提高滸苔多糖生物活性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于化學化工技術領域，涉及一種通過對降解滸苔多糖進行異羥肟酸化修 飾從而增強其生物活性的方法。
【背景技術】
[0002] 滸苔是我國東南沿海的一種大型經濟性綠藻，資源豐富，本身可以食用，并含有多 種活性物質，如滸苔多糖，脂類色素，酸類等。據文獻報道，講苔多糖具有提高哺乳動物免疫 力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此將滸苔開發成功能食品有很好的前景。 滸苔水提多糖主要為水溶性的硫酸多糖，分子量大，生物活性相對較低。如果將其降解成分 子量相對較小的產物，則由于游離出更多的活性基團，則可能會使其生物活性得到提高。另 外，通過化學修飾在多糖分子中引入一些功能基也能使多糖的生物得到提高。已有文獻報 道了滸苔多糖的硫酸化、磷酸化和乙酰化修飾，經修飾之后的滸苔多糖的抗氧化活性顯著 提高；也有報道滸苔多糖經硒化后提高抗菌活性，但尚未有同時提高滸苔多糖抗菌和抗氧 化活性的方法報道。

【發明內容】

[0003] 本發明要解決的技術問題是一種能提高滸苔多糖的抗氧化、抗菌等生物活性的方 法。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種將降解的滸苔多糖進行異羥肟酸化修飾 的方法;包括以下步驟：
[0005] (1)將滸苔粗多糖(EP)通過氧化氫-維生素 C聯合法進行降解。通過研究反應溫度、 維生素 C以及過氧化氫濃度和反應時間對降解產物的總抗氧化能力的影響，得到最佳的降 解反應條件。將水解液經濃縮、醇沉、離心、透析、冷凍干燥，得到粉末狀的降解滸苔多糖 (DEP) 0
[0006] (2)以氯乙酸為羧甲基化試劑，與降解滸苔多糖反應制備羧甲基化滸苔多糖 (CDEP)。研究反應溫度、氯乙酸濃度和反應時間對產物的羧甲基取代度的影響，并通過響應 面試驗進一步優化反應條件。在經優化后的反應條件下得到羧甲基化滸苔多糖(CDEP)用于 下一步反應。
[0007] (3)在1-乙基-3-(3_二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)存在下，CDEP與羥胺偶聯，得到 異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)。
[0008] 本發明的方案具體如下，一種提高滸苔多糖生物活性的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)、降解：
[0010]將滸苔粗多糖(EP)溶于蒸餾水配成濃度為1~20mg/mL的滸苔粗多糖溶液，升溫至 30~50°C后分別加入過氧化氫和維生素 C，直至過氧化氫和維生素 C的終濃度均為6~ 12mmol/L(例如為9mmol/L);然后保溫攪拌進行降解反應2~4h，從而實現對滸苔粗多糖進 行降解；
[0011] 將所得的反應液濃縮至為原體積的1/2~1/4(約1/3)，得濃縮液；用4倍濃縮液體 積的體積濃度為95%乙醇沉淀，于3~5°C靜置10~12h(4°C、過夜），離心(8000rpm，20min)， 取沉淀用水進行復溶，所述沉淀與水的用量比為18~22mg/ml (例如約為20mg/ml)，用截留 分子量為3500Da的透析袋透析46~50h(例如48h)，將所得的透析液冷凍干燥，得到降解滸 苔多糖(DEP，為粉末狀）；
[0012] 備注說明：降解滸苔多糖(DEP)不具備抗菌活性；
[0013] 2)、羧甲基化：
[0014] 將0.3g的降解滸苔多糖(DEP，為粉末狀)溶于12.5ml二甲基亞砜(DMSO)中，室溫下 攪拌1.5~2.5h;然后加入質量濃度20 %氫氧化鈉溶液5ml，于35~45°C攪拌2.5~3.5h，得 反應液I;
[0015] 將氯乙酸溶于12.5ml二甲基亞砜(DMSO)和質量濃度20%氫氧化鈉溶液5ml中，配 制得濃度為2~6moI/L(較佳濃度為4moI/L)的氯乙酸溶液，作為反應液Π ;將反應液Π 與上 述反應液I等體積混合（注：從而使得到的反應液中氯乙酸終濃度為1~3mol/L，較佳為 2mol/L)，然后于45~65°C反應2~6小時(較佳為55°C反應4小時）；
[0016] 將所得的反應液冷卻至室溫，調節pH至中性（可用0.5mol/L的HCl進行調節pH，中 性，即，pH=7.0)，加水稀釋(水與反應液的體積比約為1:1)，然后用3500Da的透析袋透析46 ~50h(例如48h)，將透析液濃縮至原體積的1/2~1/4(例如1/3)，冷凍干燥，得到即羧甲基 化降解滸苔多糖(⑶EP，即，白色粉末狀的羧甲基化衍生物）；
[0017] 3)、與羥胺偶聯：
[0018]將羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)溶于蒸餾水中配制成濃度為1~3g/100ml(例如 為2g/100ml)的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)溶液，調節pH至4.0~4.5(用I.ON HCl溶液調 節），然后加入EDC · HCl，攪拌1.5~2.5h(例如2h)，再加入鹽酸羥胺和4-二甲氨基吡啶 (DMAP)，繼續攪拌1 ·5~2· 5h(例如2h)，調節pH至5 ·8~6 · 2(例如為6·0，用1 ·ON NaOH溶液調 節），室溫攪拌1.5~2.5h(例如2h)，再調節pH至8.8~9.2(例如為9.0,用1.0 N的NaOH溶液）， 繼續室溫攪拌22~26h(例如24h) ;EDC · HCl與羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)中羧甲基的摩 爾比為l~4:3(較佳為l~1.2:3)，鹽酸羥胺與EDC·HCl的摩爾比為5.5~6 :l，4-二甲氨基 吡啶(DMAP)的摩爾量為EDC · HCl的5~15.5% ;
[0019] EDC · HCl代表1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；
[0020] 備注說明：CDEP中羧甲基的摩爾數由其羧甲基取代度(DS)計算得到；
[0021] 將所得的反應液旋蒸濃縮至為原體積的1/2~1/4(例如1/3)，得濃縮液；用4倍濃 縮液體積的體積濃度95 %乙醇沉淀，于3~5°C靜置10~12h (4°C、過夜），離心（8000rpm， 20min)取沉淀，用乙醇洗滌沉淀（洗3~5次），用水復溶，所述沉淀與水的用量比為18~ 22mg/ml(例如20mg/ml)，用截留分子量為3500Da透析袋透析46~50h(例如48h)，將透析液 濃縮至原體積的1/2~1/4(例如1/3,可利用旋轉蒸發儀濃縮），冷凍干燥，得到異羥肟酸化 降解滸苔多糖(HCDEP)。
[0022] 該異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)為降解滸苔多糖的異羥肟酸化衍生物。
[0023] 作為本發明的提高滸苔多糖生物活性的方法的改進：異羥肟酸化降解滸苔多糖 (HCDEP)具有較低分子量(30~13kDa)，其鐵螯合容量為0.2~1.2mmol/g。
[0024] 作為本發明的提高滸苔多糖生物活性的方法的進一步改進：
[0025] 所述步驟1)、2)、3)中的冷凍干燥均是：于-45~-55°C冷凍干燥22~26小時（例如 為于-50°C冷凍干燥24小時）。
[0026]在本發明中，室溫一般是指10~30°C。
[0027]備注說明：本發明滸苔粗多糖按文獻文獻報道方法制備(Jie Xu，Li_Li Xu，Qin-Wei Zhou，Shu-Xian Hao,Tao Zhou,Hu-Jun Xie.Enhanced in vitro antioxidant activity of polysaccharides from Enteromorpha Pro I if era by enzymatic degradation.Journal of Food Biochemistry.doi: 10.1111/jfbc. 12218)。講苔粗多糖 (EP)中總糖、糖醛酸、蛋白質、硫酸根的含量分別為49.2%、15.7%、0.8%和12.3% ;用高效 凝膠滲透層析法測得其多糖分子量為1480kDa。本發明的降解滸苔多糖(DEP)中總糖、糖醛 酸、蛋白質、硫酸根的含量分別為51.9%、15.5%、0.65 %和13.9%;多糖分子量為44kDa。組 成分析表明DEP與EP相比，除分子量降低外，基本組成沒有明顯變化。
[0028] 多糖的羧甲基的取代度:指每個單糖結構單元上連接的羧甲基的平均數。
[0029] 本發明具有如下技術效果：
[0030] 1.與未降解的滸苔粗糖(EP)和降解滸苔多糖(DEP)相比，本發明得到的異羥肟酸 化降解滸苔多糖(HCDEP)的體外抗氧化活性顯著提高。
[0031] 2.未降解的滸苔粗糖(EP)和降解滸苔多糖(DEP)沒有顯示出抗菌活性，本發明得 到的HCDEP則對幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌都顯示出明顯的抑制作用。
【附圖說明】
[0032]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0033]圖1是由本發明實施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的DPPH自由基清除能力的測定結果。
[0034]圖2是由本發明實施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的超氧陰離子自由基清除能力的測定結果。
[0035]圖3是由本發明實施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的羥基自由基清除能力的測定結果。
[0036] 圖4是本發明實施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多糖 (DEP)以及未降解多糖(EP)的總抗氧化能力的測定結果。
【具體實施方式】
[0037] 實施例1-1、異羥肟酸化降解滸苔多糖的制備：
[0038] (1)稱取Ig滸苔粗多糖(EP)溶解于IOOmL蒸餾水中，30°C水浴加熱，依次加入維生 素 C和過氧化氫，使得二者的終濃度均為9mmo 1/L，保溫攪拌反應2h，將反應液濃縮(于60~ 70°C進行減壓濃縮）至為原體積的1/3，用4倍濃縮液體積95 %乙醇沉淀，4°C過夜，離心 (8000rpm，20min)，取沉淀用水復溶(所述沉淀與水的用量比約為20mg/ml)，用截留分子量 為3500Da的透析袋透析48h，將透析液冷凍干燥(于-50°C冷凍干燥24小時），得到粉末狀的 降解滸苔多糖(DEP)。
[0039] (2)取0.3g的降解滸苔多糖(DEP)溶于12.5mL的DMSO中，室溫攪拌2h，加入質量濃 度20%的氫氧化鈉溶液5mL，加熱至40°C攪拌3h。取6.62g(0.07mol)的氯乙酸加入5mL的 NaOH溶液（質量濃度20 % )和12.5mL的DMSO中，溶解后加入到上述反應體系中，使得氯乙酸 終濃度為2. Omol/L，在55°C反應4h，將反應液冷卻至室溫，用0.5mol/L的HCl調節pH至中性 (即，pH=7)，加水稀釋(水與反應液的體積比約為1:1)，然后用3500Da的透析袋透析48h，將 透析液濃縮（于60~70°C進行減壓濃縮）至為原體積的1/3,凍干（于-50°C冷凍干燥24小 時），得到羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)，羧甲基的取代度為0.774。降解滸苔多糖的羧甲基 化的成功用紅外光譜和核磁共振碳譜得到確證。
[0040] (3)稱取0 · 3g(含1 · 42mo 1羧甲基）羧甲基化衍生物（CDEP)溶于15mL蒸餾水中，用 1.0N HCl溶液調節pH至4.3,加入0.1g(0.52mmol)EDC · 'HCl使羧基活化，攪拌2h，再加入 0.2g(2.89mmol)鹽酸羥胺，同時加入0.01g(0.08mmol)4-二甲氨基吡啶(DMP)作為催化劑， 繼續攪拌2h，用1.0 N NaOH溶液調節pH至6.0，室溫攪拌2h，再用1.0 N的NaOH溶液調節pH至 9.0，繼續室溫攪拌24h，將反應液旋蒸濃縮為原體積的1/3，得濃縮液；用4倍濃縮液體積的 濃度為95%乙醇沉淀，4°C靜置過夜，離心(8000rpm，20min)取沉淀，用乙醇洗滌沉淀4次(每 次洗滌時，用量約為5ml)，用水復溶(所述沉淀與水的用量比約為20mg/ml)，于3500Da透析 48h，將透析液于旋轉蒸發儀濃縮至原體積的1/3，-50°C冷凍干燥24h，得到異羥肟酸化降解 滸苔多糖(HCDEP)0.23g，測得其分子量為55.4kDa。異羥肟酸化降解滸苔多糖的結構用傅立 葉紅外光譜和核磁共振碳譜進行了確證；并用光譜滴定法測定了其鐵螯合容量為 0.417mmol/g(測定方法見實驗1)。
[0041 ]實驗 1、
[0042] 鐵螯合容量的測定:取HCDEP 150mg，溶解于IOmL 50mM的NH4HCO3緩沖液中，得到樣 品濃度為15mg/mL;取11份1.0 mL的樣品溶液