一類萘酚二聚體的突變合成及其制備方法和應用
【技術領域】
[00011本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及螳螂腸道真菌IFB-TL01(Daldinia eschscholzii)的阻斷突變體制備，以及從利用該突變體突變合成一類萘酸二聚體及其制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 隨著新疾病的涌現和臨床耐藥微生物的增加，發掘具有新作用機制藥物的任務已 迫在眉睫。天然產物本身結構新穎，成藥潛力大，因此一直是藥物研發的重點。但是隨著研 究的深入和分離技術的進步，重復分到已知化合物的可能性在持續增加，天然產物研究也 逐漸步入"瓶頸期"。為了解決這一問題，研究人員將目光更多地投向了對產活性物質微生 物本身的改造上。通過對野生菌進行基因改造，使其生物合成途徑中的某一關鍵基因或基 因簇發生突變，喪失合成完整代謝產物的能力而成為阻斷突變株。再在發酵培養這種阻斷 突變株時，添加其他來源(化學合成或天然）的化合物參與生物合成并獲得新的"非天然產 物"，進而擴展某一菌株的次級代謝產物庫，為進一步研究藥物先導化合物奠定了基礎。

【發明內容】

[0003] 本發明利用大刀螳螂(Tenodera aridifolia)的腸道共生菌碳殼屬真菌IFB-TL01 (D. eschscholzii .)聚酮合酶PKS(polyketide synthase)阻斷突變體進行突變合成，得到 到一類具有顯著抑制抗炎抗癌活性的萘酚二聚物。
[0004] 本發明需要解決的問題是：
[0005] 1.提供一種碳殼屬真菌聚酮合酶PKS阻斷突變體的制備方法。
[0006] 2.提供一類具有抗癌抗炎活性的萘酚二聚物。
[0007] 3.提供一種制備萘酚二聚物的方法。
[0008] 本發明的技術方案：
[0009] 本發明所述碳殼真菌(D. eschscholzii .)分離自大刀賭螂胃腸道。本發明所述碳 殼真菌萘酚二聚物，具有下述結構式：
[con]碳殼屬真菌pks阻斷突變體的制備方法，包括下述步驟：
[0012] 1.利用重疊延伸(overlap-PCR)的方法構建敲除載體:擴增聚酮合酶(PKS)基因上 下游各約l〇〇〇bp片段為同源臂，擴增潮霉素基因（hph)為標記基因；最后用overlap-PCR將 三段序列拼接為一條片段。
[0013] 2 .利用酶裂解的方法制備D. eschscholzi i IFB-TL01的原生質體。用40mg/mL Lysing Enzyme和Dirselase酶解D.eschscholzii菌體獲得其原生質體。
[0014] 3.利用PEG介導的方法將敲除載體導入到D.eschscholzii的原生質體中，而后將 全部溶液加入到20mL REG培養基復蘇過夜。與等體積TOA固體培養基(含150yg/mL潮霉素） 混合，倒入無菌平皿，28°C培養待菌落長出。
[0015] 4.抗性篩選:將含高濃度（300yg/mL)潮霉素的PDA覆蓋在原始步驟3的平板上，28 °C培養3d以上，待菌落長出（菌落生長較緩慢，部分假陽性菌落不能生長）。
[0016] 5. PCR鑒定陽性菌株:從抗性平板上挑取菌落于YPD培養基中進行培養，用真菌基 因組提取試劑盒提取菌株基因組，取lyL作為PCR的模板，篩選陽性菌株。
[0017] 6.敲除菌的產物檢測:將阻斷突變菌株轉接至400mL的ME培養基中，28°C120rpm進 行培養，待菌體生長至對數狀態后(約3d)，添加1，5_二羥基萘，再繼續培養10d。發酵產物用 等體積乙酸乙酯萃取，所得的膏子用色譜甲醇溶解并用〇.45μπι濾膜過濾，濾液用于LC-MS檢 測 。
[0018] 碳殼真菌萘酚二聚物制備方法，包括下述步驟：
[0019] 1.將碳殼屬真菌PKS阻斷突變體，于搖床上，培養24h后，突變株生長至對數生長 期，此時加入1,5-二羥基萘ImM，三層搖床上繼續發酵10天(搖速為120rpm/min，28°C)。
[0020] 2.將步驟1所得發酵液經紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮干燥得黑色粗 浸膏F;
[0021 ] 3 .對步驟2所得浸膏F進行硅膠柱層析分段，采用石油醚/丙酮梯度洗脫：100 : 2， 100:5，100:10，100:20，100:50，100:100，得到 6 個洗脫部分 F1-F6;
[0022] 4.對浸膏F3反復采用硅膠柱層析、反相C-18柱層析以及Sephadex LH-20層析分離 純化得到含有四個新化合物的部位F3-1-4-2和F3-3-4-1。
[0023] 5.F3-1-4-2和F3-3-4-1 經高壓液相色譜法[色譜柱:0DS-2Hypersil columns(5y, 250X10mm)，Chiralpak ΙΑ (30111111118(54,250\10111111)]制備得到化合物1-4〇
[0024] 本發明所述碳殼真菌萘酚二聚物具有顯著抗癌抗炎作用，因此可作為一種新穎的 抗癌消炎藥，并在制備藥物中得到應用。
[0025] 與現有技術相比，本發明具有下述突出優點：
[0026] 1.本發明的萘酚二聚物是結構新穎的化合物，為開發新型抗癌消炎藥提供重要藥 物先導化合物。
[0027] 2.本發明的萘酚二聚物可以利用微生物進行液體發酵生產，工藝簡便，周期短，成 本低，來源有保證。
【附圖說明】
[0028] 圖 1 為化合物（ + )-Mutadal esol A(l)和(-)-Mutadalesol A(2)的實驗⑶與計算 ECD比較圖；
[0029] 圖 2 為化合物（ + )_Mutadal esol B(3)和(-)-Mutadalesol B(4)的實驗⑶與計算 ECD比較圖。
【具體實施方式】
[0030] 通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發明。但它們不是對本發明的限 定。
[0031 ] 實施例1
[0032] 碳殼屬真菌(D.eschscholzi)PKS阻斷突變體的制備方法
[0033] 1.利用重疊延伸(overlap-PCR)的方法構建敲除載體:擴增聚酮合酶(PKS)基因上 下游各約l〇〇〇bp片段為同源臂，擴增潮霉素基因（hph)為標記基因；最后用overlap-PCR將 三段序列拼接為一條片段。
[0034] 2.利用酶裂解的方法制備D.eschscholzii IFB-TL01的原生質體。 D. eschscholzii于YPD培養基中28°C培養36h，轉速120rpm。收集菌絲體并在攪拌機中打成 勾衆，2400rcf離心 10min，棄上清。沉淀用40mg/mL Lysing Enzyme和Dirselase酶解2h，600 目細胞篩過濾。2400rcf離心5min，沉淀即為D. eschscholzii的原生質體。
[0035] 3.利用PEG介導的方法將敲除載體導入到D.eschscholzii的原生質體中，在超凈 工作臺內，將1〇〇μL原生質體中與10yL(lyg)構建好的敲除載體混合，加入5〇yL PEG介導液 (0.6M KCl，50mM CaCl2,0.1M PEG3350)，冰浴25min。加入lml PEG介導液，室溫放置25min。 而后將全部溶液加入到20mL REG培養基復蘇過夜。與等體積PDA固體培養基(含150yg/mL潮 霉素)混合，倒入無菌平皿，28°C培養待菌落長出。
[0036] 4.抗性篩選:將含高濃度（300yg/mL)潮霉素的PDA覆蓋在原始步驟3的平板上，28 °C培養3d以上，待菌落長出（菌落生長較緩慢，部分假陽性菌落不能生長）。
[0037] 5. PCR鑒定陽性菌株:從抗性平板上挑取菌落于Yro培養基中進行培養，28°C培養 3d，轉速120rpm。用真菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組，取lyL作為PCR的模板，篩選陽 性菌株。
[0038] 6.敲除菌的產物檢測:將阻斷突變菌株轉接至400mL的ME培養基中，28°C120rpm進 行培養，待菌體生長至對數狀態后(約3d)，添加1，5_二羥基萘，再繼續培養10d。發酵產物用 等體積乙酸乙酯萃取，所得的膏子用色譜甲醇溶解并用〇.45μπι濾膜過濾，濾液用于LC-MS檢 測。
[0039] 實施例2
[0040] 碳殼屬真菌(D.eschscholzi)PKS阻斷突變體的突變合成
[0041]