7-氨基頭孢烷酸的制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種7-氨基頭孢烷酸的制備方法及用途，特別是涉及利用固定化頭 孢菌素 C酰化酶催化頭孢菌素 C以一步酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法及用途。
【背景技術】
[0002] 頭孢菌素 C(Cephalosporin C, CPC)酰化酶是一步酶法生產7-氨基頭孢燒酸 (7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)的一種酰化酶，可以直接催化底物頭孢菌素 C，脫 去D- α -氨基己二酸側鏈，一步生產7-ACA。與傳統的兩步酶法相比，一步酶法操作更簡單、 方便，成本低，日益受到重視。
[0003] 固定化酶技術產生于20世紀六十年代，目前已廣泛應用于生物催化領域的工業 生產中。與游離酶相比，固定化酶具有穩定性高、回收方便、易于控制、可重復使用、成本低 廉等優點，在兩步酶法生產7-ACA的生產中的酶制劑采用的即是固定化酶技術（劉秀偉，司 芳，郭林，等.酶固定化研究進展[J].化工技術經濟，2003, 21 (4) :12-17.)。
[0004] 在固定化酶的工業應用中，為了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶具 有較好的催化活性和穩定性，可以重復、多批次的使用。因此在固定化CPC酰化酶的開發 中，可以通過酶分子的基因工程改造、采用新型固定化酶載體、對固定化工藝進行改進等多 種手段制備得到酶活高、穩定性好的固定化CPC酰化酶。
[0005] 盡管固定化酶通常具有較好的穩定性等優點，但在固定化酶顆粒內存在較嚴重的 底物和產物的傳質阻力問題（Gao F，Ma G. Effects of Microenvironment on Supported Enzymes. Topics in Catalysis, 2012,55(16-18):1114-1123)〇
[0006] 在通常的利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制備7-ACA的方法中，底物 消耗和產物生成曲線呈現了典型的"前快后慢"特征。這是因為對于固定化CPC酰化酶的 催化來說，和大多數固定化酶的催化類似，反應初始階段由于較高的底物濃度和較低的產 物濃度（產物經常也是酶的抑制劑），初始的催化速度是最快的；在反應后期由于底物濃度 的降低和產物濃度提高（相應的產物抑制會增強），固定化酶反應速度大大降低。而且，在 實際的生產過程中，這種低速的反應過程占總反應時間的比例很大。

【發明內容】

[0007] 針對這一問題，本發明提出一種利用固定化頭孢菌素 C酰化酶催化頭孢菌素 C以 一步酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法及用途，該方法具有穩定的催化速率、較短的反應時 間和固定化CPC酰化酶能夠多批次使用等優點。
[0008] 本發明提供了利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制備7-氨基頭孢烷酸 的方法，該方法包括：將固定化CPC酰化酶與CPC在液體中混合，在反應周期內將反應體系 的溫度從初始反應溫度例如〇_15°C連續地或不連續地逐漸升溫至16-37°C，優選20-35°C， 再優選25-35 °C。
[0009] 本發明的上述方法具有以下優點：
[0010] (1)反應周期內固定化CPC酰化酶的催化時間明顯縮短而總催化批次并沒有減 少，有效地提高了酶的催化穩定性，從而降低生產成本；
[0011] (2)不需要加入其他試劑只需調控溫度，生產過程容易操作，無污染。
【附圖說明】
[0012] 圖1示出了固定化CPC酰化酶在不同溫度下的酶活穩定性。
[0013] 圖2示出了固定化CPC酰化酶在有或沒有7-ACA存在下的熱穩定性。
[0014] 圖3示出了固定化CPC酰化酶在不同pH值條件下的酶活穩定性。
【具體實施方式】
[0015] 如上所述，本發明提供了利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制備7-氨基 頭孢烷酸的方法，該方法包括：將固定化CPC酰化酶與CPC在液體中混合，在反應周期內將 反應體系的溫度從初始反應溫度連續地或不連續地逐漸升溫至16-37Γ，優選20-35°C，再 優選 25-35 °C。
[0016] 所述初始反應溫度為0_15°C，優選3-15°C，更優選5-10°C。
[0017] 所述液體可以是水或常用緩沖液例如磷酸鈉緩沖液。
[0018] 固定化CPC酰化酶與CPC的混合方式沒有特別的限制，只要得到固定化CPC酰化 酶與CPC的混合溶液即可。例如，可以先將固定化CPC酰化酶和CPC分別分散或溶于水或 緩沖液中，再將二者混合；也可以直接將固定化CPC酰化酶和CPC同時投入水或緩沖液中混 合；還可以將固定化CPC酰化酶直接投入CPC的水或緩沖液溶液中。
[0019] 上述反應周期是指在一個批次的反應中，根據實際生產要求，底物CPC的轉化率 為90-99%的反應時間段。
[0020] 所述連續地升溫是指在反應周期內溫度連續不間斷地升高直到反應結束。上述連 續地升溫的方式包括以恒定的升溫速度的方式和以不恒定的升溫速度的方式。所述恒定 的升溫速度例如在0. 01°c /分鐘-3. 0°C /分鐘范圍內的任一升溫速度，優選0. 05°C /分 鐘-2. 0°C /分鐘，更優選0. 1°C /分鐘-1. 0°C /分鐘。在不恒定的升溫速度的情況下，優選 先慢后快的升溫速度，但是升溫的平均速度落入〇. 〇l°C /分鐘-3. 0°C /分鐘的范圍內，優 選0· 05°C /分鐘-2. 0°C /分鐘，更優選0· 1°C /分鐘-1. 0°C /分鐘。
[0021] 所述不連續地升溫是指在反應周期內的升溫間斷進行。不連續的升溫方式包括多 種，只要在升溫過程中發生間斷，就包括在上述的不連續升溫的范圍內。另外，在升溫過程 中可以包括有一個或多個降溫階段，只要在反應周期內溫度整體來看是上升的即可。上述 不連續地升溫的方式包括例如階梯式升溫。
[0022] 所述階梯式升溫包括兩階段升溫或更多階段升溫，例如在5-15Γ保持總反應時間 的1/2-3/4然后在20-37°C保持總反應時間的1/4-1/2的兩階段升溫，或者在5-15°C保持 總反應時間的1/4-1/2然后在20-25°C保持總反應時間的1/4-2/3然后在28-37°C保持總 反應時間的1/4-1/3的三階段升溫。
[0023] 反應體系的pH值采用常規pH值，例如ρΗ8. 0 ± 1。
[0024] 在本發明的方法中，其它反應條件和參數采用常規實驗室或工業生產中所采用的 條件和參數。
[0025] 作為本發明的方法中使用的固定化CPC酰化酶，其可以通過本領域技術人員已知 的方法獲得，例如可以商購獲得或者通過實驗室常規酶固定化工藝獲得。舉例來說，CPC 酰化酶可以通過微生物例如重組大腸桿菌培養獲得；例如，由重組大腸桿菌BL21(DE3)/ pET-CPCacy經過搖瓶培養，超聲波細胞破碎，離心，制備而得（Zhu XW，et al.，World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011，27(4) :823-829)。所用的固定化載 體為酶固定化工藝中常用環氧基或氨基載體，例如LX1000-EPC和LX1000-HA，得自西安藍 曉科技有限公司。
[0026] 作為在本發明的方法中使用的固定化CPC酰化酶可以帶有熒光標記，這是通過在 固定化CPC酰化酶上固定熒光物質如5-氨基熒光素鈉實現的。
[0027] 本發明的上述技術方案是基于以下研究形成的：
[0028] 在對固定化CPC酰化酶進行研究時，發現CPC酰化酶在低pH條件下的催化穩定性 差，由于固定化酶內底物和產物的擴散問題，隨著反應的進行，反應體系中的pH值并不代 表固定化CPC酰化酶中酶本身所處的pH環境。固定化CPC酰化酶顆粒周圍和內部微環境 的pH變化情況（也即是酶分子實際所處的pH環境）對酶的催化穩定性影響較大。因此本 申請的發明人針對如何調控才能實現固定化CPC酰化酶所處微環境pH的小幅度平穩變化 做了多種嘗試。
[0029] 發明人通過研究發現由于在初始階段的催化速度最快，大量的酸性產物堆積在固 定化酶周圍使得CPC酰化酶的微環境pH與反應體系的pH發生明顯的偏移，從而導致CPC 酰化酶的催化穩定性顯著下降。同時，發明人還出人意料地發現CPC酰化酶在與產物7-ACA 共存條件下對溫度的耐受性明顯提高。換句話說，雖然產物7-ACA是CPC酰化酶的反應抑 制劑，但是在高溫下卻起到對CPC酰化酶的保護作用。
[0030] 基于上述發現，發明人通過調整反應初期的反應溫度在較低的溫度范圍內，使得 產物7-ACA的生成沒有那么快，從而使得固定化CPC酰化酶所處的微環境的pH變化沒有那 么劇烈，從而保護了 CPC酰化酶的催化穩定性。隨著7-ACA在反應體系內的濃度的提高，由 于CPC酰化酶在與產物7-ACA共存條件下對溫度的耐受性明顯提高，可以逐漸提高反應溫 度，使得反應時間縮短，而且還不影響CPC酰化酶的催化穩定性，使得固定化CPC酰化酶的 催化批次不受大的影響。
[0031] 實施例
[0032] 以下通過實施例更詳細地描述本發明。但是本發明的范圍并不局限于實施例。
[0033] 實施例中的分析方法：
[0034] (1)律立產物7-ACA的標準曲線:
[0035] 1)用0· lmol/L、pH8. 5的磷酸鈉緩沖液分別配制20mg/mL的CPC溶液和3mg/mL的 7-ACA溶液，并用lmol/L的NaOH溶液調其pH至8. 5〇
[0036] 2)分別取0、1、2、4、8、12、16、2(^1^7-厶〇厶溶液加入到離心管中，再用0.1111〇1/1、 pH8. 5的磷酸鈉緩沖液逐一補足到20 μ L。
[0037] 3)分別向各管中加入20 μ L CPC溶液（37°C預熱3min)并混勾，37°C靜置5min后 加入200 μ L終止液（50mmol/L的NaOH溶液與20 %的冰醋酸溶液按1:2的體積比混合而 成），并震蕩充分混勻。
[0038] 4)將上述混合液12000rpm離心3min，然后各取200 μ L上清液到新的離心管中， 再加入40yL顯色劑（對二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液（0.5%，w/v))并混勻，室溫靜置 lOmin后，各取200 μ L，以加入0 μ L7-ACA溶液的樣品為空白對照，分別測定其它幾個樣品 在415nm處的吸光度值（采用上海精密科學儀器有限公司生產的722S型可見光分光光度 計進行測定）。
[0039] 5)以7-ACA濃度為橫坐標，0D415為縱坐標繪制標準曲線。
[0040] ⑵固宙化CPC酰化酶的酶活測宙：
[0041] 1)稱取質量為10mg-100mg的固定化酶于37°C預熱3min。
[0042] 2)加入37°C預熱的0. lmol/L、pH8. 5的磷酸鈉緩沖液分別配制20mg/mL的CPC溶 液 4mL〇
[0043] 3) 37°C、160rpm 反應 5min。
[0044] 4)取20 μ L上清液進行適當稀釋，加入200 μ L終止液，混勻。
[0045] 5)將上述混合液12000rpm離心3min后取200 yL上清液到離心管中，再加入 40 μ L顯色劑并混勾，室溫靜置lOmin后，取200 μ L測定其在415nm處的吸光度值（采用上 海精密科學儀器有限公司生產的722S型可見光分光光度計進行測定）。
[0046] 6)通過標準曲線計算7-ACA濃度，最終計算出固定化CPC酰化酶的活性。
[0047] CPC酰化酶活力的定義：在37°C、ρΗ8· 5、以20mg/mL的CPC溶液為底物的條件下， 每分鐘催化CPC生成1 μ m〇17-ACA所需的酶量為1個活