從五指毛桃果中提取喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及其用圖
【專利摘要】本發明公開了一種從五指毛桃果中提取、分離一種黃酮類化合物—喬松素?7?O?β?D?葡萄糖苷的方法及其用途，屬于植物源農藥技術領域。具體是通過將五指毛桃果粗提物經過大孔樹脂柱層析，Sephadex LH?20凝膠柱層析和重結晶的方法分離得到化合物，該化合物對柑橘采后病原菌—意大利青霉具有較好的抑菌活性，對柑橘青霉病有較好的抗病性，可用于開發成一種新型的植物源柑橘防腐保鮮劑。
【專利說明】
從五指毛桃果中提取喬松素-7-0-fH)-葡萄糖苷的方法及其 用途
技術領域
[0001]本發明屬于植物源農藥技術領域，具體涉及到一種從五指毛桃果中提取、分離一 種黃酮類化合物一喬松素m_D_匍萄糖苷的方法及其在柑橘米后保鮮中的用途。
【背景技術】
[0002] 五指毛桃果(Ficus simplicissima Lour.)為桑科無花果屬植物裂掌格的果實， 收載于歷年《中國藥典》和多種中藥學古書籍中。五指毛桃是廣東地區的道地中藥材，具有 很好的益氣健脾功效，有"廣東人參"之美譽。五指毛桃性平，味甘、辛，有健脾補肺、利濕舒 筋之功，可用于脾虛浮腫、食少無力、肺癆咳嗽、盜汗、風濕痹痛、產后無乳等癥，在廣東民間 使用歷史悠久。現代藥理學研究表明五指毛桃可以保護胃黏膜、減輕肝損傷、提高機體免疫 力、減輕腦缺血缺氧的損害。動物急性毒性實驗研究表明小鼠灌服五指毛桃水提物后14d 內，動物均無死亡，各臟器均無異常。表明五指毛桃毒性極低，生物安全性好。關于五指毛桃 的抗菌活性研究，僅見五指毛桃水煎煮提取液對大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌 有抑制作用。
[0003] 由意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和指狀青霉(Penicillium digitatum)引起的綠霉病，是造成柑橘采后腐爛發生的最主要的兩種病害，腐爛率一般為 10%~30%，嚴重時可高達40%~50%以上，造成巨大的經濟損失。長期以來，主要采用化 學合成藥劑作為保鮮劑對柑橘進行保鮮，這些化學殺菌劑能殺死或抑制病原微生物的生 長，有較好的防腐保鮮效果，但同樣會造成藥劑殘留、污染環境，抗藥性等弊端。另外，一些 化學防腐劑有潛在的致癌、致突變、致畸的可能性。
[0004] 近年來，人們開始轉向從天然植物中尋找安全環保的柑橘植物源保鮮劑。天然植 物源保鮮劑具有高效、低毒、低殘留、無污染、使用安全等優點，在應用上易受消費者歡迎。 另外，植物源藥劑不易產生抗藥性和不會造成環境污染問題。因此，有必要從天然植物中尋 找、開發天然植物源防腐劑對柑橘進行保鮮以減少對化學藥劑的依賴。
[0005] 喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷是一種黃酮類化合物，目前從植物中分離到此化合物 的報道較少，主要存在于羽葉金合歡、扯根菜、扁枝槲寄生、南酸棗、老鷹茶、玫瑰花、青皮 木、荔枝核、光果甘草和青錢柳等植物中。尚未見五指毛桃果中喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷 的報道，本發明為首次從五指毛桃果中分離得到喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種從五指毛桃果中分離得到一種黃酮類化合物一喬松素-7-0-P-D-葡萄糖苷的方法。
[0007] 本發明的另一個目的是提供喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷在柑橘采后保鮮劑中的應 用。
[0008] 本發明提供的黃酮化合物的結構如下：
[0010]本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0011] (1)五指毛桃果于鼓風干燥箱中40-50°C烘干2h，粉碎機粉碎后過40目篩，取篩下 藥材粉末，以體積分數為90%的乙醇溶液為提取溶劑，按照料液比(kg: L) = 1: (10-40)超聲 波輔助提取30_90min，超聲波輔助提取的溫度為50-80°C，重復提取3次，合并提取液并過 濾，回收乙醇，濾液濃縮至無醇味，即得五指毛桃果提取物浸膏；
[0012] (2)將步驟（1)中的五指毛桃果提取物浸膏懸浮于10-20倍浸膏重量的蒸餾水中， 經D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30%乙 醇、5倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 %乙醇梯度洗脫，收集95 %乙醇洗脫液，濃縮至無醇 味，即得95 %乙醇洗脫濃縮物；
[0013] (3)將步驟(2)中95 %乙醇洗脫濃縮物溶解于甲醇中，95%乙醇洗脫濃縮物與甲醇 的質量體積比（g:mL)為（1.0-5.0): 10,將該溶液于離心機上5000-8000r/min離心3-10min， 取上清液用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用甲醇洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，薄層 層析合并目標化合物流分，減壓濃縮，向得到的濃縮物中加入甲醇并加熱至濃縮物剛好能 全部溶解為止，放入4 °C冰箱中，析出淡黃色沉淀物即為目標化合物。
[0014] 其中步驟(2)采用的大孔樹脂還可為除D101型之外的其他弱極性和低極性大孔樹 脂。
[0015] 本發明制得的目標化合物喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷可添加常規輔料制成防治柑 橘采后病原菌的藥物組合物，用于柑橘采后防腐保鮮，防治由意大利青霉（Penicillium italicum)引起的青霉病和指狀青霉(Penicillium digitatum)引起的綠霉病。
[0016]王靜等通過系統溶劑萃取老鷹茶提取物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水 飽和正丁醇溶劑萃取，再通過大孔樹脂柱分離正丁醇萃取部位，用乙醇-水系統梯度洗脫， 分為10%、30%、50%、95 % 4個部分，對95 %部分用硅膠柱進行反復分離，并結合0DS、 Sephadex LH-20和制備型HPLC分離純化出喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷(王靜，陸維麗，張義 龍，唐敏芳，湯文建，李俊.老鷹茶的化學成分研究[J].安徽醫科大學學報，2014,49 (4): 479-483.)。付明等通過系統溶劑萃取扯根菜提取物，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃 取，醋酸乙酯部位反復經硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜和薄層色譜等，最終從醋酸乙 酯部分分離得到喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷(付明，魏麟，余娟，胡朝暾.扯根菜的化學成分 研究[J].中國藥學雜志，2013,48(22): 1911-1914)。劉紅燕通過系統溶劑萃取玫瑰花提取 物，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯部位反復經硅膠柱色譜、 Sephadex LH-20柱色譜，最終從醋酸乙酯部分分離得到喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷（劉紅 燕.玫瑰花的化學成分研究[J].天然產物研究與開發，2013，25(1): 47-49.)。上述方法都使 用了大量的有機溶劑，硅膠柱層析，甚至是制備高效液相色譜技術，需要的成本高，不利于 大樣品量的制備。
[0017]本發明的優點在于有機溶劑使用量少，操作步驟簡單，適合規模化生產制備喬松 素-7-O-0-D-匍萄糖昔。
【附圖說明】
[0018 ]圖1為實施例1制得的喬松素m_D_匍萄糖苷的結構式；
[0019]圖2為實施例1制得的喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷的核磁共振氫譜；
[0020 ]圖3為實施例1制得的喬松素_7 -O-0-D-葡萄糖苷的核磁共振碳譜；
[0021 ]圖4為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌的抑制效果圖；
[0022]圖5為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲顯微形態的影響圖；
[0023] 圖6為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲生長量的影響圖；
[0024] 圖7為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲相對電導率的影響圖；
[0025] 圖8為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌幾丁質酶活性的影響圖；
[0026] 圖9為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌0-1，3-葡聚糖酶活性的影響。
【具體實施方式】
[0027]實施例1:化合物的制備方法
[0028]五指毛桃果于鼓風干燥箱中45°C烘干2h，粉碎機粉碎后過40目篩，取篩下的五指 毛桃果粉末5. OKg，用50L體積分數為90 %的乙醇溶液浸泡，超聲波輔助提取60min，提取溫 度為60°C，重復三次至提取液顏色變淡為止，合并提取液并過濾，濾液在45°C條件下濃縮至 無醇味，共得浸膏350g。將浸膏懸浮于4L蒸餾水中，經D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫 至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30 %乙醇、5倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 % 乙醇梯度洗脫，水洗脫組分棄用，其他洗脫組分濃縮干燥得干膏，備用。95 %乙醇洗脫物經 干燥得到7.5g粉末。將7.5g 95 %乙醇洗脫部位干燥粉末溶解于20mL甲醇中，5000-8000r/ min離心6min，取上清液經Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集8-10個柱體積洗脫 液，薄層層析檢測合并相同流分，得到A~I共8個流分。經檢測流分E為目標化合物流分，取 250mg流分E溶解于3.0-5. OmL甲醇中并加熱使其全部溶解，然后放入4°C冰箱中，經甲醇重 結晶析出淡黃色沉淀物21.5mg。
[0029] 化合物的結構確證JH-匪R(600MHz，DMS0-d6)顯示一個1-取代苯環信號SH 7.55 (211，(1，了 = 7.6泡，11-2'，6'），7.44(311，111，11-3'，4'，5'），以及一對間位耦合質子信號6.21 (lH，d，J= 1.5Hz，H-8)，6.16(lH，d，J= 1.5Hz，H-6)，還有一個酚羥基質子信號12.05(5_ 〇11)，5.66(111，(1，了=12.9，11-2)，4.99(111，(1，了 = 7.4泡，11-1"）為糖的端基質子，確定其為0-構型，13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)數據顯示該化合物有21個C，結合H譜確定化合物為一個黃 酮糖苷類化合物，ESI-MS給出準分子離子峰m/z 417.00[M-Hr，其他H信號如下：3.66(1H， d，J = 9.4Hz，H-6"a)，3.15~3.45(6H，H-3a，2"，3"，4"，5"，6"b)，2.85(lH，d，J=16.7Hz，H-3b) </3C-NMR( 150MHz，DMS0-d6)，79 ? 1 (C-2)，42.6(C-3)，197.3(04)，163.4(C-5)，97.1(C-6)，165.8(C-7)，96.0(C-8)，163.0(C-9)，103.7(C-10)，138.9(C-1'），127.2(02'，6'）， 129.1(03'，4'，5'），100.0(C-l"），73.5(C-2"），76.8(C-3"），69.9(C-4"），77.6(C-5"）， 61.0(C_6"）。鑒定該黃色沉淀物為喬松素-7-0-0-D-匍萄糖昔。
[0030] 實施例2:化合物抑制柑橘采后意大利青霉菌活性
[0031 ] 1材料意大利青霉(Penicillium italicum，ACCC 30399)購于中國農業微生物菌 種保藏中心。培養基:PDA和(不含瓊脂粉的PDA)培養基;細胞壁降解酶誘導培養基(KN03 2.0g，K2HP〇4 1.0g，MgS〇4.7H20 0.5g，KCl 0.5g，FeS〇4 O.Olg，維生素出 0.1g，L-天門冬酰 胺 0.5g，幾丁質或葡聚糖、CMC 10.0g，H2〇 1000mL)，pH 調至 5.0,分裝后 121°C 滅菌 20min。 [0032] 2實驗方法
[0033] ①喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌的抑制效果
[0034] 采用生長速率法測定喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲生長的抑制毒 力。從已活化的意大利青霉菌落邊緣用滅菌的打孔器打取菌餅（〇 =5mm)，菌絲面朝下放置 于已經凝固的含藥培養基中央，27°C培養。每個處理4次重復，試驗重復2次。培養7d后十字 交叉法測量菌落直徑，與空白對照比較，采用下面公式計算各濃度藥物處理對菌絲生長的 抑制率。根據生物統計幾率值換算表，將抑制百分率換算成幾率值，采用DPS 7.05軟件以試 驗中設定的濃度為橫坐標，抑制幾率值為縱坐標，得到藥劑的毒力回歸方程和有效濃度EC50 和 EC95。
[0036]②喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲形態的影響 [0037] 將喬松素溶液加入50mL PDB培養基的三角瓶中，使其終濃度達到0.2528mg ? mL一1 (EC5Q與EC95之和的一半），不加喬松素-7-CH3-D-葡萄糖苷溶液作為對照組，向每個三角瓶 中加入200yL意大利青霉菌懸液，置于27°C，180rpm振蕩培養24和48h后，在10x40倍電子顯 微鏡下觀察。
[0038] ③喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌孢子萌發的影響
[0039] 無菌條件下，配制意大利青霉孢子懸浮液，用移液器按9:1比例將菌懸液與不同濃 度的喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷溶液滴入凹玻片凹槽中，使喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷作用 的終濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg ? mL-1，每個處理重復3次。將玻片置于27°C培 養，24h后進行鏡檢，觀察各處理和對照組的意大利青霉孢子的萌發情況，在顯微鏡下統計 100-150個孢子的萌發數，計算孢子萌發率和抑制率。
[0042]④喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲生長量的影響 [0043]在無菌的條件下，取l.OmL菌懸液加入裝有100mL PDB液體培養基的250mL三角瓶 中，27°C、180rpm振蕩培養48h，待菌絲球生長良好時加入喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理 液，使終濃度為0.2528mg ? ml/1，對照加入等量的無菌水。分別在繼續培養的0、3、6、12、24h 取樣，用布氏漏斗抽濾收集菌絲，用蒸餾水對菌絲沖洗3次后，在真空冷凍干燥機中將菌絲 凍干至恒重，即為菌絲體的重量。每個處理重復5次，試驗重復2次。
[0044]⑤喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌細胞膜透性影響
[0045]電導率法測定:取1 .OmL菌懸液加入裝有100mL PDB液體培養基的250mL三角瓶中， 27°C、180rpm振蕩培養48h。稱取等量的菌絲分別放入裝有100mL0.2528mg ? mL-1喬松素-7- O-0-D-葡萄糖苷溶液和lOOmL無菌水的250mL三角瓶中，在27°C、180rpm的搖床上繼續培養， 在處理0、1、2、4、6h取樣，在轉速為3000rpm離心10min，采用DDS-11A數顯電導率儀測定對照 組和喬松素-7-O-0-D-匍萄糖苷處理的溶劑空白電導率(Co)和上清液的電導率(Ct)，最后將 菌絲沸水浴保溫lOmin，待冷卻至室溫后，測定其電導率(Cd)。每個處理重復三次。用相對電 導率(relative electric conductivity，REC)來表示細胞膜透性，相對電導率（％ )的計算 公式如下：
[0047]⑥幾丁質酶(Chitinase，CHI)活性的測定
[0048] 幾丁質酶液的提取:取1.(^菌絲，加入511^乙酸-乙酸鈉緩沖液(含0.謂4115.2，含 5mM0-巰基乙醇；ImM聚乙二醇6000;lmM EDTA;4%PVP和0.05%Triton X-100)，冰浴下研磨 呈勻漿后離心(4°C、12 000rpm，20min)，收集上清液備用。
[0049] 幾丁質酶活性的測定參考Boiler的方法并稍作改進，以每毫克蛋白酶解膠狀幾丁 質產生1 X 10-9moL N-乙酰葡萄糖胺為一個CHI活性單位(U ? mg-protein)。
[0050] ⑦0-1，3-葡聚糖酶(0-1，3飛111(^1^此，61〇])活性的測定
[0051] 0-1，3-葡聚糖酶液的提取方法與幾丁質酶液的提取方法相同。0-1，3-葡聚糖酶活 性測定參考Abeles和Forrence的方法并稍作改進，以菌絲中每毫克蛋白分解昆布多糖產生 lyg葡萄糖為1個GLU活性單位(U ? mg-iprotein)。
[0052]⑧數據統計分析采用SPSS 19.0和DPS 7.05數據統計軟件對試驗數據進行統計分 析，用Duncan新復極差法進行顯著性差異分析，顯著性差異水平：顯著(P〈0.05);極顯著(P〈 0.01);采用Excel 2003軟件進行數據處理及圖形制作。
[0053] 3實驗結果
[0054] ①喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌的抑制效果
[0055] 試驗結果如說明書附圖中圖4所示，隨著化合物處理濃度的逐漸升高，其對意大利 青霉的抑菌效果也逐漸增強；當處理濃度為〇.8mg ? ml/1時，對意大利青霉的抑菌率達到 100%，完全抑制了意大利青霉的生長。采用DPS v8.05軟件進行統計分析，得到以抑菌率幾 率值為Y，藥劑濃度(0 ? 025~0 ? 4mg ? mL-〇對數值為X的毒力回歸方程:Y = 7 ? 8219+3 ? 1150X， 相關系數r為0.9836,說明喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷的處理濃度與抑菌率呈顯著的線性關 系；同時也計算出EC 5q和EC95分別為0.0846和0.4209mg ? mL一、
[0056] ②喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲形態的影響
[0057]試驗結果如說明書附圖中圖5所示，對照組的意大利青霉菌絲細胞壁光滑、粗細一 致、分枝正常、內部原生質分布均勻（圖5A);喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理12h后，意大利 青霉菌絲頂端膨大，菌絲纏繞扭結、粗細不均（圖5B);處理24h后的菌絲細長、皺縮、分枝增 多，甚至出現內含物消解、菌絲空腔和斷裂現象(圖5C)。
[0058]③喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌孢子萌發的影響 [0059]由表1可看出，不同濃度的喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理對意大利青霉的孢子萌 發有顯著的抑制作用。隨著處理濃度的增加，意大利青霉菌的孢子萌發率均逐漸減少，抑制 效果增強，且各處理與對照組之間的差異極顯著(P〈〇. 01)。當喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處 理濃度為〇. 4mg ? ml/1時，該處理的孢子萌發率僅為3.5 %，抑制率高達96.3 %。綜上所述，喬 松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉的孢子萌發具有顯著的抑制效果。
[0060]表1喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉孢子萌發的抑制作用
[0062]注:表中數據為三次重復的平均值土標準方差，同列有不同大小寫字母的表示經 鄧肯氏多重檢驗分別在0.01及0.05水平差異顯著。
[0063]④喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌絲生長量的影響
[0064] 由說明書附圖中圖6可知，在整個培養期間，對照組的菌絲生長量呈上升趨勢，至 24h時，生長量達到最大值，菌絲干重為1.22±0.032g ? 100mL 1;而加入喬松素-7-O-0-D-葡 萄糖苷(0.2528mg ? ml/1)處理的培養基中菌絲生長明顯受到抑制，培養6h內，菌絲的生長量 急劇下降，隨后下降較為平緩，至24h時菌絲的生長量達到最小值，干重為0.53±0.011g* 100ml/ 1，僅為同期對照組菌絲干重的43.4%。由此可見，喬松素對意大利青霉的菌絲生長具 有顯著的抑制效果。
[0065] ⑤喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉菌細胞膜透性的影響
[0066] 細胞膜遭到破壞時，菌體內部電解質會泄漏外滲到菌液中，從而使菌液的電導率 升高，菌絲相對電導率的大小可以間接反映細胞膜透性的完整性。由說明書附圖中圖7可 知，對照組的相對電導率呈緩慢上升的變化趨勢;喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理組相對電 導率隨處理時間而逐漸升高，其上升幅度顯著高于對照組(P〈〇.05)，說明隨著時間的延長， 意大利青霉的細胞膜透性逐漸增加，細胞中大量的內含物向外滲漏，使得菌液電導率快速 上升，破壞細胞膜透性的完整性。
[0067] ⑥喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉細胞壁降解酶活性的影響
[0068] 喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對意大利青霉細胞壁降解酶活性的影響結果見說明書 附圖中的圖8。從圖8可以看出，對照組的菌絲幾丁質酶(CHI)活性呈緩慢下降趨勢，在整個 培養期間沒有顯著差異;而喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理的菌絲CHI活性先顯著上升，在 處理2h時達到最大值，隨后緩慢下降。在處理2、4、6h時的CHI活性分別為55.6、50.7和 52.2U ?mgiprotein，均比同期對照組的CHI活性高，由此可見喬松素顯著提高意大利青霉 細胞降解酶CHI活性。
[0069] 喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷同樣也會增加意大利青霉菌中另外一個細胞壁降解相 關酶0-1，3_葡聚糖酶(GLU)活性的變化，它是分解真菌細胞壁的一種溶菌酶。由說明書附圖 中圖9可知，對照組的菌絲0-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性呈緩慢上升的變化趨勢;而喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理的菌絲0-1，3-葡聚糖酶(6〇])活性呈急劇上升趨勢，且上升幅度顯著 大于對照組。在處理2、4、6h時的GLU活性分別為5 ? 59、5 ? 17和6 ? 23U ? mg-protein，均比同期 對照組的GLU活性高，可見GLU活性的增高會引起意大利青霉菌細胞壁發生自溶現象。
【主權項】
1 · 一種從五指毛桃果中提取喬松素_7-〇-β-?-匍萄糖苷的方法，其特征在于:所述喬松 素-7-0-?Η)_葡萄糖苷的結構如下：2. 如權利要求1所述的一種從五指毛桃果中提取喬松素-7-〇-β-?-匍萄糖苷的方法，其 特征在于:包括以下步驟： (1) 五指毛桃果于鼓風干燥箱中40-50°C烘干2h，粉碎機粉碎后過40目篩，取篩下藥材 粉末，以體積分數為90%的乙醇溶液為提取溶劑，按照料液比(kg: L) = 1: (10-40)超聲波輔 助提取30_90min，超聲波輔助提取的溫度為50-80°C，重復提取3次，合并提取液并過濾，回 收乙醇，濾液濃縮至無醇味，即得五指毛桃果提取物浸膏； (2) 將步驟（1)中的五指毛桃果提取物浸膏懸浮于10-20倍浸膏重量的蒸餾水中，經 D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30%乙醇、5 倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 %乙醇梯度洗脫，收集95 %乙醇洗脫液，濃縮至無醇味， 即得95%乙醇洗脫濃縮物； (3) 將步驟(2)中95 %乙醇洗脫濃縮物溶解于甲醇中，95 %乙醇洗脫濃縮物與甲醇的質 量體積比（g:mL)為（1 · 0-5 ·0): 10，將該溶液于離心機上5000-8000r/min離心3-10min，取上 清液用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用甲醇洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，薄層層析 合并目標化合物流分，減壓濃縮，向得到的濃縮物中加入甲醇并加熱至濃縮物剛好能全部 溶解為止，放入4 °C冰箱中，析出淡黃色沉淀物即為目標化合物。3. 如權利要求2所述的一種從五指毛桃果中提取喬松素-7-〇-β-?-匍萄糖苷的方法，其 特征在于：包括以下步驟：五指毛桃果于鼓風干燥箱中45°C烘干2h，粉碎機粉碎后過40目 篩，取篩下的五指毛桃果粉末5. OKg，用50L 90 %乙醇浸泡，超聲波輔助提取60min，提取溫 度為60°C，重復三次至提取液顏色變淡為止，合并提取液并過濾，濾液在45°C條件下濃縮至 無醇味，共得浸膏350g;將浸膏懸浮于4L蒸餾水中，經D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫 至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30 %乙醇、5倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 % 乙醇梯度洗脫，水洗脫組分棄用，其他洗脫組分濃縮干燥得干膏，備用；95 %乙醇洗脫物經 干燥得到7.5g粉末，將7.5g 95 %乙醇洗脫部位干燥粉末溶解于20mL甲醇中，5000-8000r/ min離心6min，取上清液經Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集8-10個柱體積洗脫 液，薄層層析檢測合并相同流分，得到A~I共8個流分;經檢測流分E為目標化合物流分，取 250mg流分E溶解于3.0-5. OmL甲醇中并加熱使其全部溶解，然后放入4°C冰箱中，經甲醇重 結晶析出淡黃色沉淀物21.5mg。4. 權利要求1所述化合物在制備柑橘采后防腐保鮮劑中的應用，其特征在于:所述柑橘 采后病原菌選自意大利青霉和指狀青霉。5. -種防治柑橘采后病原菌的藥物組合物，其特征在于：包括權利要求1所述的化合 物。
【文檔編號】C07H1/08GK105820201SQ201610322974
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月13日
【發明人】萬春鵬, 陳楚英, 陳明, 陳金印
【申請人】江西農業大學