水溶性熒光染料或有色染料的制作方法
【專利摘要】公開了可用作熒光或有色染料的化合物。所述化合物具有以下結構(I)：式(I)，包括其立體異構體、鹽或互變異構體，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R2k、R2l、R2m、R2n、R2o、R2p、R2q、R2r和R2s如本文所定義。還提供了與這類化合物的制備和使用相關的方法。
【專利說明】水溶性黃光染料或有色染料
[0001] 發明背景 發明領域
[0002] 本發明設及新的巧光染料或有色染料及其制備方法和在多種分析方法中的用途。
[0003] 相關領域的描述
[0004] 連續且擴大需要檢測和定量研究和診斷混合物中的作為分析物的化學、生化和生 物物質的快速、高度特異性的方法。特別有價值的是用于測量小量核酸、膚、糖、藥物、代謝 物、微生物、離子和其他有診斷價值的材料的方法。運類材料的實例包括麻醉劑和毒物，施 用用于治療目的的藥物，激素，病原微生物和病毒，膚，例如抗體和酶，W及核酸，特別是牽 設于疾病狀態的那些。
[0005] 特定分析物的存在經常可W通過利用表征許多生化和生物系統的高度特異性的 的方法來確定。常用方法基于，例如，抗原-抗體系統、核酸雜交技術和蛋白-配體系統。在運 些方法中，有診斷價值的復合物的存在通常通過連接至相互作用材料中的一種或多種的可 觀察的"標記"的存在或不存在來表示。選擇的特異性標記方法經常決定用于檢測目的分析 物的特定系統的有用性和通用性。優選的標記是便宜的，安全的，且能夠被有效地連接至各 種各樣的化學、生化和生物材料，而不顯著改變那些材料的重要結合親和力。所述標記應當 給予高度特征性信號，并且應當在自然界中罕見，優選從未發現。所述標記應當經范圍長達 數月的時間段在水系統中是穩定且可檢測的。所述標記的檢測是優選快速、靈敏且可重復 的，而不需要昂貴、專口的設備或者不需要保護人員的特別預防措施。所述標記的定量優選 相對獨立于變量如待測定的混合物的溫度和組成。
[0006] 已經開發了各種各樣的標記，其各自具有特定的優點和缺點。例如，放射性標記是 相當通用的，并且可W在非常低的濃度進行檢測。然而，運類標記是昂貴的，危險的，并且它 們的使用需要復雜的設備和受過訓練的人員。因此，對于非放射性標記，特別是通過分光光 度、自旋共振和發光技術可觀察的標記，和反應性材料如產生運類分子的酶，存在廣泛的興 趣。
[0007] 使用巧光光譜學可檢測的標記是特別感興趣的，因為本領域中已知大量運類標 記。此外，文獻中充滿了經衍生化W允許它們附接至其他分子的巧光標記的合成，并且許多 運類巧光標記是商業可得的。
[000引花青染料已被廣泛用于標記生物分子包括抗體、DNA探針、抗生物素蛋白、鏈霉抗 生物素蛋白、脂質、生化類似物、膚和藥物，W及用于各種應用包括DNA測序、DNA微陣列、 western印跡、流式細胞術分析和蛋白微陣列，僅舉幾例。科學家喜歡在生物應用中使用花 青染料，因為，除其他原因外，花青染料1)是生物相容;2)具有較高的摩爾吸光系數(約IO 5M -Icnfi) ;3)容易修飾W匹配寬范圍的期望的激發和檢測波長(例如約500至約900nm);4)能 夠滲入水溶性基團和連接基團；5)且具有有利的巧光特性。具體而言，Cy2綴合物（具有 49化m左右的最大吸附/激發和51化m左右的發射，在可見光譜的綠色區域中），由于對抑變 化的降低靈敏度而通常用作FITC的替代物。然而，切2的低巧光量子產率、短巧光壽命、光漂 白的傾向和差化學穩定性已經限制了其在化學和生命科學中的使用。
[0009]因此本領域需要在沒有事先光照或化學激活或酶促激活情況下允許目視或巧光 檢測生物分子的水溶性染料和生物標記物。理想地，運類染料和生物標記物應當強烈顯色 或發巧光并且應當W多種顏色和巧光波長可獲得。本發明滿足運種需要并且進一步提供相 關優點。
[0010] 發明簡述
[0011] 簡言之，本發明總體上設及可用作能夠目視檢測生物分子和其他分析物的水溶性 巧光染料或有色染料和探針的化合物，W及制備它們的試劑。還描述了用于目視檢測生物 分子W及用于確定生物分子大小的方法。本發明的水溶性巧光染料或有色染料強烈顯色 和/或發巧光并且可W通過視檢或其他手段輕易地觀察。在一些實施方案中，可W在沒有事 先光照或化學激活或酶促激活情況下觀察所述化合物。有利地，所述染料的實施方案具有 范圍為約468nm至約508nm的最大吸光度和范圍為約495nm至約525nm的最大發射。例如，在 某些實施方案中，所述染料具有在約490nm處的最大吸光度和在約505nm處的最大發射。因 此，所述染料對于各種分析方法中的使用是理想的。通過適宜地選擇染料，如本文所述，可 W獲得具有多種顏色的目視可檢測生物分子。
[0012] 閑此，在一個連施方案中，提供具有W下結構（I)的化合物：
[0013]
[0014] 或其鹽、立體異構體或互變異構體，其中Rla、Rlb、R2a、R2b、R 2e、R2d、R2e、R2f、R2g、R 2h、 RU、R2 j、R2k、R2I、R2"、R2n、R 2O、護 P、R2。、和 R2 S 如本文所定義。
[0015] 在其他實施方案中，提供包含與具有W下結構（T)的化合物形成的共價鍵的分析 物分子：
[001(
[0017] 或其鹽、立體異構體或互變異構體，其中Rla、Rlb、R2a、R2b、R 2e、R2d、R2e、R2f、R2g、R 2h、 R2 i、R2 j、R2k、R2I、R2"、R2。、R 2。、R2P、R2Q、R2'和 R2S 如本文所定義，且其中護3、R2b、R2。、rM、R2e、R2f、 護8、護\護、腫、護\護1、護>\護。、護。、護。、護9、滬或滬中的至少一者是分析物分子或與之形成 的鍵。
[0018] 在另一個實施方案中，提供一種用于對樣品進行染色的方法，所述方法包括向所 述樣品W足夠在所述樣品W適宜波長照亮時產生光學響應的量添加如本文所述的代表性 化合物。
[0019] 在還有其他實施方案中，本公開提供一種用于目視檢測生物分子的方法，所述方 法包括：
[0020] (a)提供本文所述的代表性化合物;并且
[0021 ] (b)通過其可視特性檢測化合物。
[0022] 所公開的其他方法包括一種用于目視檢測生物分子的方法，所述方法包括：
[0023] (a)將任一種所公開的化合物與一種或多種生物分子混合;并且
[0024] (b)通過其可視特性檢測化合物。
[0025] 其他實施方案設及一種組合物，所述組合物包含任一種公開的化合物和一種或多 種生物分子。還提供了運類組合物在檢測一種或多種生物分子的分析方法中的用途。
[0026] 本發明的運些方面和其他方面會在參考W下詳述后而顯而易見。
[0027] 附圖描述
[002引圖1描繪化合物2在CDC13中的Ih NMR譜。
[0029] 圖2描繪化合物2的化L注射體積的代表性總二極管陣列色譜圖（215-500nm)。使用 的系統是Waters Acquity UHPLC系統，其具有保持在45°C的2. Imm X 50mm Acquity邸H-C18 柱。
[0030] 圖3描繪漠化的蔥衍生物2產物的減去背景的質譜圖。預期質量:617.8。
[0031] 圖4描繪化合物3在CDCI3中的Ih NMR譜。
[0032] 圖5描繪化合物3的化L注射體積的代表性總二極管陣列色譜圖（215-500nm)。使用 的系統是Waters Acquity UHPLC系統，其具有保持在45°C的2. ImuDcSOmm Acquity 邸H-C18 柱。
[0033] 圖6描繪化合物3的減去背景的質譜圖。預期質量929.1。
[0034] 圖7描繪化合物5(粗5'-NH3-化EG)-AQ6-化EG)-3'序列）的10化注射體積在488nm 處的代表性色譜圖。使用的系統是Waters Acquity UHPLC系統，其具有保持在45°C的2. Imm X 50mm Acquity 邸H-C18柱。
[0035] 圖8描繪化合物5(粗5'-NH3-化EG)-AQ6-化EG)-3'序列）的減去背景的質譜圖。該 方法采用負模式的電噴霧電離，且顯示和^電荷狀態。
[0036] 發明詳述
[0037] 在W下描述中，闡述某些具體細節，旨在提供對本發明多個實施方案的透徹理解。 但是，本領域技術人員將理解本發明可W在沒有運些細節的情況下實施。
[003引除非情境需要，否則在本說明書和權利要求通篇范圍內，詞"包含"及其變例，如， "包含了"和"包含著"將解釋成是開放、包括性意義，即，理解為"包括但不限于"。
[0039] 本說明書通篇范圍內對"一個實施方案"或"某個實施方案"的談及意指在本發明 的至少一個實施方案中包含與某實施方案聯系所描述的具體特點、結構或特征。因此，短語 "在一個實施方案中"或"在某個實施方案中"在本說明書通篇范圍內多個位置的出現并不 必然地全都指相同的實施方案。另外，具體特點、結構或特征可W在一個或多個實施方案中 按任何適合的方式組合。
[0040] 。氨基"指-N出基。
[OOW 。簇堂'指-CO抽基。
[00創。氯堂'指-CN基。
[00創。甲酯堂'指-(X=O)H基。
[0044] "浮'或"徑堂'指OH基。
[0045] 。亞胺堂'指=畑基。
[0046] "硝堂'指-NO盛。
[0047] "氧代"指=0取代基。
[004引。硫氨基"指-SH基。
[00例"硫代"指=S基。
[0050] "烷基"指僅由碳原子和氨原子組成的直鏈或分枝控鏈基團，所述控鏈基團是飽和 或不飽和的（即，含有一個或多個雙鍵和/或皇鍵），具有1個至12個碳原子(Ci-Ci2烷基）、優 選地1個至8個碳原子(Ci-Cs烷基）或1個至6個碳原子(Ci-Cs烷基），并且通過單鍵與分子的 其余部分連接，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基（異丙基）、正下基、正戊基、1,1-二甲 基乙基（叔-了基）、3-甲基己基、2-甲基己基、乙締基、丙-1-締基、了-1-締基、戊-1-締基、 戊-1,4-二締基、乙烘基、丙烘基、下烘基、戊烘基、己烘基等。除非在本說明書中另外聲明， 否則烷基可W是任選取代的。
[0051] "亞烷基"或"亞烷基鏈"指僅由碳和氨組成的使分子的其余部分與取代基連接的 直鏈或分枝二價控鏈，所述二價控鏈是飽和或不飽和的（即，含有一個或多個雙鍵和/或皇 鍵)并且具有1個至12個碳原子，例如，亞甲基、亞乙基、亞丙基、正-亞下基、亞乙締基、亞丙 締基、正-亞下締基、亞丙烘基、正-亞下烘基等。亞烷基鏈通過單鍵或雙鍵與分子的其余部 分連接并通過單鍵或雙鍵與取代基連接。亞烷基鏈與分子其余部分及與取代基的連接點可 W是經過鏈內部的一個碳或任何兩個碳。除非在本說明書中另外聲明，否則亞烷基鏈可W 是任選取代的。
[0052]"烷氧基"指式-ORa的基團，其中Ra是如上文定義的含有1個至12個碳原子的烷基。 "徑基烷氧基"是包含至少一個徑基取代基的烷氧基部分。"氨基烷氧基"是包含至少一個氨 基取代基的烷氧基部分。除非在本說明書中另外聲明，否則烷氧基、徑基烷氧基和/或氨基 烷氧基是任選取代的。
[00對"烷基氨基"指式-NHRa或-NRaRa的基團，其中每個Ra獨立地是如上文定義的含有1 個至12個碳原子的烷基。除非在本說明書中另外聲明，否則烷基氨基可W是任選取代的。
[0054] "烷基酸"指如上文定義的任何烷基，其中至少一個碳-碳鍵用碳-氧鍵替換。碳-氧 鍵可W在末端上(如在烷氧基中）或碳氧鍵可W是內部的（即，C-0-C)。烷基酸包含至少一個 碳氧鍵，但是可W包括多于一個碳氧鍵（即，"聚烷基酸"）。例如，在烷基酸的含義內部包括 聚乙二醇(PEG),其為聚烷基酸。"徑基聚烷基酸"指包含一個或多個徑基取代基的聚烷基 酸。"氨基聚烷基酸"指包含一個或多個氨基取代基的聚烷基酸。除非在本說明書中另外聲 明，否則烷基酸、聚烷基酸、徑基聚烷基酸和/或氨基聚烷基酸基團是任選取代的。
[0055] "亞烷基酸"指如上文定義的任何亞烷基，其中至少一個碳-碳鍵用碳-氧鍵替換。 碳-氧鍵可W在末端上（如在烷氧基中）或碳氧鍵可W是內部的（即，C-0-C)。亞烷基酸包含 至少一個碳氧鍵，但是可W包括多于一個碳氧鍵。例如，在亞烷基酸的含義內部包括聚乙二 醇(PEG)。除非在本說明書中另外聲明，否則亞烷基酸基是任選取代的。
[0化6]"烷基二氧憐基"指-RP (= 0)(Ra)化基團，其中R是亞烷基，Ra是OH、〇-或ORc;并且化 是-氧烷基或-氧烷基酸，其中Rc是反離子(例如，化+等）。除非在本說明書中另外聲明，否則 烷基二氧憐基可W是任選取代的。例如，在某些實施方案中，烷基二氧憐基中的烷基或烷基 酸部分(化)任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、 二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基也 是任選取代的。
[0057]"氧烷基二氧憐基"是通過氧原子與分子剩余部分連接的烷基二氧憐基。除非在本 說明書中另外聲明，否則氧烷基二氧憐基是任選取代的。例如，在某些實施方案中，氧烷基 二氧憐基中的烷基、烷基酸或聚烷基酸部分(化)任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、 氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或 硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基也是任選取代的。
[0化引"烷基酸二氧憐基"指-RP (= 0)(Ra)化基團，其中R是亞烷基，Ra是OH、0-或ORc;并且 化是-氧烷基或-氧烷基酸，其中Rc是反離子(例如，Na+等）。除非在本說明書中另外聲明，否 則烷基酸二氧憐基可W是任選取代的。例如，在某些實施方案中，烷基酸二氧憐基中的烷基 或烷基酸部分(Rb)任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基或憐酸醋、硫代 憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述 取代基也是任選取代的。
[0059]"氧烷基酸二氧憐基"是通過氧原子與分子剩余部分連接的烷基酸二氧憐基。除非 在本說明書中另外聲明，否則氧烷基酸二氧憐基是任選取代的。例如，在某些實施方案中， 氧烷基酸二氧憐基中的烷基或烷基酸部分(Rb)任選被W下一種或多種取代基取代:?基、 氨基、硫氨基或憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或 硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基也是任選取代的。
[0060] "烷基硫代二氧憐基"指-RP( = Ra)(化化基團，其中R是亞烷基，Ra是0或S，化是0H、 0、S、0Rd或SRd;且Rc是-氧烷基或-氧烷基酸，其中Rd是反罔子(例如,Na+等），且條件是:Ra是 S或化是S-或SRd;或者條件是Ra是S且化是S-或SRd。除非在本說明書中另外聲明，否則烷基硫 代二氧憐基是任選取代的。例如，在某些實施方案中，烷基硫代二氧憐基中的烷基或烷基酸 部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐 基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基也是任選 取代的。
[0061] "氧烷基硫代二氧憐基"是通過氧原子與分子剩余部分連接的烷基硫代二氧憐基。 除非在本說明書中另外聲明，否則氧烷基硫代二氧憐基是任選取代的。例如，在某些實施方 案中，氧烷基硫代二氧憐基中的烷基或烷基酸部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑 基、氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸 或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基也是任選取代的。
[0062] "烷基酸硫代^氧憐基"指-RP( =Ra)(化)Rc基團，其中R是亞烷基酸基團，Ra是0或 S，Rb是0H、礦、S-、ORd或SRd;且Rc是-氧烷基或-氧烷基酸，其中Rd是反離子(例如，Na+等），且條 件是:Ra是S或化是Sl^SRd;或者條件是Ra是S且化是Sl^SRd。除非在本說明書中另外聲明，否 則烷基酸硫代二氧憐基是任選取代的。例如，在某些實施方案中，烷基酸硫代二氧憐基中的 烷基或烷基酸部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐 酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取 代基也是任選取代的。
[0063] "氧烷基酸硫代二氧憐基"是通過氧原子與分子剩余部分連接的烷基酸硫代二氧 憐基。除非在本說明書中另外聲明，否則氧烷基酸硫代二氧憐基可W是任選取代的。例如， 在某些實施方案中，氧烷基酸硫代二氧憐基中的烷基或烷基酸部分任選被W下一種或多種 取代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、 二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基也是任選取代的。
[0064] "酷胺堂'指-NRa化原子團，其中Ra和化獨立地是H、烷基或芳基。除非在本說明書中 另外聲明，否則酷胺基是任選取代的。
[0065] "芳基"指包含氨、6至18個碳原子和至少一個芳環的控環系統基團。出于本發明的 目的，芳基可W是單環狀、雙環狀、=環狀或四環狀環系統，其可W包括稠合或橋環系統。芳 基包括但不限于衍生自苯并起(aceant虹ylene)、起締、巧蔥(ac邱henanth巧Iene)、蔥、奧、 苯、遙、巧燒、巧、不對稱引達省(as-indacene)、對稱引達省（s-indacene)、巧滿、巧、糞、非 那締(phenalene)、菲、屯曜締(pleiadene)、巧、和S亞苯的芳基。除非在本說明書中另外聲 明，否則術語"芳堂'或前綴"ar-"(如"芳烷基"中）意在包括任選取代的芳基。
[0066] "芳氧基"指式-ORa的基團，其中Ra是如上文定義的芳基，例如苯氧基等。除非在本 說明書中另外聲明，否則芳氧基可W是任選取代的。
[0067] "芳烷基"指式-Rb-Rc的基團，其中化是如上文定義的亞烷基鏈并且Rc是如上文定 義的一種或多種芳基，例如，芐基、二苯甲基等。除非在本說明書中另外聲明，否則芳烷基可 W是任選取代的。
[0068] "氧芳烷基"是通過氧鍵與分子剩余部分連接的芳烷基。"0DMT"指通過0原子與分 子其余部分連接的二甲氧基=苯甲基。除非在本說明書中另外聲明，否則氧芳烷基是任選 取代的。
[0069] "氯烷基"指包含至少一個氯基取代基的烷基。一個或多個-CN取代基可W在伯、仲 或叔碳原子上。除非在本說明書中另外聲明，否則氯烷基是任選取代的。
[0070] "環烷基"或"碳環狀環"指僅由碳原子和氨原子組成的穩定非芳族單環狀或多環 狀控基，所述非芳族單環狀或多環狀控基可W包括稠合或橋環系統，具有3個至15個碳原 子，優選地具有3個至10個碳原子，并且是飽和或不飽和的W及通過單鍵與分子的其余部分 連接。單環狀環烷基例如包括環丙基、環下基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。多環狀環 烷基例如包括金剛烷基、降冰片基、糞燒、7,7-二甲基-雙[2.2.1]庚基等。除非在本說明書 中另外聲明，否則環烷基可W是任選取代的。
[0071] "環烷基烷基"指式-化Rd的基團，其中化是如上文定義的亞烷基鏈并且Rd是如上文 定義的環烷基。除非在本說明書中另外聲明，否則環烷基烷基可W是任選取代的。
[0072] "多環的"指具有多于一個環的任何分子。運些環可W稠合、為螺環狀或由一個或 多個原子分隔(例如，通過非環接頭連接）。
[0073] "螺環的"指其中兩個環共有單個碳原子的多環分子。
[0074] "稠合的"指本文所述的與本發明化合物中的現有環結構稠合的任何環結構。當稠 環是雜環基環或雜芳基環時，在變成稠合雜環基環或稠合雜芳基環組成部分的現有環結構 上的任何碳原子可W由氮原子替換。
[0075] "面代"或"面素'指漠、氯、氣或艦。
[0076] "面代烷基"指如上文定義的烷基，所述烷基由一個或多個如上文定義的面素基團 取代，例如，S氣甲基、二氣甲基、；氯甲基、2,2,2-;氣乙基、1.2-二氣乙基、3-漠-2-氣丙 基、1,2-二漠乙基等。除非在本說明書中另外聲明，否則面代烷基可W是任選取代的。
[0077] 如本文所用，"雜環基"或"雜環"指由2至12個碳原子和語6個選自氮、氧和硫的雜 原子組成的穩定3元至18元非芳族環基團。除非在本說明書中另外聲明，否則雜環基可W是 單環狀、雙環狀、=環狀或四環狀環系統，所述環系統可W包括稠合或橋環系統;并且雜環 基中的氮、碳或硫原子可W任選地氧化;氮原子可W任選地季化;并且雜環基可W是部分或 完全飽和的。運類雜環基的實例包括但不限于二氧戊環基、嚷吩基[1.3]二嚷烷基、十氨異 哇嘟基、咪挫嘟基、咪挫烷基、異嚷挫烷基、異5馨挫烷基、嗎嘟基、八氨嗎I噪基、八氨異嗎I噪 基、2-氧代贓嗦基、2-氧代贓晚基、2-氧代化咯烷基、f澡挫嘟基、贓晚、贓嗦基、4-贓晚酬基、 化咯烷基、化挫烷基、奎寧環基、嚷挫烷基、四氨巧喃基、=嚷烷基、四氨化喃基、硫代嗎嘟、 硫嗎嘟基、1-氧代-硫代嗎嘟、和1,1-二氧代-硫代嗎嘟基。除非在本說明書中另外聲明，否 則雜環基可W是任選取代的。
[0078] "N-雜環基"指如上文定義的雜環基，所述雜環基含有至少一個氮并且其中雜環基 與分子其余部分附接的點經過雜環基中的氮原子。除非在本說明書中另外聲明，否則N-雜 環基基可W是任選取代的。
[00巧]"雜環基烷基"指式-化Re的基團，其中化是如上文定義的亞烷基鏈并且Re是如上文 定義的雜環基，并且如果雜環基是含氮雜環基，則該雜環基可W與烷基在氮原子處連接。除 非在本說明書中另外聲明，否則雜環基烷基是任選取代的。
[0080] "雜芳基"指包含氨原子、1個至13碳原子、1個至6個選自氮、氧和硫的雜原子和至 少一個芳環的5元至14元環系統基團。出于本發明的目的，雜芳基可W單環狀、雙環狀、=環 狀或四環狀環系統，所述環系統可W包括稠合或橋環系統;并且雜芳基中的氮、碳或硫原子 可W任選地氧化;氮原子可W任選地季化。實例包括但不限于叮庚因基、叮晚基、苯并咪挫 基、苯并嚷挫、苯并嗎I噪基、苯并二氧雜環戊締基、苯并巧喃基、苯并礎，挫基、苯并嚷挫、苯并 嚷二挫基、苯并[b][l，4]二氧雜環庚基、1,4-苯并二P惡烷基、苯并糞巧喃基、苯并碟挫基、 苯并二氧雜環戊締基、二礎、締基、苯并化喃基、苯并化喃酬基、苯并巧喃基、苯并化喃酬基、 苯并嚷吩基(苯并苯硫基）、苯并S挫基、苯并[4,6]咪挫并[1.2-a]化晚基、巧挫基、增嘟基、 二苯并巧喃基、二苯并嚷吩基、巧喃基、巧喃酬基、異嚷挫基、咪挫基、嗎I挫基、嗎I噪基、嗎I挫 基、異嗎I噪基、二氨嗎I噪基、異二氨嗎I噪基、異哇嘟基、嗎I嗦基、異5楚挫基、糞晚基、P惡二挫 基、2-氧代日丫庚因基、碟挫基、環氧乙烷基、1-氧化化晚基、1-氧化喀晚基、1-氧化化嗦基、1-氧化化嗦基、1-苯基-IH-化咯、吩嗦基、吩嚷嗦基、吩f澡嗦基、獻嗦基、蝶晚基、嚷嶺基、化咯 基、化挫基、化晚基、化嗦基、喀晚基、化嗦基、哇挫嘟基、哇;嚷嘟基、哇嘟基、奎寧環基、異哇 嘟基、四氨哇嘟基、嚷挫基、嚷二挫基、=挫基、四挫基、=嗦基和苯硫基（即，嚷吩基）。除非 在本說明書中另外聲明，否則雜芳基是任選取代的。
[0081] "N-雜芳基"指如上文定義的雜芳基，所述雜芳基含有至少一個氮并且其中雜芳基 與分子其余部分附接的點經過雜芳基中的氮原子。除非在本說明書中另外聲明，否則N-雜 芳基是任選取代的。
[0082] "雜芳基烷基"指式-化Rf的基團，其中化是如上文定義的亞烷基鏈并且Rf是如上文 定義的芳基。除非在本說明書中另外聲明，否則雜芳基烷基可W是任選取代的。
[0083] "徑基烷基"指包含至少一個徑基取代基的烷基。一個或多個-OH取代基可W在伯、 仲或叔碳原子上。除非在本說明書中另外聲明，否則徑基烷基可W是任選取代的。
[0084] "徑基烷基酸"指包含至少一個徑基取代基的烷基酸基。一個或多個-OH取代基可 W在伯、仲或叔碳原子上。除非在本說明書中另外聲明，否則徑基烷基酸基可W是任選取代 的。
[0085] "憐酸醋"指-0P(=0)(Ra)Rb基團，其中Ra是0H、礦或ORc;并且化是0H、礦、ORc、又一個 憐酸醋基團（如在二憐酸醋和=憐酸醋中）、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基燒 基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，其中Rc是反離子(例如，化+等）。除非在本說明 書中另外聲明，否則憐酸醋基可W是任選取代的。
[0086] "二氧憐基"指-P( = 0) (Ra)化基團，其中Ra是OH、〇-或ORc;并且化是OH、〇-、ORc、憐酸 醋基團（如在二憐酸醋和=憐酸醋中）、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二 氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，其中Rc是反離子(例如，Na+等）。除非在本說明書中另 外聲明，否則二氧憐基可W是任選取代的。
[0087] "二氧憐基燒堂'指-P(=0)(Ra)Rb基團，其中Ra是OH、〇-或ORc;并且化是-氧烷基，其 中Rc是反離子(例如，Na+等）。除非在本說明書中另外聲明，否則二氧憐基烷基是任選取代 的。例如，在某些實施方案中，二氧憐基烷基中的烷基部分任選被W下一種或多種取代基取 代:徑基、氨基、硫氨基或憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基 烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基是任選取代的。
[0088] "氧二氧憐基烷基"是通過氧原子與分子剩余部分連接的二氧憐基烷基。除非在本 說明書中另外聲明，否則氧二氧憐基烷基可W是任選取代的。例如，在某些實施方案中，氧 二氧憐基烷基中的烷基部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基或憐酸 醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基 酸，所述取代基是任選取代的。
[0089] "二氧憐基烷基酸"指-P (= 0)(Ra)化基團，其中Ra是OH、〇-或ORc;并且化是-氧烷基 (包括聚酸如聚氧化乙締酸等），其中Rc是反離子(例如，Na+等）。除非在本說明書中另外聲 明，否則二氧憐基烷基酸基團是任選取代的。例如，在某些實施方案中，二氧憐基烷基酸基 團中的烷基酸部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、二氧憐 基、硫代二氧憐基、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代 二氧憐基烷基酸，所述取代基是任選取代的。
[0090] "氧二氧憐基烷基酸"是通過氧原子與分子剩余部分連接的二氧憐基烷基酸基團。 除非在本說明書中另外聲明，否則氧二氧憐基烷基酸基團是任選取代的。例如，在某些實施 方案中，氧二氧憐基烷基酸基團中的烷基酸部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、 氨基、硫氨基、憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基 烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基是任選取代的。
[00川"憐酷亞胺"指-OP(ORa)(NRbs)基團，其中Ra是烷基，且每個Rb獨立地是H或烷基。除 非在本說明書中另外聲明，否則憐酷亞胺基團是任選取代的。
[0092] "激活的憐"指包含能夠與親核體反應(例如，在憐原子處與親核體反應)的憐的任 何部分。例如，憐酷亞胺和包含P-面素鍵的部分被包括于激活的含憐部分的定義內。除非在 本說明書中另外聲明，否則激活的含憐基團是任選取代的。
[0093] "受保護的徑基"指徑基部分，其中H已經被保護基團可逆地替換。保護基團是本領 域中熟知的。在某些實施方案中，受保護的徑基將是酸(例如，烷氧基、芳烷氧基或芳氧基）。 受保護的徑基的非限制性的實例是二甲基=苯甲基酸。其他受保護的徑基部分是本領域中 熟知的。除非在本說明書中另外聲明，否則受保護的徑基基團是任選取代的。
[0094] "硫氨基烷基"指包含至少一個硫氨基取代基的烷基。一個或多個-細取代基可W 在伯、仲或叔碳原子上。除非在本說明書中另外聲明，否則硫氨基烷基是任選取代的。
[00M]"硫氨基烷基酸"指包含至少一個硫氨基取代基的烷基酸基團。一個或多個-細取 代基可W在伯、仲或叔碳原子上。除非在本說明書中另外聲明，否則硫氨基烷基酸基可W是 任選取代的。
[0096] "橫酸醋"指-0S(0)2Ra基團，其中Ra是烷基或芳基。除非在本說明書中另外聲明，否 則橫酸醋基是任選取代的。
[0097] "硫代烷基"指式-SRa的基團，其中Ra是如上文定義的含有1個至12個碳原子的燒 基。除非在本說明書中另外聲明，否則硫代烷基是任選取代的。
[009引"硫代憐酸醋"指-OP (= Ra)(化)Rc基團，其中Ra是0或S，化是OH、0-、S-、ORd或SRd;并 且Rc是0山0\03<1、憐酸醋基團、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基燒 基酸或硫代二氧憐基烷基酸，其中Rd是反離子(例如，化+等)并且條件是:Ra是S或化是或 SRd;或條件是Ra是S并且化是或SRd。除非在本說明書中另外聲明，否則硫代憐酸醋基是任 選取代的。
[0099] "硫代二氧憐基"指-P(= Ra)(化化基團，其中Ra是0或S，化是OH、礦、S-、ORd或SRd;并 且Rc是0山0\03<1、憐酸醋基團、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基燒 基酸或硫代二氧憐基烷基酸，其中Rd是反離子(例如，化+等)并且條件是:Ra是S或化是或 SRd;或條件是Ra是S并且化是或SRd。除非在本說明書中另外聲明，否則硫代二氧憐基是任 選取代的。
[0100] "硫代二氧憐基烷基"指-P(=Ra)(化)Rc基團，其中Ra是0或S，化是抓、〇-、5-、0尺減 SRd;并且Rc是-氧烷基，其中Rd是反罔子(例如，Na+等)并且條件是:Ra是S或Rb是S或SRd;或條 件是Ra是S并且化是Sl^SRd。除非在本說明書中另外聲明，否則硫代二氧憐基烷基是任選取 代的。例如，在某些實施方案中，硫代二氧憐基烷基中的烷基部分任選被W下一種或多種取 代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二 氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基是任選取代的。
[0101] "氧硫代二氧憐基烷基"是通過氧原子與分子剩余部分連接的硫代二氧憐基烷基。 除非在本說明書中另外聲明，否則氧硫代二氧憐基烷基是任選取代的。例如，在某些實施方 案中，氧硫代二氧憐基烷基中的烷基部分任選被W下一種或多種取代基取代:徑基、氨基、 硫氨基、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二 氧憐基烷基酸，所述取代基是任選取代的。
[0102] "硫代二氧憐基烷基酸"指-P(= Ra)(化化基團，其中Ra是0或S，化是OH、〇-、S-、ORd或 SRd;并且Rc是-氧烷基酸，其中Rd是反罔子(例如，Na+等)并且條件是:Ra是S或化是S或SRd;或 條件是Ra是S和化是Sl^Rd。除非在本說明書中另外聲明，否則硫代二氧憐基烷基酸基是任 選取代的。例如，在某些實施方案中，硫代二氧憐基烷基中的烷基酸部分任選被W下一種或 多種取代基取代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、硫代憐酸醋、二氧 憐基烷基、硫代二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基是任選 取代的。
[0103] "氧硫代二氧憐基烷基酸是通過氧原子與分子剩余部分連接的硫代二氧憐基烷基 酸基。除非在本說明書中另外聲明，否則氧硫代二氧憐基烷基酸基是任選取代的。例如，在 某些實施方案中，氧硫代二氧憐基烷基中的烷基酸部分任選被W下一種或多種取代基取 代:徑基、氨基、硫氨基、憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、硫代憐酸醋、二氧憐基烷基、硫代 二氧憐基烷基、二氧憐基烷基酸或硫代二氧憐基烷基酸，所述取代基是任選取代的。
[0104] 如本文所用的術語"取代的"意指任何上述基團（例如，烷基、亞烷基、烷氧基、烷基 氨基、烷基酸、聚烷基酸、徑基聚烷基酸、氨基聚烷基酸、亞烷基酸、烷基^氧憐基、烷基酸^. 氧憐基、烷基硫代二氧憐基、烷基酸硫代二氧憐基、酷胺基、硫代烷基、芳基、芳氧基、芳燒 基、氧芳烷基、氯基烷基、環烷基、環烷基烷基、面代烷基、雜環基、N-雜環基、雜環基烷基、雜 芳基、N-雜芳基、雜芳基烷基、徑基烷基、氨基烷基、徑基烷基酸、二氧憐基、二氧憐基烷基、 二氧憐基烷基酸、憐酷亞胺、激活的憐、受保護的徑基、硫氨基烷基、硫氨基烷基酸、橫酸醋、 硫代烷基、硫代二氧憐基、硫代二氧憐基烷基和/或硫代二氧憐基烷基酸），其中至少一個氨 原子由與非氨原子形成的鍵替換，所述非氨原子如，但不限于面原子如F、Cl、Br和I;多種基 團如徑基、烷氧基和醋基中的氧原子;多種基團如硫醇基、硫代烷基、諷基團、橫酷基和亞諷 基團中的硫原子;多種基團如胺、酷胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、 N-氧化物、二酷亞胺和締胺中的氮原子；多種基團如S烷基甲娃烷基、二烷基芳基甲硅烷 基、烷基二芳基甲娃烷基和=芳基甲娃烷基中的娃原子;和多種其他基團中的其他雜原子。 "取代的"還意指上述任一基團，其中一個或多個氨原子由與雜原子(如氧代、幾基、簇基和 醋基中的氧;和多種基團如亞胺、目虧、腺和臘中的氮)形成的更高級鍵替換(例如，雙鍵或皇 鍵）。例如，"取代的"包括其中一個或多個氨原子由-NRgRh、-NRgC(=0)Rh、-NRgC(=0) NRgRh、-NRgC (= O) O化、-NRgS〇2l?h、-OC (= O) NRgRh、-ORg、-SRg、-SORg、-SOsRg、-OSOsRg、-S〇2〇Rg、 = NSOsRg和-SOsNRg化替換的上述任一基團。例如/取代的"包括其中一個或多個氨原子由-C (=0)Rg、-C( =0)0Rg、-C( =0)NRg化、-C出S〇2Rg、-C出SOsNRg化替換的上述任一基團。在前述基 團中，Rg和化是相同或不同的并且獨立地是氨、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳 烷基、環烷基、環烷基、面代烷基、雜環基、N-雜環基、雜環基烷基、雜芳基、N-雜芳基和/或雜 芳基烷基。"取代的"還意指上述任一基團，其中一個或多個氨原子由與氨基、氯基、徑基、亞 胺基、硝基、氧代、硫代、面素、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、環烷基、環 烷基、面代烷基、雜環基、N-雜環基、雜環基烷基、雜芳基、N-雜芳基和/或雜芳基烷基形成的 鍵替換。此外，前述取代基的每一者也可W任選由一個或多個上述取代基取代。
[0105] "巧光"指能夠吸收特定頻率的光并發射不同頻率的光的分子。巧光是本領域普通 技術人員熟知的。
[0106] "有色"指吸收有色光譜(即，紅色、黃色、藍色等）內光的分子。
[0107] "接頭"指至少一個原子(如碳、氧、氮、硫、憐及其組合)的連續鏈，所述連續鏈將分 子的一部分連接至相同分子的另一個部分或連接至不同分子、部分或固相支持物(例如，微 粒子）。接頭可W經共價鍵或其他方式如離子相互作用或氨鍵相互作用連接分子。
[0108] 為了本發明的目的，術語"生物分子"指多種生物物質的任一者，所述生物物質包 括核酸、碳水化合物、氨基酸、多膚、糖蛋白、激素、適配體及其混合物。更具體地，該術語意 在包括而不限于RNA、DNA、寡核巧酸、修飾或衍生化的核巧酸、酶、受體、航病毒、受體配體 (包括激素）、抗體、抗原和毒素，W及細菌、病毒、血細胞和組織細胞。如本文進一步描述，通 過W下方式制備本發明的目視可檢測生物分子（即，與生物分子連接的結構（I)的化合物）： 使生物分子與具有反應基團的化合物接觸，所述反應基團能夠借助生物分子上的任何可用 原子或官能團如氨基、徑基、簇基或硫氨基，使該生物分子與化合物連接。
[0109] 術語"可視的"和"目視可檢測的"在本文中用來指沒有事先光照或化學激活或酶 促激活情況下通過視檢可觀察的物質。運類目視可檢測的物質在范圍從約3(K)nm至約900nm 的光譜區吸收并發光。優選地，運類物質強烈有色，優選地具有至少約40,000、更優選地至 少約50，000、仍然更優選地至少約60，000、仍更優選地至少約70，000和最優選地至少約80， OOOM^icnfi的摩爾消光系數。可W通過用肉眼觀察，或借助基于光學的檢測裝置，包括而不 限于，吸收分光光度計、透射光學顯微鏡、數碼照相機和掃描儀，檢測到本發明的生物分子。 目視可檢測的物質不限于在可見光譜發射和/或吸收光的那些。"目視可檢測的"物質的范 圍內還包括在紫夕Kuv))區（約IOnm至約400nm)、紅外（IR)區（約70化m至約Imm)發射和/或 吸收光的物質和在其他電磁波譜區發射和/或吸收的物質。
[0110] 為了本發明的目的，術語"光穩定的可視染料"指如上文所定義那樣目視可檢測并 且暴露于光后沒有顯著改變或分解的化學部分。優選地，在暴露于光至少1小時后，光穩定 的可視染料不顯示明顯的漂白作用或分解。更優選地，在暴露于光至少12小時、仍然更優選 地至少24小時、然而仍更優選地至少I周和最優選地至少I個月后，可視染料是穩定的。適用 于本發明化合物和方法中的光穩定可視染料的非限制性實例包含偶氮染料、硫說藍染料、 哇叮晚酬顏料、二嘯嗦、獻菁、巧酬（P e r i n O n e )、二酬化咯并化咯、哇獻酬和 tru 過 rye 過 rbo 打 iuniD
[0111] 本發明的目視可檢測生物分子可用于廣泛類型的生物化學應用和生物醫學應用， 其中需要確定特定生物分子的存在、位置或量。在另一個方面，因此，本發明提供一種用于 目視檢測生物分子的方法，包括：（a)向生物系統提供包含與生物分子連接的結構（I)的化 合物的目視可檢測生物分子;并且(b)通過其可視特性檢測生物分子。為了本發明的目的， 短語"通過其可視特性檢測生物分子"意指在沒有光照或化學激活或酶促激活的情況下用 肉眼或借助基于光學的檢測裝置觀察生物分子，所述檢測裝置包括而不限于吸收分光光度 計、透射光學顯微鏡、數碼照相機和掃描儀。光密度計可W用來對存在的目視可檢測生物分 子的量定量。例如，可W通過測量相對光學密度確定兩份樣品中生物分子的相對量。如果已 知染料分子/生物分子的化學計量并已知染料分子的消光系數，則也可W從光學密度的測 量值確定生物分子的絕對濃度。如本文所用，術語"生物系統"用來指除目視可檢測生物分 子之外還包含一種或多種生物分子的任何溶液或混合物。運類生物系統的非限制性實例包 括細胞、細胞提取物、組織樣品、電泳凝膠、分析混合物和雜交反應混合物。
[0112] "微粒子"指可用于與本發明化合物連接的眾多小粒子的任一個，包括但不限于玻 璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些實施方案中，微粒子包含聚苯乙締，如聚苯乙 締珠。
[0113] 本文公開的發明的實施方案還意在涵蓋通過一個或多個原子由具有不同原子質 量或質量數的原子替換而進行同位素標記的全部的結構（I)化合物。可W滲入所公開化合 物的同位素的實例分別包括氨、碳、氮、氧、憐、氣、氯和艦的同位素，如 2h、3h、iic、i3c、i4c、 13N、15N、15〇、"〇、18〇、31p、32p、35s、18F、36ci、123Kpl25i。
[0114] 同位素標記的結構（I)化合物通常可W通過本領域技術人員已知的常規技術或通 過與下文和W下實施例中所述的那些相似的方法，使用適宜的同位素標記試劑而非先前所 用的非標記試劑來制備。
[0115] "穩定化合物"和"穩定結構"意指運樣的化合物，所述化合物充分穩健W承受從反 應混合物分離至有用純度和配制成有效治療劑。
[0116] 術語"任選的"或"任選地"意指隨后描述的事件或環境可能出現或可能不出現，并 且運種描述包括其中所述事件或環境出現的情況及其中它不出現的情況。例如，"任選取代 的烷基"意指烷基可W是取代的或可W是未取代的并且該描述包括取代的烷基和沒有取代 的烷基。
[0117] "鹽"包括酸加成鹽和堿加成鹽。
[0118] "酸加成鹽"指與無機酸和與有機酸形成的那些鹽，所述無機酸例如是但不限于氨 氯酸、氨漠酸、硫酸、硝酸、憐酸等，所述有機酸例如是但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二 酸、海藻酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯橫酸、苯甲酸、4-乙酷氨基苯甲酸、精腦酸、精腦-10-橫 酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、巧樣酸、環拉酸、十二烷基硫酸、乙燒-1,2-二橫酸、乙橫 酸、2-徑基乙橫酸、甲酸、延胡索酸、乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醒酸、谷氨 酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油憐酸、乙醇酸、馬尿酸、異下酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、雄性 酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、甲橫酸、黏酸、糞-I，5-二橫酸、糞-2-橫酸、1-徑-2-糞酸、尼克 酸、油酸、乳清酸、草酸、棟桐酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酬酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、癸 二酸、硬脂酸、班巧酸、酒石酸、硫氯酸、對-甲苯橫酸、=氣乙酸、十一締酸等。
[0119] "堿加成鹽"指從添加無機堿或有機堿至游離酸所制備的那些鹽。衍生自無機堿的 鹽包括但不限于鋼鹽、鐘鹽、裡鹽、錠鹽、巧鹽、儀鹽、鐵鹽、鋒鹽、銅鹽、儘鹽、侶鹽等。衍生自 有機堿的鹽包括但不限于W下的鹽:伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺）、 環狀胺和堿性離子交換樹脂，如氨、異丙胺、=甲胺、二乙胺、=乙基、=丙基、二乙醇胺、乙 醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基、二環己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普 魯卡因、哈胺、膽堿、甜菜堿、苯乙節胺、節星、乙二胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可堿、= 乙醇胺、氨下=醇、嚷嶺、贓嗦、贓晚、N-乙基贓晚、多胺樹脂等。特別優選的有機堿是異丙 胺、二乙胺、乙醇胺、=甲胺、二環己胺、膽堿和咖啡因。
[0120] 經常，結晶產生本發明化合物的溶劑化物。本發明包括所描述化合物的全部溶劑 化物。如本文所用，術語"溶劑化物"指包含一個或多個分子的本發明化合物與一個或多個 分子的溶劑的聚集物。溶劑可W是水，在運種情況下溶劑化物可W是水合物。可選地，溶劑 可W是有機溶劑。因此，本發明的化合物可W作為水合物存在，包括一水合物、二水合物、半 水合物、倍半水合物、=水合物、四水合物等W及相應的溶劑化形式。本發明的化合物可W 是真溶劑化物，而在其他情況下，本發明的化合物可W僅保留外來水或另一種溶劑或是水 外加一些外來溶劑的混合物。
[0121] 本發明的化合物或其鹽、互變異構體或溶劑化物可W含有一個或多個非對稱中屯、 并且因此可W產生可W根據絕對立體化學定義相對于氨基酸而定義為(R)-或（S)-或定義 為(D)-或化)-定義的對映異構體、非對映異構體及其他立體異構形式。本發明意在包括全 部運類可能的異構體W及其消旋形式和光學純形式。光學活性的(+ )和(-)、（R)-和(S)-或 (D)-和化)-異構體可W使用手性合成子或手性試劑制備，或使用常規技術例如色譜和分級 結晶拆分。用于制備/分離各種對映異構體的常規技術包括從適合的光學純前體中手性合 成或例如使用手性高壓液相色譜化PLC)拆分消旋物(或鹽或衍生物的消旋物）。當本文所述 的化合物含有締屬雙鍵或其他幾何非對稱性中屯、時并且除非另外說明指定，否則該化合物 意在包括E和Z幾何異構體。同樣，還意在包括全部互變異構形式。
[0122] "立體異構體"指由不可互換的借助相同鍵鍵合、但具有不同=維結構的相同原子 組成的化合物。本發明構思了多種立體異構體及其混合物并且包括"對映異構體"，所述對 映異構體設及其分子彼此是不可疊加鏡像的兩種立體異構體。
[0123] "互變異構體"指質子從分子的一個原子移動至同一分子的另一個原子。本發明包 括任何所述化合物的互變異構體。化合物的多種互變異構形式可由本領域普通技術人員容 易地衍生。
[0124] 使用ACD/命名9.07版軟件程序和/或化em化aw Ultra 11.0版軟件命名程序 (CambridgeSoft)，本文所用的化學命名方案和結構簡圖是I.U.P.A.C.命名系統的修改形 式。還使用本領域普通技術人員熟悉的通用名。
[0125] 如上文所示，在本發明的一個實施方案中，提供可用作各種分析方法中巧光染料 和/或有色染料的化合物。化合物具有W下結構（I):
[0126]
[0127]或其鹽、立體異構體或互變異構體，其中：
[012引 Ri嘴R化各自獨立地是徑基或烷氧基;且
[01 29 ]護3、RSb、R2。、rM、護、RW、R2S、R2h、R"、R 2 j、R2k、R2I、R2"、R2。、R 2。、R2P、R2。、R2'和 R2S各自獨 立地是H、面素或-Li-R3;
[0130] R3,在每次出現時，獨立地是被W下中的一種或多種取代的分析物分子或烷基:徑 基、受保護的徑基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基酸、徑基烷氧基、氨基烷氧基、徑基聚燒 基酸、氨基聚烷基酸、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、二氧憐基烷基酸、氧二 氧憐基烷基酸、硫代二氧憐基烷基酸、氧硫代二氧憐基烷基酸、憐酷亞胺或激活的憐;或者 R 3是微粒子;且
[0131] Li是任選的接頭部分。
[0132] 在一些其他實施方案中，所述化合物具有W下結構（Ia)或（扣)之一：
[0133
[013'
[013;
[013<
[0137]在還有其他實施方案中，所述化合物具有W下結構（Ie)或（If)之一：
[0131
[0139] 在上述的一些具體實施方案中，所述化合物具有結構（If)。
[0140] 在各個實施方案中，Rla或Rlb為徑基。在其他實施方案中，Rla或Rlb為烷氧基。例如， 在一些實施方案中，Rla和Rlb各自為烷氧基。
[0141] 在前述實施方案的一些中，烷氧基是Ci-Cs烷氧基，如甲氧基。
[01 創在任何前述實施方案的一些中，R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R2k、R21、 R2"、R2。、R2。、R2P、R2Q、R 2T或 R2S 中的至少一者是H。
[0143]在前述實施方案的其他中，R2a、R2b、R2c、R 2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R 2i、R2j、R2k、R2l、R2m、 尺2。、32。、32。、護9、護或護中的至少一者是面素。在一些更具體實施方案中，護3、3 21：、32。、尺2<1、 R2e、R 2f、R2g或RSh中的至少一者是面素，例如，在一些實施方案中，RSb是面素。在任何前述實 施方案的一些中，面素是漠。
[0144] 在各個其他實施方案中，R2。、R2b、R2。、rM、R2e、R 2f、R2S、R2h、RU、R2 j、R2k、R2I、R2"、R2。、 R2。、R2P、R2Q、R2T或R2S中的至少一者是-Ll-R 3。例如，在一些實施方案中，R2a、R2b、R2。、rM、護、 RW、R2S或R2h中的至少一者是-Li-R3。在更具體實施方案中，R 2b是-Li-R3。
[0145] 在還有其他實施方案中，RSb 是-Ll-R3 且 R2a、R2c、R2d、R2e、R2f、R 2g、R2h、R2i、R2j、R2k、R 2l、 R2"、R2。、R2。、R2P、R 2Q、R2T 和R2S 中的至少一者是H。
[0146] 在一些實施方案中，R3,在每次出現時，獨立地是被W下中的一種或多種取代的分 析物分子或烷基:徑基、受保護的徑基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基酸、徑基烷氧基、氨 基烷氧基、徑基聚烷基酸、氨基聚烷基酸、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、二 氧憐基烷基酸、硫代二氧憐基烷基酸、憐酷亞胺或激活的憐;或者R 3是微粒子。在前述實施 方案的一些中，所述二氧憐基烷基酸是氧二氧憐基烷基酸。在前述實施方案的其他中，所述 硫代二氧憐基烷基酸是氧硫代二氧憐基烷基酸。
[0147] 在前述實施方案的一些中，R3,在每次出現時，獨立地是被W下中的一種或多種取 代的烷基:徑基、受保護的徑基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基酸、徑基烷氧基、氨基燒氧 基、徑基聚烷基酸、氨基聚烷基酸、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、二氧憐基 烷基酸、硫代二氧憐基烷基酸、憐酷亞胺或激活的憐。例如，在一些實施方案中，R 3是被一種 或多種選自W下的取代基取代的烷基:徑基、氨基、=苯甲基酸、憐酷亞胺、二氧憐基、二氧 憐基烷基酸、憐酸醋和聚乙二醇。
[0148] 在前述實施方案的一些中，R3,在每次出現時，獨立地是被W下中的一種或多種取 代的烷基:徑基、受保護的徑基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基酸、徑基烷氧基、氨基燒氧 基、徑基聚烷基酸、氨基聚烷基酸、憐酸醋、硫代憐酸醋、二氧憐基、硫代二氧憐基、二氧憐基 烷基酸、氧二氧憐基烷基酸、硫代二氧憐基烷基酸、氧硫代二氧憐基烷基酸、憐酷亞胺或激 活的憐。例如，在一些實施方案中，R 3是被一種或多種選自W下的取代基取代的烷基:徑基、 氨基、=苯甲基酸、憐酷亞胺、二氧憐基、二氧憐基烷基酸、氧二氧憐基烷基酸、憐酸醋和聚 乙二醇。
[0149] 在一些實施方案中，R3,在每次出現時，獨立地是被一個或多個氧二氧憐基烷基酸 取代的烷基。
[0150] 例如，在上述的一些實施方案中，R3,在每次出現時，獨立地是被一個或多個二氧 憐基烷基酸基(如氧二氧憐基烷基酸基)取代的烷基，且所述聚烷基酸的烷基酸是聚烷基酸 如乙二醇。在運些實施方案的一些中，所述二氧憐基烷基酸的烷基酸被取代基取代，所述取 代基選自徑基和其他二氧憐基烷基酸部分，如其他氧二氧憐基烷基酸部分，其可W被徑基 和/或氨基取代。
[0151] 在其他實施方案中，R3,在每次出現時，獨立地是被兩個氧二氧憐基烷基酸基取代 的烷基。在運些實施方案的一些中，所述烷基酸部分是聚烷基酸，如聚氧化乙締。在運些實 施方案的一些其他中，所述烷基酸部分被一個或多個取代基取代，所述取代基選自徑基、氨 基和其他氧二氧憐基烷基酸部分，且所述其他氧二氧憐基烷基酸部分的烷基酸任選被徑基 和/或氨基取代。
[0152] 應當理解，結構（I)的化合物的一些實施方案包含兩個或更多個R3基團。在運類實 施方案中，R3基團可W相同或不同的。在某些實施方案中，結構（I)的化合物包含單個R3基 團，即，護3、RSb、R2。、RM、護、RW、R2S、R2h、R"、R 2 j、R2k、R2I、R2"、R2。、R 2。、R2P、R2。、護或 R2S 中的僅一 者是 _li_r3。
[0153]在任何前述的各個其他實施方案中，R3具有W下結構之一： 「01541
[0155] 其中；
[0156] ni、n2和n3各自獨立地是1至6的整數;且
[0157] X和y各自獨立地是1至10的整數。
[0158] 在上述實施方案的一些中，ni、n2和n3各自是1。在其他實施方案中，Li不存在且R 3直 接連接至結構（I)的化合物的剩余部分。
[0159] 在上述的一些其他實施方案中，X是5。在其他實施方案中，y是5。在一些更多實施 方案中，X和y各自是5。
[0160] 在一些不同的實施方案中，R3是分析物分子，如生物分子。在某些實施方案中，R3是 選自核酸、氨基酸及其聚合物(例如，DNA、寡核巧酸、蛋白質、多膚等)的生物分子。
[0161] 在還有其他實施方案中，R3是生物分子，且所述生物分子是核酸、膚、碳水化合物、 脂質、酶、受體、受體配體、抗體、糖蛋白、適配體、抗原或航病毒。
[0162] 在一些不同的實施方案中，R3是選自藥物、維生素和小分子的分析物分子。
[0163] 在前述實施方案的一些中，接頭Li存在。當存在時，方便地選擇Li^提供R3和結構 (I)的化合物的剩余部分之間的共價附接。示例性Li部分包括，但不限于，0、N、S、P和亞烷基 鍵及其組合。合適的Li基團是本領域普通技術人員可衍生的。
[0164] 在其他實施方案中，Li不存在。
[0165] 在一些實施方案中，當Li存在時，Li包含與分析物分子形成的憐酸醋鍵。在運些實 施方案的一些中，Li具有W下結構：
[0166：
[0167] 其中An哺n3各自獨立地是1至6的整數。在各個其他實施方案中，An哺n3各自 是1。
[0168] 結構（I)的化合物的結構經選擇W優化吸光度和或發射波長。因此，在各個實施方 案中，結構（I)的化合物具有范圍為約468nm至約508nm、例如約478nm至約498nm的最大吸光 度。在其他實施方案中，結構（I)的化合物具有范圍為約495nm至約525nm、例如約495nm至約 515nm的最大發射。例如，在某些實施方案中，所述染料具有在約490nm處的最大吸光度和在 約505nm處的最大發射。
[0169] 在一些更具體實施方案中，結構（I)的化合物具有W下結構之一：
[01
[0172
側
[0173] 其中R3是分析物分子。
[0174] 在各個其他實施方案中，本發明提供包含與具有W下結構（I'）的化合物形成的共 價鍵的分析物分子：
[0175
[0176] 或其鹽，其中；
[0177] Ria和Rib各自獨立地是徑基或烷氧基;且
[01 7 引護3、RSb、R2。、rM、護、RW、R2S、R2h、R"、R 2 j、R2k、R2I、R2"、R2。、R 2。、R2P、R2。、R2T和 R2S各自獨 立地是H、面素或-Li-R3;
[01巧]R3是分析物分子;且
[0180] Li是任選的接頭部分，
[0181] 其中護3、RSb、R2。、rM、護、R2f、R2S、R2h、R"、R 2 j、R2k、R2I、R2"、R2。、R 2。、R2P、R2。、護或 R2S 中 的至少一者是-Li-R3。
[0182] 所述分析物分子可W選自任何適當的分析物分子，包括本文上述的分析物分子。
[0183] 在各個其他實施方案中提供包含前述任一化合物和一種或多種生物分子的組合 物。在一些實施方案中，還提供運類組合物在檢測一種或多種生物分子的分析方法中的用 途，如下文更詳細描述。
[0184] 可W理解，如上所述的結構（I)化合物的任何實施方案和本文對如上所述的結構 (I )化合物中 Rla、Rlb、R23、R2b、r2。、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、r2 j、R2k、r21、R2m、R2n、r2。、r2p、R2q、 R2t、R2s、l1或R3變量所述的任何具體選擇可W獨立地與其他實施方案和/或結構（I)化合物 的變量組合W形成上文沒有具體描述的本發明實施方案。此外，在一個具體實施方案和/或 權利要求中針對任何特定R或L基團列出一系列選擇的情況下，可W理解，每種獨立選擇可 W從該具體實施方案和/或權利要求刪除并且剩余選擇的列表將視為處于本發明的范圍 內。
[0185] 可W理解，在本說明書中，允許所述式的取代基和/或變量的組合，只要運類組合 產生穩定的化合物。
[0186] 本領域技術人員還將領會，在本文所述的方法中，中間化合物的官能團可能需要 由合適的保護基保護。運類官能團包括徑基、氨基、琉基和簇酸。徑基的合適保護基包括= 烷基甲娃烷基或^芳基烷基甲娃烷基(例如，叔了基^甲基甲娃烷基、叔了基^苯基甲硅烷 基或=甲基甲娃烷基）、四氨化喃基、芐基等。氨基、脈基和脈基的合適保護基包括叔下氧基 幾基、苯甲氧基幾基等。琉基的合適保護基包括-C(O)-R"(其中r是烷基、芳基或芳基燒 基），對甲氧基芐基、=苯甲基等。簇酸的合適保護基包括烷基、芳基或芳基烷基醋。可W根 據本領域技術人員已知和如本文所述的標準技術添加或移除保護基。保護基的用途是在 Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版， Wi ley中詳述。如本領域技術人員將領會，保護基也可W是聚合物樹脂如Wang樹脂、Rink樹 脂或2-氯二苯甲基氯脂。
[0187] 另外，可W借助本領域技術人員已知方法通過用適宜的無機堿或酸或有機堿或酸 處理，將本發明的W游離堿或酸形式存在的全部化合物轉化成它們的鹽。可W通過標準技 術，將本發明化合物的鹽轉化成它們的游離堿或酸形式。
[0188] W下反應方案說明制備本發明的化合物(即，結構（I)的化合物)的示例性方法： [0189：
[0190] 其中 Rla、Rlb、R2a、R2b、r2。、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、r2j、R2k、r21、R2m、R2n、r2。、r2p、R2q、 R2T和R2S如上面所定義。
[0191] 可W理解，本領域技術人員可能通過相似的方法或通過組合本領域技術人員已知 其他方法，能夠產生運些化合物。還應當理解，通過使用適宜的起始組分并根據需要修改合 成的參數，本領域技術人員將能夠W如下文描述的相似方式產生下文沒有具體描述的其他 的結構（I)化合物。通常而言，起始組分可W從多種來源如Sigma Aldrich ,Lancaster Synthesis, Inc.、Mayb;ridge、Mat;rix Scientific、TC巧日Fluorochem USA等獲得或根據本 領域技術人員已知的來源（參見，例如，Advanced Organic化emistry:Reactions, Mechanisms ,and Structure,第5版(WiI巧,December 2000)合成或如本發明中所述那樣制 備。
[019。反應方案I
[0193：
[0194]反應方案I顯示了用于制備結構I的化合物的示例性方法。參考反應方案I，結構A 和B的化合物可W買到或通過本領域普通技術人員熟知的方法制備。用強堿如正下基裡處 理2個當量的A、隨后與B反應導致產生結構（I)的化合物。盡管反應方案I描繪結構（I)的對 稱（即，相同的糞基)化合物的制備，但對于本領域普通技術人員將顯而易見的是，結構（I) 的其他、非對稱的化合物可W通過類似的方法(例如，不同取代的的糞基的逐步反應)來制 備。
[01M]進一步，通過上述方法獲得的結構（I)的化合物可W進一步修飾，W獲得結構（I) 的不同的化合物。例如，在某些實施方案中，結構（I)的化合物包含至少一個部分。在運類實 施方案中，-Li-R3部分或其前體可W經由任何熟知的方法如Suzuki偶聯來安裝。分析物分子 (例如，生物分子)可W經由任選的Li接頭通過許多常見方法中的任一種來附接。例如，對上 述方案的修改W包括能夠與分析物分子上的官能團形成共價鍵的反應性基團是用于附接 分析物分子的一種方式。反應性基團包括，但不限于激活的憐化合物(例如，憐酷亞胺）、激 活醋、胺、醇等。用于制備運類化合物和使其與分析物分子反應W形成共價鍵的方法是本領 域中熟知的。
[0196]在一些實施方案中，結構（I)的化合物包含與寡核巧酸形成的共價鍵。運類鍵可W 通過在結構（I)的化合物中包括憐酷亞胺基團且在標準DNA合成條件下使其與寡聚體(或憐 酷亞胺單體)反應而形成。DNA合成方法是本領域熟知的。簡而言之，兩個醇基團分別用二甲 氧基S苯甲基(DMT)基團和2-氯基乙基-N，N-二異丙基氨基憐酷亞胺基團官能化。憐酷亞胺 基團與醇基團一般在激活物如四挫存在下偶聯，隨后用艦氧化憐原子。二甲氧基=苯甲基 可W用酸(例如，氯乙酸)移除W暴露游離醇，所述游離酸可W與憐酷亞胺基反應。2-氯基乙 基可W在寡聚化后通過用氨水處理移除。
[0197] 寡聚化方法中所用的憐酷亞胺的制備也是本領域熟知的。例如，伯醇可W通過與 DMT-Cl反應作為DMT基團受到保護。隨后通過與適宜試劑如2-氯基乙基N，N-二異丙基氯憐 酷亞胺反應，仲醇官能化為憐酷亞胺。用于制備憐酷亞胺及其寡聚化的方法是本領域熟知 并且在實施例中更詳細地描述。
[0198] 在還有其他實施方案中，所述化合物可用于各種分析方法中。例如，在某些實施方 案中，本公開提供一種用于對樣品進行染色的方法，所述方法包括向所述樣品W足夠在所 述樣品W適宜波長照亮時產生光學響應的量添加結構（I)的化合物。
[0199] 在前述方法的還有其他實施方案中，RSa、RSb、R2。、rM、護、R2f、R2S、R 2h、RU、R2 j、R2k、 R2I、R2m、R2。、R2。、R2P、R 2。、護或R2S之一是-Ll-R3，其中R3是分析物分子，如生物分子。例如，在 一些實施方案中，所述生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核巧酸或多膚）。在還 有更多實施方案中，所述生物分子是酶、受體、受體配體、抗體、糖蛋白、適配體或航病毒。
[0200] 在前述方法的還有其他實施方案中，R2a、R2b、R2E、R2d、R 2e、R2f、R2g、R2h、R2i、R 2j、R2k、 護、護\護。、護°、32。、護9、護或護之一是心-護，其中護是微粒子。例如，在一些實施方案中， 所述微粒子是聚合珠或非聚合珠。
[0201 ]在甚至更多實施方案中，所述光學響應是巧光響應。
[0202] 在其他實施方案中，所述樣品包含細胞，并且一些實施方案進一步包括通過流式 細胞術觀察所述細胞。
[0203] 在還有更多實施方案中，所述方法進一步包括將所述巧光響應與具有可檢測不同 的光學特性的第二巧光團的巧光響應區分開來。
[0204] 在其他實施方案中，本公開提供一種用于目視檢測生物分子的方法，其包括：
[020 引（a)提供結構（I)的化合物，其中 R2a、R2b、R2\R2d、R2e、R 2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R 2k、R2l、 尺2"、護。、護。、護9、護9、護鄭滬之一是心-護，其中護是生物分子;和
[0206] (b)通過其可視特性檢測化合物。
[0207] 例如，在一些實施方案中，所述生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核巧 酸或多膚）。在還有更多實施方案中，所述生物分子是酶、受體、受體配體、抗體、糖蛋白、適 配體或航病毒。
[0208] 在其他實施方案中，提供一種用于目視檢測生物分子的方法，所述包括：
[0209] (a)將任何前述化合物與一種或多種生物分子混合;和
[0210] (b)通過其可視特性檢測化合物。
[0211] 如上所示，結構（I)的化合物的某些實施方案包含分析物分子(例如，生物分子)或 與之附接（綴合）的配體。附接可W是，例如，通過共價鍵合、離子鍵合、注有日期的鍵合 (dated bonding)、氨鍵合和其他形式的分子鍵合。
[0212] 幾種類型的分析物分子適合于綴合至結構（I)的化合物。例如，有用的本發明的綴 合的底物包括，但不限于，包含與之附接的分析物分子的結構（I)的化合物(本文也稱為"綴 合的底物"），所述分析物分子選自抗原、小分子、類固醇、維生素、藥物、半抗原、代謝物、毒 素、環境污染物、氨基酸、膚、蛋白質、光敏劑、核巧酸、寡核巧酸、核酸、碳水化合物、脂質、離 子-絡合部分和非生物聚合物。在一個示例性實施方案中，綴合的底物是天然或合成的氨基 酸，天然或合成的膚或蛋白質，或離子-絡合部分。示例性膚包括，但不限于蛋白酶底物、蛋 白激酶底物、憐酸酶底物、神經膚、細胞因子和毒素。示例性蛋白綴合物包括酶、抗體、凝集 素、糖蛋白、組蛋白、白蛋白、脂蛋白、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、酪蛋 白、藻膽蛋白、其他巧光蛋白、激素、毒素、生長因子等。
[0213] 分析物分子與結構（I)的化合物的剩余部分的連接點可W且將根據實施方案而變 化。此外，一些實施方案包括分析物分子和結構（I)的化合物的剩余部分之間的接頭化1)， 盡管使用的接頭是任選的，并且不是所有實施方案中都是必需的。還預想結構（I)的化合物 可W包含多于一個分析物分子。例如，兩個、=個或多于=個分析物分子可W綴合至化合物 (I)的糞基和/或蔥環。
[0214] 將染料連接至各種類型的分析物分子的幾種方法是本領域中熟知的。例如，用于 將染料綴合至分析物分子的方法描述于R.化Ugland,The Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,第9片反，2002,Molecular Probes,Inc. 和其中引用的文獻；和化indl巧，1992 ,Biocon jugate Chem. 3 : 2，其通過引用全部并入本 文。通過實例的方式，本公開的化合物可W包括經由一個或多個嚷嶺或喀晚堿基通過酷胺、 醋、酸或硫酸鍵至DNA或RNA的共價鍵;或通過作為醋、硫醋、酷胺、酸或硫酸的鍵附接至憐酸 醋或碳水化合物。或者，結構（I)的化合物可W通過化學后修飾(如用銷試劑)或使用光可激 活的分子(如綴合的補骨脂素)結合至核酸。
[0215] 本發明的化合物可用于許多應用，包括美國專利號7，172，907; 5，268，486;和美國 專利申請號20040014981;和20070042398(其中所有都W其整體通過引用并入本文）中對于 其他染料描述的那些。例如，巧光染料，如本文所述的那些，可用于用技術成像，所述技術如 基于巧光檢測（包括但不限于巧光壽命、各向異性、光誘導的電子轉移、光漂白恢復和非放 射性轉移）的那些。因此，結構（I)的化合物，可用于所有基于巧光的成像，顯微鏡和光譜技 術，包括其變型。此外，它們也可用于光動力療法和多模式成像中。示例性巧光檢測技術包 括設及在系統內檢測產生的巧光的那些。運類技術包括，但不限于，巧光顯微鏡，巧光激活 的細胞分選(FACS)，巧光流式細胞術，巧光關聯光譜(FCS)，巧光原位雜交(FISH)，多光子成 像，擴散光學斷層成像，細胞和組織中的分子成像，具有一納米精度的巧光成像(FIONA),自 由基引發的膚測序(FRIP)，和膜電位的二次諧波視網膜成像(SHRIMP), W及本領域中已知 的其他方法。
[0216] 或者，結構（I)的化合物可W用作追蹤活細胞中的動態行為的標記物或標簽。在運 方面，光漂白后的巧光恢復(FRAP)可W與本化合物組合使用W便用高強度激光選擇性破壞 感興趣的區域內的巧光分子，隨后用低強度激光經一段時間監測新巧光分子至漂白區域內 的恢復。FRAP的變體包括，但不限于，偏振FRAP(pFRAP)，光漂白中的巧光損失(FLIP)，和光 漂白后的巧光定位(FLAP)。從FRAP和FRAP的變體得到的信息可W用于確定巧光標記的分子 的動力學特性，包括擴散系數、移動分數和轉運速率。基于運類光漂白技術的方法描述于 Braeckmans , K .等人，Biophysical Journal 85:2240-2252,2003; I3raga , J .等人， Molecular Biology of the Cell 15:4749-4760,2004;Haraguchi,T.,Cell Structure and F^mction 27:333-334,2002;Gordon,G.W.等人，Bio地ysical Journal 68:766-778, 1995,其都W其整體通過引用并入本文。
[0217] 其他巧光成像技術基于非放射性能量轉移反應，其為供體和受體之間的能量轉移 的均勻發光測定法。可W采用本巧光染料的使用的運類技術包括，但不限于，FRET、FET、FP、 HTRF、BRET、化IM、化I、TR-FRET、化IE、smFRET和甜REK。運些技術都是FRET的變型。
[0218] 本化合物可W用作生物傳感劑，如化離子指示劑;抑指示劑;憐酸化指示劑，或其 他離子(例如，儀、鋼、鐘、氯和面化物）的指示劑。例如，生化過程經常設及生物分子的質子 化和去質子化，伴隨環境pH的變化。用不同抑敏感的基團在中位位置處的取代產生各種具 有不同地a的NIR巧光pH傳感劑。為了有效，在間位的取代將與巧光團核屯、處于擴展的JT綴 合，W實現響應于不同pH環境的顯著的光譜變化。
[0219] 公開的化合物的使用決不限于分析方法。在各個實施方案中，所述化合物用作各 種應用中的著色劑或染料。在運方面，核屯、蔥和/或糞基部分上的取代基沒有特別限制，只 要所述化合物維持其期望的顏色和/或吸光度和/或發射特性。用于該目的的適當取代基的 選擇在本領域普通技術人員的技術內。因此，在一些實施方案中，提供具有W下結構（I")的 可用作染料或著色劑的化合物：
[0220：
[0221] 或其鹽，其中Rla、Rlb、R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R2k、R21、R2m、R2n、R2。、 R2P、R2q、R2T和R2S各自獨立地是H或取代基，所述取代基基于該化合物的期望的顏色和或發 射/吸光度特性進行選擇。
[0222] 在結構（I")的化合物的某些實施方案中，Ria和Rib各自獨立地是徑基或烷氧基;且 R2a、R2b、r2。、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、r2 j、R2k、r21、R2m、R2n、r2。、r2p、R2q、r2t和r2s各自獨立地是H、 面素或烷基。
[0223] 在一些實施方案中，本文公開的化合物（例如，（I)、（r)和/或（I"))可用作紡織 品、塑料、油漆和/或安全裝置(例如，反光材料、應急燈、巧光棒等）中的染料或著色劑。本領 域普通技術人員將容易地認識到所公開的化合物的其他用途。
[0224] 提供W下實施例用于說明目的而非限制。 實施例
[02巧]一般方法
[0。6] 在巧化400MHz分光光度計上獲得Ih NM時普。Ih譜針對TMS進行參考。使用具有保持 在45°C的2.1mmx 50mm Acquity B邸-C18柱的Waters Acquity UHPLC系統進行反相HPLC 染料分析。使用MassLynx 4.1 義集軟件，在Waters/Micromass 如attro micro MS/MS(僅W MS模式）系統上進行質譜分析。用于LC/MS染料上的流動相是IOOmM 1，1，1，3，3，3-六氣-2- 丙醇化FIP)，8.6mMS乙胺(TEA),抑8。使用具有二極管陣列探測器的Agilent Infinity 1260 UHPLC系統和高效自動采樣器使用Aapp化C貸Spirit?膚C18柱（4.6mmx100 mm，5皿 粒度)分析，憐酷亞胺和前體分子。使用革織舊離子輸注增強電離獲得單體中間體的分子 量。在化ry Ec 1 ipse光譜光度計上記錄激發曲線和發射曲線。
[0227]除非另外聲明，否則全部反應均在烘箱干燥的玻璃器具中氮氣氛下實施。市售DNA 合成試劑購自Glen Research(SterlingiVA)。無水化晚、甲苯、二氯甲燒、二異丙基胺、S乙 胺、乙酸、化晚和THF購自Al化ich。全部其他化學品均購自Al化ich或TCI并且原樣使用，不 作額外純化。
[022引實施例1
[0229] 2-漠-9,10-雙（（6-甲氧基糞-1-基乙烘基)蔥（1)的合成
[0230]
[0231] 干凈、干燥的200mL圓底燒瓶用氮氣和無水THF(40血)沖洗。添加^乙烘基-6-甲氧 基糞(2. Og, 10.9mmol)，然后將燒瓶在丙酬干冰浴中在氮氣氛下冷卻30分鐘。冷卻后，逐滴 添加nBuLi 2.5M的己燒溶液（4.4mL，10.9mmol)，并使反應物攬拌1小時。添加2-漠蔥釀 (1.05肖，3.6111111〇1)和乙酸(30111〇，其后使反應物溫熱至室溫并攬拌過夜。然后^一份添加 0.1 M SnC12于IM肥1(44血）中的溶液。2小時之后，將反應混合物倒入甲醇(200mL)，并將所 得漿料攬拌一小時。紅色固體通過過濾分離并在真空下干燥(1.15g，51%)。
[0232] 化合物1的Ih醒R譜描繪于圖1中。化合物的215-500nm處的RP總二極管陣列色譜 圖描繪于圖2中。化合物1的質譜描繪于圖3中。
[0233] 實施例2
[0234] 3-(9,10-雙（（6-甲氧基糞-1-基）乙烘基）蔥-2-基）-2-((雙(4-甲氧基苯基）（苯 基）甲氧基）甲基倆-1-醇(2)的合成
[023J
[0236] 裝備有冷凝器的250mL圓底燒瓶用氮氣和無水THF(SOmL)沖洗，隨后添加2-((雙 (4-甲氧基苯基）（苯基）甲氧基）甲基）丙-2-締-1-醇（2.2邑，5.6111111〇1)。經由注射器添加9-BBN 0.5M的THF溶液(30.7mL，14.Ommol)，并且將反應物加熱至回流12小時。使反應冷卻至 室溫之后，添加3M K2CO3 (2.4ml)和無水THF(150血）。添加化合物1 (1.74g，2. Smmo 1)和PdCl2 (化Pf) (0.41g，0.56mmol)，并將溶液回流6小時，并使其經兩小時冷卻至室溫。將反應混合 物倒入C出Cl2(300mL)并用此0(300mL)洗涂。將水層用額外的C此Cls(IOOmL)回萃取。將合并 的有機層用飽和化Cl(300mL)洗涂，經化2S〇4干燥，并在真空中濃縮至粘稠膠狀物。然后將分 離的粗產物洗涂，通過硅膠柱色譜純化，用C此Cb:己燒（100: 0v/v)-(0 : lOOv/v)的梯度洗 脫，得到作為紅色固體的3(1.Og,35%)。化合物2的4H醒R譜描繪于圖4中。化合物的215-SOOnm處的總二極管陣列色譜圖描繪于圖5中。化合物2的質譜描繪于圖6中。
[0237] 實施例3
[023引 3-(9,10-雙（（6-甲氧基糞-1-基）乙烘基）蔥-2-基）-2-((雙(4-甲氧基苯基）（苯 基）甲氧基）甲基)丙基2-氯基乙基二異丙基憐酷亞胺(3)的合成
[0239
[0240] 干燥IOOmL圓底燒瓶用氮氣沖洗，隨后添加CH2Cl2(20mL)和化合物3(0.20g， 0.21mmol)。經由注射器添加N,N-二異丙基乙胺(0.18血，10.7mmol)和2-氯基乙基二異丙基 氯憐酷亞胺(0.15mL，0.6mmol)。在室溫攬拌1小時之后，通過化C分析確定反應完成。然后將 粗反應混合物在真空中濃縮為黑色膠狀物。將殘余物溶解于乙臘中并濃縮至干燥，并且不 經進一步純化即用于染料組裝。
[0241 ] 實施例4
[0242] 寡核巧酸染料的合成
[0243] 化合物3用于在Applied Biosystems 394 DNA/RNA合成儀上Wl皿〇1規模合成其 他染料化合物。所述化合物包含3'-憐酸醋基團。染料直接在CPG珠上或在聚苯乙締固相支 持物上合成。染料W 3 '至5 '方向通過標準固相DNA方法合成。偶聯方法使用標準0-氯基乙基 憐酷亞胺化學條件。全部憐酷亞胺單體均溶解于乙臘/二氯甲燒(0.1 M溶液）中，并且使用W 下合成循環，連續添加：1)用甲苯中的二氯乙酸移除5'-二甲氧基S苯甲基保護基，2)用乙 臘中的激活試劑偶聯下一個憐酷亞胺，3)用艦/化晚/水氧化，和4)用乙酸酢/1-甲基咪挫/ 乙臘封端。重復合成循環直至5'寡聚氣巧(Oligofloroside)裝配。在鏈裝配結束時，用二氯 甲燒中的二氯乙酸或甲苯中的二氯乙酸移除單乙氧基=苯甲基(MMT)基團或二甲氧基=苯 甲基(DMT)基團。在室溫使用濃氨水2-4小時，從固相支持物切下染料。在真空中濃縮產物且 使用S邱hadex G-25柱W分離主要產物，所述主要產物給出RP-HPLC痕跡，如圖7(化合物5) 中所示。圖8顯示根據上述程序(化合物5)制備的染料質譜數據。根據上述一般程序通過將 化合物3偶聯至支持物、隨后標準切割和脫保護而制備化合物4。
[0244] 示例性化合物的結構、光譜特性和通過電噴霧質譜測定的分子量(MW)呈現于表1 中。
[0246]
[0245] 表1.代表性中間體和寡核巧酸染料序列及其觀察到的質量和光學特性。
[0247]
[0248] 本說明書中所參考的全部美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、外國專 利、外國專利申請和非專利公開，包括2014年1月16日提交的美國臨時專利申請序列號61/ 928,147,通過引用方式完整并入本文到并非與本說明書不一致的程度。
[0249] 從前文，可W理解盡管已經出于說明目的在此描述了本發明的具體實施方案，但 是可W在不偏離發明精神和范圍的情況下做出多種修改。因此，本發明不受除所附權利要 求書之外的限制。
【主權項】
1. 具有以下結構（I)的化合物：或其鹽、立體異構體或互變異構體，其中： 1^和1?1|3各自獨立地是羥基或烷氧基;且 R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、 R2f、R2g、R2h、R2i、R2 j、R2k、R21、R2m、R2n、R2。、 R2p、R2q、R2r和R2s各自獨立地 是H、鹵素或-L1-!?3; R3,在每次出現時，獨立地是被以下中的一種或多種取代的分析物分子或烷基:羥基、受 保護的羥基、氣基、烷基氣基、烷氧基、聚烷基釀、羥基烷氧基、氣基烷氧基、羥基聚烷基釀、 氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷 基烷基醚、硫代二氧磷基烷基醚、氧硫代二氧磷基烷基醚、亞磷酰胺或激活的磷;或者R 3是 微粒子;且 L1是任選的接頭部分。2. 權利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下結構(la)或(lb)之一：3.權利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下結構(Ic)或(Id)之一：4. 權利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下結構(Ie)或(If)之一：5. 權利要求4的化合物，其中所述化合物具有結構(If)。6. 前述權利要求中任一項的化合物，其中1^或1?1|3是羥基。7. 前述權利要求中任一項的化合物，其中RlaSRlb是烷氧基。8. 權利要求1-5中任一項的化合物，其中1^和1?1|3各自是烷氧基。9. 權利要求7或8中任一項的化合物，其中烷氧基是&-〇5烷氧基。10. 權利要求9的化合物，其中&-C6烷氧基是甲氧基。11. 權利要求 1-10 中任一項的化合物，其中 R2a、R2b、R2e、R2d、R2e、R 2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R 2k、 R21、R2m、R2n、R2。、R2p、R 2q、R2r或 R2s 中的至少一者是Η。12. 權利要求 1-11 中任一項的化合物，其中 R2a、R2b、R2e、R2d、R2e、R 2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R 2k、 ^^^、^、^。、^、^^斤或心中的至少一者是鹵素。13. 權利要求12的化合物，其中1^、1?2|\1?2°、1?2(1、1^、1^、1^或1^中的至少一者是鹵素。14. 權利要求13的化合物，其中1?2|3是鹵素。15. 權利要求12-14中任一項的化合物，其中鹵素是溴。16. 權利要求 1-13 中任一項的化合物，其中 R2a、R2b、R2e、R2d、R2e、R 2f、R2g、R2h、R2i、R2j、R 2k、 R21、R2m、R2n、R2。、R2p、R 2q、R2r或R2s 中的至少一者是-L1-!?3。17. 權利要求1-13中任一項的化合物，其中心、1^、1^、1?2(1、1^、1^、1^或1^中的至少一 者是?ο18. 權利要求17的化合物，其中1?2|3是-1^-1?3。19. 權利要求 18 的化合物，其中 R2a、R2。、R2d、R2e、R2f、R 2g、R2h、R2i、R2j、R2k、R 21、R2m、R2n、R2。、 R2p、R2q、R2，R2fH。20. 權利要求16-19中任一項的化合物，其中R3，在每次出現時，獨立地是被以下基團中 的一種或多種取代的烷基:羥基、受保護的羥基、氨基、烷基氨基、烷氧基、聚烷基醚、羥基烷 氧基、氨基烷氧基、羥基聚烷基醚、氨基聚烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、二氧磷基、硫代二氧 憐基、^氧憐基烷基釀、氧^氧憐基烷基釀、硫代^氧憐基烷基釀、氧硫代^氧憐基烷基釀、 亞磷酰胺或激活的磷。21. 權利要求20的化合物，其中R3,在每次出現時，獨立地是被一種或多種選自以下的取 代基取代的烷基:羥基、氨基、三苯甲基醚、亞磷酰胺、二氧磷基、二氧磷基烷基醚、氧二氧磷 基烷基醚、磷酸酯和聚乙二醇。22. 權利要求20的化合物，其中R3，在每次出現時，獨立地是被一個或多個氧二氧磷基烷 基釀取代的烷基。23. 權利要求21的化合物，其中R3，在每次出現時，獨立地是以下結構之一：其中： ιΛη2和η3各自獨立地是1至6的整數;且 X和y各自獨立地是1至10的整數。24. 權利要求23的化合物，其中η1、n2和η3各自是1。25. 權利要求23或24的化合物，其中L1不存在。26. 權利要求16-19中任一項的化合物，其中R3，在每次出現時，獨立地是分析物分子。27. 權利要求26的化合物，其中所述分析物分子是生物分子。28. 權利要求27的化合物，其中所述生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物。29. 權利要求27的化合物，其中所述生物分子是核酸、肽、碳水化合物、脂質、酶、受體、 受體配體、抗體、糖蛋白、適配體、抗原或朊病毒。30. 權利要求27的化合物，其中所述分析物分子是藥物、維生素或小分子。31. 權利要求22-30中任一項的化合物，其中L存在。32. 權利要求31的化合物，其中L1包含與所述分析物分子形成的磷酸酯鍵。33. 權利要求32的化合物，其中L1具有以下結構：其中ιΛη2和η3各自獨立地是1至6的整數。34. 權利要求33的化合物，其中η1、η2和η3各自是1。35. 權利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下結構之一：其中R3是分析物分子。36. 分析物分子，其包含與具有以下結構0- )的化合物形成的共價鍵：或其鹽，其中： 1^和1?1|3各自獨立地是羥基或烷氧基;且 R2a、R2b、R2c、R2d、R2e、 R2f、R2g、R2h、R2i、R2 j、R2k、R21、R2m、R2n、R2。、 R2p、R2q、R2r和R2s各自獨立地 是H、鹵素或-L1-!?3; R3，在每次出現時，是分析物分子;且 L1是任選的接頭部分， 其中 R2a、R2b、R2c、R2d、 R2e、R2f、R2g、R2h、R2i、 R2 j、R2k、R21、R2m、R2n、R2。、 R2p、R2q、R2T或R2s 中的至 少一者是-L1-!?3。37. 對樣品進行染色的方法，所述方法包括向所述樣品以足夠在所述樣品以適宜波長 照亮時產生光學響應的量添加權利要求36的分析物分子。38. 權利要求37的方法，其中所述光學響應是熒光響應。39. 權利要求37-38中任一項的方法，其中所述樣品包含細胞。40. 權利要求39的方法，其進一步包括通過流式細胞術觀察所述細胞。41. 權利要求40的方法，其進一步包括區分所述熒光響應與具有可檢測不同光學特性 的第二熒光團的熒光響應。42. 用于目視檢測分析物分子的方法，所述方法包括： (a) 提供權利要求36的化合物;并且 (b) 通過其可視特性檢測所述化合物。43. 用于目視檢測生物分子的方法，所述方法包括： (a) 將權利要求1-36中任一項的化合物與一種或多種生物分子混合;并且 (b) 通過其可視特性檢測所述化合物。44. 組合物，包含權利要求1-36中任一項的化合物和一種或多種生物分子。45. 權利要求44的組合物在檢測一種或多種生物分子的分析方法中的應用。
【文檔編號】A61K31/66GK105874012SQ201580003739
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月16日
【發明人】T·馬特雷, S·赫莎姆
【申請人】索尼公司, 美國索尼公司