用于秈稻育成品種遺傳完整性分析的引物組合及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及遺傳完整性分析引物，具體地說，設及用于釉稻育成品種遺傳完整性 分析的SSR分子標記核屯、引物。
【背景技術】
[0002] 種質是指親代通過生殖細胞或體細胞傳遞給子代的遺傳物質。種質庫保存的種質 材料一般可分為兩類：遺傳上同質種質（genetically homogeneous accessions)，指在一 份種質內，其個體之間基本上具有相同的遺傳結構，如自花授粉作物育成品種、異花授粉作 物自交系等；遺傳上異質種質（genetically heterogeneous accession)，指在一份種質 內，其個體之間不具有相同的遺傳結構，如野生種、原始地方品種、異花授粉的栽培品種等。
[0003] 遺傳完整性是指群體的遺傳結構得到完全的保持，包括基因型頻率分布及等位基 因頻率分布和其原始群體一樣，保持不變。維持種質的遺傳完整性就是在繁殖過程中要有 最大的遺傳相似性，在保存過程中表現最低程度的遺傳變異。
[0004] 準確評價育成品種稻種資源的遺傳多樣性和完整性，對于其在育種、生產中的應 用具有重要的作用，對種質資源的安全保存具有重要意義。傳統方法是采用表型多樣性鑒 定法，即通過調查多項農藝性狀，反映種質的遺傳多樣性和完整性。但是該方法容易受氣 候、人為等因素影響。近年來分子標記技術在種質遺傳多樣性和完整性研究中得到越來越 廣泛的應用。分子標記技術中有多項技術參數會影響評價結果的可靠性和準確性。USSR分 子標記為例，其關鍵的技術瓶頸包括引物的篩選、群體量的大小等。
[0005] 因此，亟需獲得可用于釉稻育成品種遺傳完整性分析的SSR核屯、引物，并建立釉稻 育成品種遺傳完整性分析方法。

【發明內容】

[0006] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種用于釉稻育成品種遺 傳完整性分析的引物組合及其應用。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[000引本發明提供一套用于釉稻育成品種遺傳完整性分析的SSR核屯、引物組合與方法， 所述方法是基于SSR分子標記原理，采用經過前期大量篩選工作所獲得的12對多態性核屯、 引物，對100~160個單株的釉稻育成品種基因組DNA進行擴增，利用生物分析軟件統計分析 群體的遺傳多樣性指數，反映群體的遺傳完整性保持情況。
[0009]第一方面，本發明提供用于釉稻育成品種遺傳完整性分析的引物組合，其由如下 12個引物對組成：
[0010]55301:正向引物如沈9 10^.1所示;反向引物如沈9 10^.2所示；
[0011] SSR02:正向引物如沈Q ID NO. 3所示;反向引物沈Q ID NO.4所示；
[0012] SSR03:正向引物如沈Q ID NO.5所示;反向引物如沈Q ID NO.6所示；
[0013] SSR04:正向引物如沈Q ID NO.7所示;反向引物如沈Q ID NO.8所示；
[0014] SSR05:正向引物如沈Q ID NO.9所示;反向引物如沈Q ID NO. 10所示；
[001引 SSR06:正向引物如沈Q ID NO. 11所示;反向引物如沈Q ID NO. 12所示；
[0016] SSR07:正向引物如沈Q ID NO. 13所示;反向引物如沈Q ID NO. 14所示；
[0017] SSR08:正向引物如沈Q ID NO. 15所示;反向引物如沈Q ID NO. 16所示；
[001引 SSR09:正向引物如沈Q ID NO. 17所示;反向引物如沈Q ID NO. 18所示；
[0019] SSRIO:正向引物如沈Q ID NO.19所示;反向引物如沈Q ID NO.20所示；
[0020] SSRll:正向引物如沈Q ID NO.21所示;反向引物如沈Q ID NO.22所示；
[0021] SSR12:正向引物如沈Q ID NO.23所示;反向引物如沈Q ID NO.24所示。
[0022] 上述12對核屯、引物是從550對SSR引物中，經篩選獲得。引物篩選方法為，W160個 單株的釉稻育成品種議晚釉19號的DNA為模板，分別用550對SSR引物進行擴增，擴增產物經 聚丙締酷胺凝膠電泳、凝膠銀染、統計擴增結果。針對每對引物在160個單株中的擴增結果， 剔除不具備多態性的引物，保留具有多態性的引物，最終篩選獲得12對多態性核屯、引物。篩 選得到的引物相對未被選擇引物，在體現種質的遺傳多樣性方面具有明顯優勢。
[0023] 第二方面，在上述引物組合存在的前提下，任何含有該引物組合的產品均在本發 明的保護范圍內，例如含有上述引物組合的試劑或試劑盒。原因在于，其在應用時利用的是 本發明所述引物組合的特殊性，且得到的結果取決于本發明所述引物組合的特殊性。
[0024] 第Ξ方面，本發明提供前述引物組合在分析釉稻育成品種遺傳完整性方面的應 用。由于前述引物組合能夠針對釉稻育成品種的遺傳多樣性進行鑒定，所得結果可用于判 斷種質遺傳完整性的保持情況。因此，本發明提供前述引物組合可用于釉稻育成品種遺傳 完整性分析。
[0025] 第四方面，本發明提供一種分析釉稻育成品種遺傳完整性的方法，W待分析樣本 的基因組DNA為模板，利用前述引物組合進行PCR擴增，經聚丙締酷胺凝膠電泳分離擴增產 物，利用生物學軟件對電泳結果進行遺傳結構分析。
[0026] 進一步地，所述待分析樣本的樣本量(群體量)為100~160。原因在于，經實驗統計 發現，群體量越小，特異性單株平均頻率越低，其標準偏差和變異系數很大，表明采用過小 的群體量，取樣誤差十分明顯。群體量增加至100單株時，特異單株頻率逐步穩定趨近10%， 變異系數控制在15% W內，基本可W代表160單株的多樣性。因此在進行釉稻育成品種遺傳 完整性分析時，需要保證100株W上的群體量。
[0027] 作為優選，所述基因組DNA提取自釉稻葉片，因幼嫩葉片中次生代謝物質含量低， 易于獲得高質量DNA，優選幼嫩葉片。
[00%]優選地，所述種子來自釉稻育成品種。
[0029] 作為優選，為了更好的觀察擴增結果，可采用6%聚丙締酷氨凝膠電泳分離擴增產 物，電泳結束后采用銀染法染色。
[0030] 更進一步地，所述PCR擴增的反應體系為：10 X PCR緩沖液(含Mgh) 2.0化，2.5mmol/ L dNTP 1.5yL，5UAiL Taq 0.化L，化mol/L SSR引物2.0yL，20ng/yL DM 2.0化，d加 2〇 12.0化。
[0031] 所述PCR擴增的程序為：94°C預變性5min; 95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin，38個循環;72°C延伸lOmin。待溫度降至10°C后，于4°C冰箱內保存備用。
[0032] 基于上述優選方案，本發明提供一個完整具體的實施方式，包括如下步驟：
[0033] (1)采用CTAB法提取釉稻育成品種待分析樣本葉片的基因組DNA，樣本為100~160 單株釉稻；
[0034] (2)W步驟(1)提取的DNA為模板，用前述引物組合進行PCR擴增；
[0035] (3)采用6%聚丙締酷氨凝膠電泳對擴增產物進行分離，電泳結束后采用銀染法染 色；
[0036] (4)利用生物學軟件分析電泳結果。
[0037] 其中，所述步驟(4)具體為：統計擴增譜帶類型，參照DNA marke;r(pBR322)估計片 段大小。使用P0PGE肥等軟件對不同釉稻育成品種種質群體進行遺傳結構分析，比較不同種 質等位基因數、有效等位基因數、基因多樣性指數、香農指數等指標。采用SPSS或SAS等軟 件，分析群體間各指數差異，若無顯著差異則認為群體遺傳完整性得到有效保持，若差異達 到顯著水平，則認為群體遺傳完整性發生了改變。
[0038] 本發明的有益效果在于：
[0039] 本發明W釉稻育成品種議晚釉19號為材料，通過大量實驗研究，篩選出了一批可 用于釉稻育成品種遺傳完整性分析的SSR核屯、引物，建立了用于釉稻育成品種遺傳完整性 分析的引物組合，并基于此，建立了分析方法。
[0040] 本發明提供的分析方法適用于釉稻育成品種種質遺傳完整性的分析。所篩選的引 物組合和最少100個單株的群體量，為準確分析釉稻育成品種種質保存和繁殖更新過程中 遺傳完整性檢測提供了標準方法。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發明實施例1中引物SSR09對部分單株"議晚釉19號"的擴增結果。左起第3 泳道為Marker，其它泳道為"議晚釉19號"單株DNA擴增結果。
[0042] 圖2為本發明實施例1中不同大小群體量多態性單株差異。
【具體實施方式】
[0043] 下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是W下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可W對本發明進行各種修改和替換。
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0045] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0046] 實施例1釉稻育成品種種質的遺傳完整性分析
[0047] 1.實驗材料
[0048] W釉稻育成品種議晚釉19號為試材，種子育苗后移栽至大田進行常規管理。隨機 選取160個單株，取其幼嫩葉片，-20°C凍存備用。
[0049] 2.基因組DNA提取:采用CTAB法分別提取160個單株葉片的基因組DNA。
[0050] 3.引物合成及篩選
[0051] (1)合成引物：參考水稻SSR引物序列，隨機選擇550對引物，經生工生物工程（上 海)股份有限公司合成引物。
[0052] (2)引物篩選:采用160個單株DNA模板，利用全部550對引物進行擴增，擴增產物經 聚丙締酷胺凝膠電泳、凝膠銀染，根據擴增結果，剔除不具多態性的引物，共篩選出12對特 異多態性引物，其中引物