一種促進產油微藻細胞和油脂快速積累的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種促進產油微藻細胞和油脂快速積累的培養方法，屬于生物能源領域。
【背景技術】
[0002]生物柴油以生物體油脂為原料，通過分解、酯化得到的長鏈脂肪酸甲酯，是一種可以替代化石燃料使用的環保、可再生能源。生物柴油的原料來自植物油脂(大豆油、玉米油等)、動物油脂(各種動物脂肪)、微藻油脂以及廢棄食用油(地溝油)等。
[0003]目前，微藻作為生物柴油原料已在國際上得到廣泛應用。與其它油脂原料相比，微藻具有細胞生長快，油脂含量高，不占用耕地等優點。微藻的培養方式主要有自養、異養和兼養三種培養方式。目前，微藻的產業化生產主要采用自養培養方式。自養培養細胞培養周期長，細胞產量低，從而導致油脂產量低和成本較高。兼養培養需要在滅菌的光生物反應器中進行藻細胞的培養，需要同時保證無菌培養和充足的光照條件，對培養設備的要求極高，且設備的放大較難。異養培養藻細胞生長較快，但油脂含量低，通常難以利用。因此，需要一種切實可行的培養方法來解決以上的問題。本發明利用二次培養的方法解決了微藻大規模培養生物量和油脂不能同時達到最大的問題。第一階段以添加黃腐酸的培養基進行異養培養，能大量積累藻細胞，克服了自養培養細胞生長周期長，生物量低等困難;第二階段以異養培養藻細胞作為種子液，在自養培養的條件下，米用氮、磷缺陷、高鹽和植物誘導物誘導等環境壓力來誘導藻細胞內油脂的積累。本發明采用添加植物誘導物的黃腐酸培養基進行光照培養，解決了藻細胞油脂產率低的問題。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供一種促進產油微藻細胞和油脂快速積累的培養方法，可以有效解決【背景技術】中的問題。
[0005 ]為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案:
[0006]本發明提供一種促進產油微藻細胞和油脂快速積累的培養方法，包括以下步驟:
[0007]步驟1、制備基于黃腐酸的異養和自養培養基，具體為:異養培養階段，選擇kuhl培養基作為單針藻的基本培養基，分裝300ml進入500ml的三角瓶中，按1g L—1的量加入葡萄糖作為碳源，調整pH值為6.8?7.1，加入80mg L—1的黃腐酸，自養培養階段，選擇kuhl培養基作為單針藻的基本培養基，調整pH值為7.0，在500ml的三角瓶中裝入200ml的培養基，加入0、5、25、125、625mg L—1 的黃腐酸；
[0008]步驟2、接入產油單針藻進行異養-自養培養，具體為:高壓高溫滅菌20min，接入產油單針藻，異養培養階段，藻細胞密度控制在106個ml—1;自養培養階段，接種量為2.3g L—S后進行搖瓶培養，光照強度為35001ux，培養溫度為25°C，搖床轉速為150r min—S
[0009]步驟3、制備生物柴油，將終培養液離心富集，轉速為9000r min—1，時間為6min。濕細胞在_70°C下冷凍過夜，后進行抽真空冷凍干燥。添加干藻粉樣品2倍質量的石英砂研磨20min后用氯仿-甲醇(2:1，v/v)進行油脂提取，有機溶劑重復提取3次后收集有機相濃縮稱重。上述提取油脂加2mL 3%硫酸-甲醇進行甲酯化制備得到生物柴油。
[0010]本發明所達到的有益效果是:
[0011]1、本發明將黃腐酸與異養培養和自養培養有機的結合起來，不僅充分發揮了異養培養藻細胞快速生長的優勢和自養培養階段油脂快速積累的特點，而且巧妙的利用了黃腐酸能刺激藻細胞和油脂積累的特性。
[0012]2、本發明操作簡單、成本低廉，只需要添加很少的黃腐酸就能極大地促進微藻的生長和油脂的積累，有利于微藻的大規模生產。
[0013]3、本發明異養階段在黃腐酸的誘導下能大量的積累細胞量，與對照相比其細胞產率增加了52.18%;自養階段黃腐酸能大幅度提高細胞的油脂含量，當黃腐酸的濃度為25mgL—1時，在誘導第六天時油脂含量可以提高到54%。該油脂含量與自養培養時的油脂含量相差不大，但其培養時間縮短了2/3。由此可見，利用黃腐酸兩階段誘導細胞生長和油脂的積累是一種有效可行的方法。該培養方法為解決工業生產過程中細胞和油脂含量不能同時達到最大提供了一種有效解決方法。
[0014]4、與傳統的自養培養相比，本發明方法能縮短藻種的培養時間，培養面積小且單位培養面積的產率高。自養培養階段藻種的接種量在2_5g L—I較大的接種量越不容易受到細菌、原生動物等生物的污染，因此，該方法能降低微藻自養培養過程中雜菌污染的概率。
[0015]5、與自養培養相比，該培養方法細胞密度高因而其采收成本相對較低，從而提高了生產效率，降低了生產成本。
[0016]綜上所述，本發明操作簡單，成本低，細胞量和油脂產率相對較高，是一種快速提高微藻細胞量和油脂含量的培養方法。
【具體實施方式】
[0017]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0018]本發明提供一種產油微藻細胞和油脂快速積累的培養方法，包括以下步驟:
[0019]步驟I中制備基于黃腐酸的培養基具體為:異養培養階段，選擇kuhl培養基作為單針藻的基本培養基，分裝300ml進入500ml的三角瓶中，按1g L—1的量加入葡萄糖作為碳源，調整pH值為6.8?7.1，加入80mg L—1的黃腐酸。自養培養階段，選擇kuhl培養基作為單針藻的基本培養基，調整pH值為7.0，在500ml的三角瓶中裝入200ml的培養基，加入5、25、125、625mg L—1的黃腐酸。
[°02°]步驟2中接入產油單針藻進行異養-自養培養具體為:高壓高溫滅菌20min，接入產油單針藻，異養培養階段，藻細胞的初始濃度控制在16個ml—1;自養培養階段，接種量為
2.3g L—1，后進行搖瓶培養，光照強度為35001uX，培養溫度為25°C，搖床轉速為150r min—1。[0021 ]步驟3中制備生物柴油具體為:將終培養液離心富集，轉速為9000r min—1，時間為6min。濕細胞在-70°C下冷凍過夜，后進行抽真空冷凍干燥。添加干藻粉樣品2倍質量的石英砂研磨20min后用氯仿-甲醇(2:1，v/v)進行油脂提取，有機溶劑重復提取3次后收集有機相濃縮稱重。上述提取油脂加2mL 3%硫酸-甲醇進行甲酯化制備得到生物柴油。
[0022]實施例1
[0023]