一種α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法
【專利摘要】一種α?鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，涉及分離材料領域看，包括以下步驟：S1將模板分子與功能單體、交聯劑、溶劑混勻；S2將載體表面進行巰基化處理；S3將S2處理得到的載體加入S1制得的混合溶液中，與功能單體交聯聚合；S4將模板分子從聚合后的載體表面洗脫；S5將S4處理得到分子印跡材料真空干燥。本發明實驗操作簡便，無須通氮、除氧，且用三乙胺調節反應體系pH值即可引發反應，反應條件溫和，時間短，此方法較傳統制備分子印跡方法表現出極大的優越性。
【專利說明】
_種01-鶴當毒肽分子印跡材料制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種分離材料，尤其涉及一種α-鸛膏毒肽分子印跡材料制備方法。
【背景技術】
[0002] 鵝膏毒肽又名鵝膏毒素，英文名為amanitin，是從劇毒磨菇中分離出來的一種多 肽物質，也是一類重要生化試劑，鵝膏毒素在分子生物學、發育生物學、遺傳學、生物化學、 醫學、生物防治等領域具有廣泛的應用價值。鵝膏毒肽是一類雙環八肽，已分離純化的天然 ,T^jn^a-amanitin^-amanitin, γ -amanitin, ε-amanitin,amanin, amaninamide,amanu 11 in,amanu 11 inic acid，和proamanullin。其中α-amanitin的結構式 如下：
[0004] 分子印跡是集分析化學、高分子材料及仿生生物工程等多學科發展起來的新型 "人工受體"合成技術。目前分子印跡技術最成功的應用是識別有機小分子，用于識別多肽 及蛋白質的成功實例非常有限，其原因是生物大分子結構復雜及熱力學因素等，另一主要 原因是多肽和蛋白質價格昂貴，通常難以獲得足夠量用于制備分子印跡聚合物。
[0005] MIP分子印跡材料，相對于NIP分子印跡材料，有更高的吸附容量和更好的選擇性， 但傳統的聚合方式實驗操作復雜，條件苛刻，需無氧環境，并且后續處理過程相對冗長、費 時費力、顆粒均一性較差、原料利用率較低。因此，尋求一種簡單高效制備鵝膏毒肽分子 印跡材料(α-amanitin-MIP)的制備方法至關重要。

【發明內容】

[0006] 針對上述技術問題，本發明提供一種α_鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，包括以 下步驟：
[0007] S1:將模板分子與功能單體、交聯劑、溶劑混勻；
[0008] S2:將載體表面進行巰基化處理；
[0009] S3:將S2處理得到的載體加入S1制得的混合溶液中，通過功能單體與模板分子交 聯聚合；
[0010] S4:用洗脫液將模板分子從聚合后的載體表面洗脫，得到分子印跡材料；
[0011] S5:將S4處理得到分子印跡材料真空干燥；
[0012] 其中，S3步驟中的聚合條件為：用堿將聚合反應液pH調至7~9，40 °C~50 °C下反應 6~12h;所述模板分子為N-乙酰色氨酸丙酰胺。
[0013]以α-鸛膏毒肽分子的一個作用位點，設計合成了α-鸛膏毒肽的特異性識別決定區 作為模板，利用表面印跡法，在二氧化硅載體上修飾制備了專一性吸附鵝膏毒肽的印跡材 料。
[0014]具體地，所述S1中功能單體為3-巰基丙酸;所述交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯； 所述溶劑為二甲基亞砜。
[0015]具體地，所述S1中模板分子與功能單體的摩爾比例為0.15:1~0.25:1，所述功能 單體與交聯劑的摩爾比例為1:2。
[0016] 具體地，所述S1中模板分子、功能單體、交聯劑的摩爾比例為0.2:1:2。
[0017] 具體地，所述S1中還包括輔助交聯劑，所述輔助交聯劑為季戊四醇四-3-巰基丙酸 酯，，所述輔助交聯劑與交聯劑的摩爾比例為9:4。
[0018] 具體地，所述S2中的巰基化處理方法包括如下步驟：
[0019] S2a:取載體，溶于水中，加甲醇超聲使其分散；
[0020] S2b:向S2a得到的反應液中加入甘油，再超聲，超聲后通入氮氣；
[0021] S2c:取（3-巰丙基)_三乙氧基硅烷與甲醇混合均勻，加入S2b得到的反應液中，攪 拌使其混合均勻；
[0022] S2d:向S2c得到的反應液中加入氨水，85°C氮氣保護下反應lh后，停止氮氣，再反 應5h;
[0023] S2e:反應結束后離心收集載體，用無水乙醇和去離子水分別洗滌，40°C下真空干 燥即得。
[0024]具體地，所述S3中的堿為三乙胺。
[0025]具體地，步驟S4中所述洗脫液分為第一洗脫液和第二洗脫液，第一洗脫液為甲醇 與乙酸的體積比為9:1的混合溶液，第二洗脫液為甲醇。
[0026] 具體地，所述S5中的真空干燥溫度為40~50°C。
[0027]本發明采用藉配體識別決定區印跡策略，利用抗原決定基(短肽片段）印跡，制備 識別多肽和蛋白質的MIPs。利用硫醇-烯點擊反應制備分子印跡聚合物，實驗操作簡便，無 須通氮、除氧，且用三乙胺調節反應體系pH值即可引發反應，反應條件溫和，時間短，此方法 較傳統制備分子印跡方法表現出極大的優越性。
[0028]本發明解決MIPs識別生物大分子過程中的傳質速率慢和吸附容量較低等問題，擬 采用硅小球表面印跡法和沉淀聚合印跡法等，研制具有納米結構的表面印跡微球和MIPs納 米粒子，制備性能優異的新型分離材料。
[0029] 與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明旨在選擇鵝膏毒肽的一個識別位 點，設計合成鵝膏毒肽的特異性識別決定區作為模板，采用巰基化二氧化硅微球，并利用表 面印跡的方法，通過巰基與雙鍵之間的點擊反應在二氧化硅表面合成了 α-鵝膏毒肽-MIP分 子印跡材料。
[0030] 為了更好地理解和實施，下面詳細說明本發明。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1:模板分子的制備
[0032] 本發明的模板分子為N-乙酰色氨酸丙酰胺，其制備方法包括以下步驟：
[0033] a、稱取4.0g的N-乙酰色氨酸，量取100ml甲醇加入250ml的三頸燒瓶中在超聲環境 下溶解充分；
[0034] b、在上述步驟的混合溶液中加入5.0ml的濃硫酸作為催化劑，于60 °C的水浴環境 下回流3個小時，使N-乙酰色氨酸和甲醇酯化充分；
[0035] c、待裝置完全冷卻至室溫后，利用1. Omol/L的K2C03溶液調節混合液的pH為7，然后 加入飽和NaCl溶液使之靜置分層；
[0036] d、30min后，用120ml的二氯甲烷分三次萃取該混合液；
[0037] e、再把得到的二氯甲烷有機層分別用50ml 1.Omol/L K2C03溶液和60ml的去離子 水各洗一次；
[0038] f、最后把分液后得到的有機溶液里的二氯甲烷在30°C旋轉蒸干，得到白色固體；
[0039] g、接著，再把所得的白色固體溶于50ml的丙胺和50ml的甲醇組成的混合液中，常 溫攪拌48h;
[0040] h、然后在55°C下把未反應的丙胺旋轉蒸干，得到橙黃色粗品；
[0041] i、最后用三氯甲烷重結晶三次后，在40°C的烘箱中烘干，得到白色固體產物。
[0043] 實施例2:表面巰基化的二氧化硅的制備
[0044]本發明的載體為表面巰基化的二氧化硅，其制備方法包括以下步驟：
[0045] a、取4.0g二氧化娃微球，超聲分散于5ml的去離子水中，加入120ml甲醇，超聲分散 30min；
[0046] b、向本實施例步驟a處理得到反應液中加入120ml的甘油，再超聲10min，將混合液 轉入500ml的三口燒瓶中，通20min氮氣，得到混合溶液一；
[0047] c、取4ml的（3-巰丙基）-三乙氧基硅烷與40ml甲醇混合均勻，并倒入混合溶液一 中，開始攪拌反應，得到混合溶液二；
[0048] d、在混合溶液二中加入10ml的氨水，于85°C、氮氣保護下反應lh后，停止氮氣保護 后再反應5h;
[0049] e、待反應完畢，離心收集巰基功能化的二氧化硅微球后，用無水乙醇和去離子水 分別洗滌3次;將清洗后的二氧化硅微球置于40°C、真空環境下進行干燥；即完成二氧化硅 微球表面巰基化。
[0050] 實施例3:α_鸛膏毒肽表面分子印跡材料(a-amanitin-MIP)的制備
[0051] 本發明的α-鸛膏毒肽表面分子印跡材料的制備方法如下：
[0052] S1:將實施例1制得的模板分子與3-巰基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇 四-3-巰基丙酸酯加入到二甲基亞砜的溶液中攪拌均勻;模板分子、3-巰基丙酸與乙二醇二 甲基丙烯酸酯的摩爾比為0.2:1:2;所述輔助交聯劑季戊四醇四-3-巰基丙酸酯與交聯劑乙 二醇二甲基丙烯酸酯的摩爾比為9:4;
[0053] S2:將實施例2處理得到的巰基化二氧化硅微球加入本實施例S1步驟制得的混合 溶液中，用三乙胺調節反應液pH約為8,在40°C下聚合反應6小時；
[0054] S3:將S2處理得到的二氧化硅微球從混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/ v)混合溶液和甲醇作洗脫劑進行沖洗；
[0055] S4 :將沖洗后的二氧化硅微球置于40°C的真空環境下進行干燥處理，制得α-amanitin-MIP分子印跡材料。
[0056] 實施例4:α_鸛膏毒肽表面分子印跡材料(a-amanitin-MIP)的制備
[0057]本發明的α-鸛膏毒肽表面分子印跡材料的制備方法如下：
[0058] S1:將實施例1制得的模板分子與3-巰基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇 四-3-巰基丙酸酯加入到二甲基亞砜的溶液中攪拌均勻;模板分子、3-巰基丙酸與乙二醇二 甲基丙烯酸酯的摩爾比為0.15:1:2;所述輔助交聯劑季戊四醇四-3-巰基丙酸酯與交聯劑 乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩爾比為9:4;
[0059] S2:將實施例2處理得到的巰基化二氧化硅微球加入本實施例S1步驟制得的混合 溶液中，用三乙胺調節反應液pH約為8,在40°C下聚合反應9小時；
[0060] S3:將S2處理得到的二氧化硅微球從混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/ v)混合溶液和甲醇作洗脫劑進行沖洗；
[0061 ] S4 :將沖洗后的二氧化硅微球置于45°C的真空環境下進行干燥處理，制得α-amanitin-MIP分子印跡材料。
[0062] 實施例5:α_鸛膏毒肽表面分子印跡材料(α-amanitin-MIP)的制備
[0063] 本發明的α-鸛膏毒肽表面分子印跡材料的制備方法如下：
[0064] S1:將實施例1制得的模板分子與3-巰基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇 四-3-巰基丙酸酯加入到二甲基亞砜的溶液中攪拌均勻;模板分子、3-巰基丙酸與乙二醇二 甲基丙烯酸酯的摩爾比為0.25:1:2;所述輔助交聯劑季戊四醇四-3-巰基丙酸酯與交聯劑 乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩爾比為9:4;
[0065] S2:將實施例2處理得到的巰基化二氧化硅微球加入本實施例S1步驟制得的混合 溶液中，用三乙胺調節反應液pH約為8,在40°C下聚合反應12小時；
[0066] S3:將S2處理得到的二氧化硅微球從混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/ v)混合溶液和甲醇作洗脫劑進行沖洗；
[0067] S4 :將沖洗后的二氧化硅微球置于50°C的真空環境下進行干燥處理，制得α-amanitin-MIP分子印跡材料。
[0068]本發明并不局限于上述實施方式，如果對本發明的各種改動或變形不脫離本發明 的精神和范圍，倘若這些改動和變形屬于本發明的權利要求和等同技術范圍之內，則本發 明也意圖包含這些改動和變形。
【主權項】
1. 一種α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于包括以下步驟： Sl:將模板分子與功能單體、交聯劑、溶劑混勻； S2:將載體表面進彳丁疏基化處理； S3:將S2處理得到的載體加入Sl制得的混合溶液中，通過功能單體與模板分子交聯聚 合； S4:用洗脫液將模板分子從聚合后的載體表面洗脫，得到分子印跡材料； S5:將S4處理得到分子印跡材料真空干燥； 其中，S3步驟中的聚合條件為：用堿將聚合反應液pH調至7~9，40°C~50°C下反應6~ 12h； 所述模板分子為N-乙酰色氨酸丙酰胺。2. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述Sl中功 能單體為3-巰基丙酸;所述交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯;所述溶劑為二甲基亞砜。3. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述Sl中模 板分子與功能單體的摩爾比例為〇. 15:1~0.25:1，所述功能單體與交聯劑的摩爾比例為1: 2〇4. 根據權利要求3所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述Sl中模 板分子、功能單體、交聯劑的摩爾比例為〇. 2:1:2。5. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述Sl中還 包括輔助交聯劑，所述輔助交聯劑為季戊四醇四-3-巰基丙酸酯，所述輔助交聯劑與交聯劑 的摩爾比例為9:4。6. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于所述S2中的 巰基化處理方法包括如下步驟： S2a:取載體，溶于水中，加甲醇超聲使其分散； S2b:向S2a得到的反應液中加入甘油，再超聲，超聲后通入氮氣； S2c:取(3-巰丙基)-三乙氧基硅烷與甲醇混合均勻，加入S2b得到的反應液中，攪拌使 其混合均勻； S2d:向S2c得到的反應液中加入氨水，85°C氮氣保護下反應Ih后，停止氮氣，再反應5h; S2e:反應結束后離心收集載體，用無水乙醇和去離子水分別洗滌，40°C下真空干燥即 得。7. 根據權利要求6所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述載體為 二氧化硅微球。8. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述S3中的 堿為二乙胺。9. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:步驟S4中所 述洗脫液分為第一洗脫液和第二洗脫液，第一洗脫液為甲醇與乙酸的體積比為9:1的混合 溶液，第二洗脫液為甲醇。10. 根據權利要求1所述的α-鵝膏毒肽分子印跡材料制備方法，其特征在于:所述S5中 的真空干燥溫度為40~50°C。
【文檔編號】B01J20/30GK105885049SQ201610308678
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】滕偉迪, 梁勇, 湯又文, 袁嫣昊, 譚杰安
【申請人】華南師范大學