檢測靶向物質。
17.權利要求10所述的探針介質，是將所述探針、所述水溶性高分子材料及該高沸點溶劑分別收納在容器中，在固定于基材上時混合而成。
18.權利要求17所述的探針介質，其特征在于，所述水溶性高分子材料及高沸點溶劑是改善探針固定基材保存特性的物質。
19.DNA陣列，其中作為DNA探針，是利用權利要求14記載的探針固定方法制造的探針固定基材的探針。
全文摘要
一種探針介質，包括可特異性結合靶向物質的探針、及具有探針可結合部位的物質、及/或具有基材表面可結合部位的物質。固定了探針的基材的制造方法包括，準備基材的步驟及將探針介質賦予在基材上的步驟。DNA序列的制造方法包括，準備基材的步驟及將探針介質賦予在基材上的步驟。靶向物質的檢測方法包括，準備基材的步驟、將該探針介質賦予在基材上的步驟及使用固定了探針的基材來檢測靶向物質的步驟。另外，探針介質的制造方法包括，準備探針、含有探針可結合部位的物質、及具有基材表面可結合部位的物質的步驟；將分別含有包含該可結合部位的物質的溶液收納在容器中的步驟；當將所述探針固定在基材上時，混合探針和所述具有可結合部位的物質的步驟。
文檔編號B01J19/00GK1610742SQ0282637
公開日2005年4月27日 申請日期2002年12月24日 優先權日2001年12月26日
發明者岡田良克, 龜山誠, 巖田研逸 申請人:佳能株式會社