一種提高小球藻在養豬廢水中生物量的方法
【專利摘要】本發明提供了一種提高小球藻在養豬廢水中生物量的方法，屬于微生物應用領域。本發明將保藏編號為CGMCC NO.9225的小球藻與保藏編號為CGMCC NO.7724的類芽孢桿菌共培養于養豬廢水中，結果發現類芽孢桿菌能夠顯著提高小球藻在養豬廢水中的生物量，促進作用達1.6倍。本發明方法解決了養豬廢水處理問題，降低環境污染，類芽孢桿菌的加入改善了養豬廢水中水體微環境，顯著提高小球藻生物量，降低了微藻生物柴油的生產成本，取得較好的經濟效益，具有良好的市場應用前景。CGMCC No.922520140515
【專利說明】
_種提局I小球藻在養豬廢水中生物量的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物利用與生物油脂制備領域，具體地說，涉及一種提高小球藻在 養豬廢水中生物量的方法。
【背景技術】
[0002] 富油微藻產業已經成為的最具前途的生物柴油產業之一，且備受關注。微藻與其 他能源作物相比有著多種優勢，如低投入高產量，不與農爭地，不與農爭肥，可利用廢氣、廢 水、咸水生長，不需要除草劑、殺蟲劑，微藻細胞殘渣可用于農用肥料或動物飼料或繼續生 產沼氣或乙醇等。
[0003]目前，動物排泄物污染愈加嚴峻，不僅導致了水體富營養化，對農業生產造成了危 害，對人們的生活環境也產生了負面影響。隨著環境問題及能源問題的日益嚴重，微藻培養 與污水處理相結合已經成為一種新的趨勢。養豬廢水（Liquid swine manure, LSM)中含有 大量豬排泄物，富含有機碳源以及如氮、磷等其他營養成分，被視為高濃度污水，直接排放 會導致水體富營養化，污染水源。此外，養豬廢水攜帶大量的病原菌、散發極濃的臭味，日益 對環境造成嚴重污染。而微藻則有著利用污水中的有機及無機污染物并將其轉化為細胞組 分（如脂質和碳水化合物）的能力。微藻是生產生物柴油的優質原料。微藻的產油率是油 料作物如大豆的30-100倍，為生產替代性燃料油奠定了基礎。藻類以光能作為能源，利用 氮、磷等營養物質合成復雜的有機質。因此，藻類可降低污水中的氮、磷含量。對污水中氮、 磷的去除起到了較好的效果。
[0004] 然而，藻種的選擇至關重要，只有特定的藻種可以在養豬廢水中生長。這主要是由 于養豬廢水中氨氮（NH 3-N)濃度過高且含有其他有毒物質，而大部分微藻對其均十分敏感， 從而限制了微藻在廢水中的生長。之前的研究表明只有一小部分的小球藻Chlorella sp.， 柵藻Scenedesmus sp.及綠裸藻Euglena sp.可以被應用于污水處理中。另外，盡管一些 藻種可以在養豬廢水中生長，但是其生物量低且油脂含量低，相對于生物柴油的獲得并不 經濟。可以說，為了讓微藻于污水中產生更多的生物柴油需有兩點突破，其一即選擇合適的 藻種及培養方法增加微藻的生物量，其二則為增加微藻細胞內的含油量。
[0005] 有研究表明，微藻可以為異養細菌提供所需要的氧及有機物，與此同時異養細菌 釋放出的二氧化碳及養分（小分子氮、磷）可以供微藻生長利用。
[0006] 固氮類芽孢桿菌屬于自生固氮菌，其是一類可以產生芽孢，抗逆性強，存活時間 長，適應性強，分布廣泛，能夠固氮的微生物。固氮類芽孢桿菌具有固氮作用的同時，還可產 生一些促進植物生長的物質及一些抗菌物質，能有效的改善土壤微環境，促進植物生長以 及增強植物抗病害的能力，該屬中的許多菌株被作為植物根際促生菌而廣泛研究，但都僅 限于大型植物，目前并沒有固氮類芽孢桿菌作為微藻培養中促生菌的例子。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種提高小球藻在養豬廢水中生物量的方法。
[0008] 本發明首先提供一種提高小球藻（Chlorella sp.)生物量的方法，是在培養小球 藻的培養基中添加類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)。
[0009] 本發明提供一種提高小球藻（Chlorella sp.)在養豬廢水中生物量的方法，在培 養小球藻的養豬廢水中添加類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)。
[0010] 本發明的上述方法中，所述小球藻為34-2,其保藏編號為CGMCC NO. 9225,該菌 株已于2014年5月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱 CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 分類命名為小球藻Chlorella sp.。
[0011] 所述類芽孢桿菌為18WLY，其保藏編號為CGMCC NO. 7724,該菌株已于2013年6 月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京 市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為 Paenibacillus sp. 〇
[0012] 所述養豬廢水為豬場養豬產生的廢水經過稀釋3-6倍體積后得到的廢水。優選 地，為稀釋5倍后得到的廢水。稀釋液選自自來水或去離子水。稀釋的目的是為小球藻提 供更好的水體微環境并使其更充分接受光照進行光合作用。
[0013] 本發明提供的提高小球藻（Chlorella sp.)在養豬廢水中生物量的方法中， 小球藻的初始接種量為3X10S-5X 10s個/ml養豬廢水；類芽孢桿菌的初始接種量為 1 X 10 4-2 X 10 4g/ml 養豬廢水。
[0014] 優選地，小球藻的初始接種量為4. 3X 10s個/ml養豬廢水；類芽孢桿菌的初始接 種量為1. 26X 10 4g/ml養豬廢水。
[0015] 進一步地，本發明方法中，接種類芽孢桿菌與小球菌的干重比為15-20:1。優選地， 類芽孢桿菌與小球菌的干重比為18:1。
[0016] 本發明將類芽孢桿菌與小球菌在養豬廢水中共培養的培養條件為20_35°C，一天 中光照與黑暗時間比為14-18:6-10,培養3-8天。優選地，28°C培養3天，一天中光照與黑 暗的時間比為16:8。光照可選自然光或人工光源，光照強度為50001UX時促生效果明顯。
[0017] 本發明的上述方法可以在制備生物油脂中應用。
[0018] 本發明還提供了保藏編號為CGMCC N0. 7724的類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.) 及含有其的菌劑在提高小球藻（Chlorella sp.)生物量中的應用。
[0019] 本發明提供了保藏編號為CGMCC N0. 7724的類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)及 含有其的菌劑在減少養殖場廢水污染中的應用。
[0020] 類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)18WLY(保藏編號 CGMCC N0. 7724)為
【申請人】在 前期篩選而得的一株固氮菌類芽孢桿菌，具有適應性強，固氮能力強的特點，可以有效促進 玉米等農作物的產量提高。
【申請人】意外地發現，將該菌與小球藻Chlorella sp. 34-2共培 養于養豬廢水后，發現Paenibacillus sp. 18WLY在短暫抑制Chlorella sp. 34-2的生長后 對其的生物量起到了顯著的促進作用，促進作用高達1. 6倍。這種結果及其用途是本領域 技術人員在微藻生物質能源領域無法預測到的。
[0021] 本發明還提供一種生產生物油脂的方法，將小球藻（Chlorella sp. )34-2和類芽 抱桿菌（Paenibacillus sp.)18WLY共培養于豬場廢水中。
[0022] 本發明的小球藻Chlorella sp. 34-2米自安徽省宣城市，其具有在不滅菌的養 豬廢水中迅速生長的特點（于養豬廢水中培養10天，藻細胞干重的平均增長速率為： 165mg · L 1 · d ^，并可將污水中碳源污染物轉化成高達30%的生物油脂，且其沉降性好， 易于收集。此外，該小球藻對養豬廢水中的碳、氮、磷等營養元素去除效率較高，養豬廢水 經其處理7天后氮、磷去除率分別為60%和85%。再者，該藻環境適應性很強，在20-40°C 和pH 3-11范圍環境下均可良好生長，具有較大的生產應用潛力。本發明首次將小球藻 和類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)共培養于豬場廢水，發現類芽孢感覺對小球藻生物 量的提高產生了顯著促進作用，其穩定期小球藻的生物量達1. 80X 101°個/ml，為未接種 Paenibacillus sp. 18WLY瓶中小球藻生物量（1. 15X 101°個/ml)的1. 6倍，促生作用顯著。 本發明方法解決了養豬廢水處理問題，降低環境污染，類芽孢桿菌的加入改善了養豬廢水 中水體微環境，顯著提高小球藻生物量，降低了微藻生物柴油的生產成本，取得較好的經濟 效益，具有良好的市場應用前景和保護生態的作用。
【附圖說明】
[0023] 圖1為小球藻34-2的生長曲線圖。
【具體實施方式】
[0024] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0025] 實施例1養豬廢水成分測定及稀釋養豬廢水的配制
[0026] 本實施例中養豬廢水來自北京昌平崔村宏運養殖場。養豬廢水的總氮（total nitrogen, TN)的測定方法為堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，根據中華人民共和國國家 環境保護標準HJ 636-2012;而總磷（total phosphorus, TP)的測定方法為鉬酸銨分光光 度法，依據中華人民共和國國家標準GB118WLY93-93。氨氮（NH3-N)及C0D的測定則依據連 華水質快速檢測儀器5B-6C。經上述測定方法測定養豬廢水的TN、NH 3-N、TP以及C0D成分， 測定結果列于表1 :
[0027] 表1養豬廢水成分測定
[0028]
[0029] 取上述養豬廢水加入自來水稀釋為原上清液體積5倍后，分裝于250ml潔凈錐形 瓶中，每瓶l〇〇ml。經加自來水稀釋后污水成分經計算為：TN約為121mg · L \ NH3-N約為 104mg · ml \ TP 約為 16. 4mg · L \ C0D 約為 332mg · L 工。
[0030] 實施例2提高小球藻在養豬廢水中生物量的方法
[0031 ] 1、小球藻及自生固氮菌的分離純化及培養
[0032] (1)小球藻的分離純化及培養：固體平板TAP培養基：瓊脂粉1. 5 % ;挑取平板上 的小球藻Chlorella sp. 34-2單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每周繼 代一次。
[0033] 在小球藻Chlorel la sp. 34-2的TAP平板上挑取單克隆接種于20ml TAP液體培 養基中，繼而取lml培養液接種于100ml TAP液體培養基中，置于25°C光照培養箱中靜置培 養。
[0034] (2)類芽孢桿菌18WLY的分離、純化及培養：固體LB培養基：瓊脂粉1. 5% ;挑取 自Paenibacillus sp. 18WLY單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化菌種，每三天繼 代一次
[0035] 在類芽孢桿菌Paenibacillus sp. 18WLY的LB平板上挑取單克隆接種于20ml LB 培養基中，繼而取lml培養液于100ml LB液體培養基中，置于28°C搖床中震蕩培養，水平搖 床車專速150rpm〇
[0036] 2、類芽孢桿菌18WLY與小球藻34-2共培養
[0037] 將處于對數期的純凈的類芽孢桿菌Paenibacillus sp. 18WLY培養液與純凈的小 球藻Chlorella sp. 34-2培養液分別于4°C 4000rpm下離心10min，獲取細胞沉淀。將細胞 沉淀分別用滅菌去離子水清洗3次，去除其中殘余的培養基成分。
[0038] 根據細胞沉淀的量加入適量的滅菌水懸浮，用渦旋振蕩儀渦旋混勻制備成濃 溶液，按照表2分別向各瓶中接種小球藻Chlorella sp.及類芽孢桿菌Paenibacillus sp. 18WLY于實施例1的100ml滅菌稀釋養豬廢水中，加滅菌水保證所有瓶中液體終體 積相同。利用顯微鏡及血紅細胞計數板控制藻細胞接種量，使接種的小球藻Chlorella sp. 34-2 為 4· 3X108個/ml，7X10 6g/ml (干重）；類芽抱桿菌 Paenibacillus sp.l8WLY 為 1. 26X 10 4g/ml (干重）。所接種類芽孢桿菌與所接種小球藻干重比為18 :1。
[0039] 表2各瓶初始接種量
[0040]
[0041] 將上述各瓶放入25°C光照培養箱中進行培養，其白天模式為50001ux下16h，黑夜 模式8h。每隔24h便對其進行觀察，對比其生長狀況的差異，并利用血球計數板對各組內微 藻細胞數目進行計數。共培養6天后結束發酵。
[0042] 培養觀察發現，空白組及只接種Paenibacillus sp. 18WLY的菌組中瓶均未有明 顯的顏色變化，均未變綠，這是因為其中未接種小球藻Chlorella sp. 34-2而造成的。而 只接種小球藻Chlorella sp. 34-2的陰性對照組（即第3組）與同時接種Paenibacillus sp. 18WLY和小球藻Chlorella sp. 34-2的陽性對照組（即第4組）均有綠色產生。而自接 種后的第3天起，陽性對照組較之于陰性對照組表現出更深的綠色，表明其中微藻細胞的 數量較后者更多。
[0043] 每隔24h使用顯微鏡及血紅細胞計數板對各瓶中微藻細胞進行計數。將計數結果 進行計算統計并繪制生長曲線進行對照，其結果見圖1。如圖1所示，陽性對照組中，小球藻 生長過程中雖然有著較長的延滯期，但其對數期更短，且對數期生物量增長明顯高于未接 種Paenibacillus sp. 18WLY的陰性對照組，而在穩定期時，陽性對照組中小球藻的生物量 為1. 80X 101°個/ml，為陰性對照組中小球藻生物量（1. 15X 10 1(]個/ml)的1. 6倍，促生作 用顯著。
[0044] 以上結果表明，以Paenibacillus sp. 18WLY為代表的類芽孢桿菌可以顯著促進以 Chlorella sp. 34-2為代表的小球藻在養豬廢水中的生物量，這種結果的原因可能與類芽 孢桿菌改善了微藻所處水體的微環境有關。
[0045] 雖然，上文中已經用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發明作了詳盡的描 述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的 范圍。
【主權項】
1. 一種提高小球藻（Chlorella sp.)生物量的方法，其特征在于，在培養小球藻的培 養基中添加類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)。2. -種提高小球藻（Chlorella sp.)在養豬廢水中生物量的方法，其特征在于，在培 養小球藻的養豬廢水中添加類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述小球藻為34-2,其保藏編號為CGMCC NO. 9225,所述類芽孢桿菌為18WLY，其保藏編號為CGMCC NO. 7724。4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述養豬廢水為豬場養豬產生的廢水稀釋 3-6倍后得到的廢水。5. 如權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，小球藻的初始接種量為 3X 10S-5X 10s個/ml養豬廢水；類芽孢桿菌的初始接種量為IX 10 4-2X 10 4g/ml養豬廢 水。6. 如權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，接種類芽孢桿菌與小球菌的干重比 為 15-20:1〇7. 如權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，培養條件為20-35°C，一天中光照與 黑暗時間比為14-18:6-10,培養3-8天。8. 權利要求1-7任一所述方法在制備生物油脂中的應用。9. 保藏編號為CGMCC NO. 7724的類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)及含有其的菌劑在 提高小球藻（Chlorella sp.)生物量中的應用。10. 保藏編號為CGMCC NO. 7724的類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)及含有其的菌劑 在減少養殖場廢水污染中的應用。
【文檔編號】C12P7/64GK105985917SQ201510063872
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月6日
【發明人】陳三鳳, 張蘊之
【申請人】中國農業大學