一種鵝支原體體外液體培養基及其制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于培養基技術領域，具體涉及一種鵝支原體體外液體培養基。
【背景技術】
[0002]鸛支原體(Mycoplasma anseris)是造成鸛呼吸道疾病、陰莖和泄殖腔炎癥、產蛋下降、無精蛋及死胚增加的病原體。最早由Kosovac和Djurisic從患有輸卵管炎的鸛中檢測到，隨后由Palya于1971年從匈牙利的一只公鵝的生殖器中分離獲得，并在之后命名為sp.1220株(Stipkovits，1978、1984、1986、2012)。流行病學調查顯示德國、波蘭、捷克斯洛伐克、蘇聯、英國等國家相繼從發炎的公鵝生殖器及泄殖腔中分離到鵝支原體。我國是世界上主要的鵝養殖基地，鵝肉產量占全球總量的93%。珠江三角洲地區和揚州等地流行病學調查證實支原體在鵝群中的廣泛感染(彭萬強，1988;陳志華，2006)，通過剖檢病鵝，臨床病變主要為肝周炎、氣囊炎、腹膜炎、泄殖腔炎和陰莖炎，并可見腸壁變薄出血及輸卵管積液，本病流行范圍廣，一年四季均有發生，以產蛋季節最為嚴重，可在無精蛋、死胚及孵化的雛鵝中分離到支原體，表明鵝支原體不僅可以經蛋垂直傳播，也可以通過交配水平傳播。
[0003]鵝支原體是一類特殊的微生物，無細胞壁，由于其基因組較小，造成基因組中編碼氨基酸和輔助因子生物合成的基因就少，從而導致能量代謝能力有限;支原體屬于氨基酸、脂類和某些輔助因子營養缺陷型，很難對環境變化做出調整，需要從外界攝取多種營養物質促進繁殖，因此對體外培養基的要求相當苛刻；由于不同菌株對葡萄糖、精氨酸兩種物質利用的情況不同，支原體對培養基的要求也存在差異;其中利用葡萄糖的鵝支原體在含葡萄糖的培養基中生長并產酸，使酚紅試劑變黃;利用精氨酸的支原體可分解培養基中的精氨酸產生氨(NH3),使酚紅試劑變紅。目前，鵝支原體病與鵝的鴨瘟病、鵝出敗病列為我國鵝群感染的三大疫病，相對于雞毒支原體(Mycoplasma gal I i spet icum)和滑液支原體(Mycoplasma symoviae)的研究，我國在鸛支原體分離診斷及防控措施方面的研究仍處于起步階段，目前分離鵝支原體使用的人工培養基一般均由Frey或PPLO培養基改良而來，但仍存在活菌滴度低，繁殖能力差等問題，再加上鵝群中存在兩種生化性質不同的支原體(一種分解葡萄糖，一種分解精氨酸)，容易產生假陰性，因此，本領域亟需高效穩定、且能達到快速分離診斷鵝支原體的培養基，進而開展鵝支原體感染的治療與防控研究。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種生長周期短、活菌滴度高、適用于兩種生化特性的鵝支原體體外的分離及傳代培養的高效液體培養基，同時提供這種培養基的制備方法。
[0005]本發明的第一個目的是提供一種鵝支原體體外液體培養基，由培養基A和培養基B組成，所述培養基A為分解葡萄糖的支原體體外培養基，所述培養基B為分解精氨酸的支原體體外培養基，其特征在于:所述培養基A的配方為:支原體肉湯基礎，去離子水，葡萄糖，丙酮酸鈉，1%的酚紅，10%的醋酸鉈溶液，滅活的馬血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸鹽酸鹽，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸； 所述培養基B的配方為:支原體肉湯基礎，去離子水，丙酮酸鈉，1%的酚紅，10%的醋酸鉈溶液，滅活的馬血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸鹽酸鹽。
[0006]作為優選，所述培養基A的配方為:支原體肉湯基礎18-23g/L，去離子水680-720mL/L，葡萄糖4-6g/L，丙酮酸鈉1.5_3g/L，1%的酚紅3_4mL/L，10%的醋酸鉈溶液2_3.2mL/L，滅活的馬血清150-180 mL/L，酵母提取液40-55 mL/L，青霉素80-100萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1-0.2 g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。
[0007]進一步優選地，所述培養基A的配方為:支原體肉湯基礎21g/L，去離子水700-720mL/L，葡萄糖5g/L，丙酮酸鈉2g/L，1%的酚紅3mL/L，10%的醋酸鉈溶液2.6mL/L，滅活的馬血清150 mL/L，酵母提取液45 mL/L，青霉素80萬單位/L，L_半胱氨酸鹽酸鹽0.2 g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L;
作為優選，所述培養基B的配方為:支原體肉湯基礎18-23g/L，去離子水700-740mL/L，丙酮酸鈉l_2g/L，1%的酚紅1-1.5mL/L，10%的醋酸鉈溶液2-3.2mL/L，滅活的馬血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100萬單位/L，L-精氨酸鹽酸鹽10-12g/L。
[0008]進一步優選地，所述培養基B的配方為:支原體肉湯基礎21g/L，去離子水720-740mL/L，丙酮酸鈉lg/L，l%的酚紅lmL/L，10%的醋酸鉈溶液2.6mL/L，滅活的馬血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80萬單位/L，L-精氨酸鹽酸鹽10g/L。
[0009]作為優選，所述酵母提取液的制備方法為:將酵母溶于4-6倍重量的去離子水中，在28-32°C下磁力攪拌1-1.5小時；10-15分鐘內逐漸增加溫度到40°C ;之后每分鐘增加5°C至沸點，煮沸3-5分鐘，冷卻至室溫，離心，取上清，過濾收集濾液即得。
[0010]本發明的第二個目的是提供上述培養基的制備方法，所述培養基A的制備方法為:將配方量的支原體肉湯基礎、去離子水、葡萄糖、丙酮酸鈉、1%的酚紅、10%的醋酸鉈溶液充分混勻，調pH至7.8，121°C高壓滅菌15分鐘，冷卻至50-55°C，加入配方量的滅活的馬血清、酵母提取液、滅菌的青霉素水溶液、滅菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽的水溶液、滅菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的水溶液，混勻后無菌條件下調整PH至7.7-7.8。
[0011]作為優選，所述培養基B的制備方法為:將配方量的支原體肉湯基礎、去離子水、丙酮酸鈉、1%的酚紅、10%的醋酸鉈溶液充分混勻，調pH至7.8，121°C高壓滅菌15分鐘，冷卻至50-55 0C，加入配方量的滅活的馬血清、酵母提取液、滅菌的青霉素水溶液、滅菌的L-精氨酸鹽酸鹽的水溶液，混勻后無菌條件下調整pH至7.2-7.3。
[0012]本發明的第三個目的是提供應用上述培養基培養鵝支原體的方法，將鵝支原體接種到培養基中，在37°C恒溫下靜置培養，得到擴大培養的鵝支原體。
[0013]本發明對上述培養基的PH值和營養成分等進行了篩選和分析，通過PH值的升高或下降，觀察培養基顏色的變化，可快速鑒別支原體的生長(其中A培養基隨pH值降低變為橘黃色，B培養基隨pH值升高變為深粉色)；通過添加醋酸鉈、提高青霉素的濃度，可阻止環境中其他雜菌的生長，使培養基在2-80C存儲時間從1-2月延長為4-5月；通過添加新鮮酵母提取液和生長所需的氨基酸，能明顯縮短鵝支原體生長時間，提高活菌滴度;經反復實驗證實該培養基培養鵝支原體24小時即可生長，生長48小時的滴度可達103CCU/m L;而未添加之前36-48小時才能生長，生長72-80小時才能達到13CXU。本發明的培養基具有生長快速、含菌量高的特點，適用于鵝支原體的分離培養。
【附圖說明】
[0014]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中:
圖1為鵝支原體培養基A;
圖2為鵝支原體培養基B;
圖3為鵝支原體培養基A的活菌滴度測定結果；
圖4為鵝支原體培養基B的活菌滴度測定結果。
【具體實施方式】
[0015]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。如無特殊說明，文中的“%”為質量百分比。
[0016]實驗材料:
支原體肉湯基礎(Frey)為K)公司生產，貨號為211458;
馬血清為Hyclone公司生產，貨號為SH30074.03 ；
青霉素為sigma公司成產，貨號為P7794-10MU;
L-半胱氨酸鹽酸鹽為sigma公司成產，貨號為G1276-10G;
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為sigma公司成產，貨號為N3014-1G;
L-精氨酸鹽酸鹽為sigma公司成產，貨號為A5131-100G;
酚紅為Sigma公司生產，貨號為P3532;
丙酮酸鈉為MECK公司產品，貨號為1.06619.0050;
干酵母粉為安琪公司生產。
[0017]本發明的鵝支原體體外培養基由分解葡萄糖的培養基(培養基A)和分解精氨酸的培養基(培養基B)組成，具體配方如下:
培養基A的配方:支原體肉湯基礎18-23g/L，去離子水680-720mL/L，葡萄糖4_6g/L，丙酮酸鈉1.5-3g/L，l%的酚紅3-4mL/L，10%的醋酸鉈溶液2-3.2mL/L，滅活的馬血清150-180mL/L，酵母提取液40-55 mL/L，青霉素80-100萬單位/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1-0.2 g/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。
[0018]培養基B的配方:支原體肉湯基礎18-23g/L，去離子水700-740mL/L，丙酮酸鈉1-2g/L，1%的酚紅1-1.5mL/L，10%的醋酸鉈溶液2-3.2mL/L，滅活的馬血清150-180mL/L，酵母提取液40_55mL/L，青霉素80-100萬單位/L，L-精氨酸鹽酸鹽10-12g/L。
[0019]其中，酵母提取液的制備方法為:稱取酵母粉200g，加入800-1200mL去離子水，在28-32°C下磁力攪拌1-1.5小時，使細粉充分分散、混勻、發酵;然后逐漸增加溫度到40 V，此過程需要10-15分鐘；之后每分鐘增加5°C，不斷攪拌，防止酵母燒糊致使營養成分破壞;加熱至沸點維持5分鐘，總時間控制在2小時左右，減少了污染雜菌的概率；冷卻至室溫，3500rpm離心20分鐘，取上清，先用濾紙過濾，然后依次經0.8μηι、0.45μηι、0.22μηι的濾器過濾，將濾液每50mL分裝后放入-20 °C備用。
[0020]培養基A的制備方法為: 先將能夠高壓滅菌的組分:即支原體肉湯基礎(Frey)18-23g/L、680-720mL去離子水、葡萄糖4_6g/L、丙酮酸鈉1.5-3g/L、1%的酚紅3-4mL/L、10%的醋酸鉈溶液2-3.2mL/L充分混勻，用20%的NaOH調PH值為7.8，121°C高壓滅菌15分鐘;待冷卻至50_55°C，加入不能高壓滅菌的組分:即滅活的馬血清150-180mL/L、酵母提取液40-55mL/L、滅菌的青霉素80-100萬單位/L、滅菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液0.1-0.2g/L、滅菌的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液
0.1-0.2g/L;最后無菌條件下微調PH值至7.7-7.8。
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