一種解脲芽孢桿菌及其生產高溫過氧化氫酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明提供一株解脲芽孢桿菌及其生產高溫過氧化氫酶的方法。屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002]過氧化氫是一種強氧化劑，廣泛應用與工業、食品和醫療領域的漂白和消毒，但是其殘留物對生產工藝和身體健康有很大影響。過氧化氫酶可以特異性的將過氧化氫分解為無毒的水和氧氣，是一種高效環保的過氧化氫去除方法。過氧化氫酶廣泛存在于動植物和好氧微生物中，最初過氧化氫酶是從豬、牛等動物肝臟中提取純化的，但該方法受限于原料、成本和季節等因素，且工藝復雜，易污染，酶的穩定性也較差。相比而言微生物發酵生產過氧化氫酶則有產量大、活性高、酶學性質豐富、成本低廉等諸多優點。因工業上過氧化氫酶的作用環境多為高溫，堿性等惡劣條件，因此篩選耐高溫過氧化氫酶菌株對紡織印染等工業具有重要意義目前國外已有相關微生物發酵過氧化氫酶商品，國內有一些文獻及專利報道過氧化氫酶產酶菌株，但對耐熱過氧化氫酶的研究及報道較少，其中多數菌株產酶能力在每毫升發酵液幾百至幾千個酶活力單位，僅江南大學陳堅教授和浙江大學謝雪鳳文獻中報道菌株酶產量達到3000 U/mL和2500 U/mL左右。本發明人發現一株產高溫過氧化氫酶的菌株，通過液體發酵得到高酶活的過氧化氫酶酶液，該酶液可以高效分解過氧化氫。基于以上發現提出了本發明。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一株新型高溫過氧化氫酶高產菌株，和以酵母粉為氮源，牛肉膏為碳源發酵生產過氧化氫酶的工藝。所產過氧化氫酶制劑活性高，生產成本低廉，熱穩定性好，適于紡織、造紙等生產工藝中殘留過氧化氫的去除。
[0004]本發明的技術方案:
所述解脈芽抱桿菌(1^6讓&(3；111118 1:1161'1]108口11&61'；[(3118)1^1'-2，該菌種已于2015年12月9日保存于中國典型培養物保藏中心，地址為武漢大學，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2015733。
[0005]1、菌株的篩選及鑒定
(1)篩選:挑取從堆肥中分離純化的細菌純培養于前述液體種子培養基中震蕩培養，取100微升發酵液加入100微升過氧化氫，有大量氣泡產生的菌株為產酶菌株。
[0006](2)鑒定:對該菌株16S rRNA進行PCR擴增與測序，NCBI數據庫比對顯示該菌為解脲芽孢桿菌。
[0007](3)菌株特征:菌落呈扁平的圓形，周圍乳白色，中間透明，邊緣光滑，易于挑起。光鏡下菌體為桿狀。
[0008](4)過氧化氫酶活性測性方法:發酵液超聲破碎直至澄清，用pH 7.0的roS緩沖液稀釋適當倍數后備用。過氧化氫酶酶活測定方法為:2.9 ml反應液(pH 7.0,0.2 M PBS,20mM H2O2)迅速加入0.1 ml酶液中，在240 nm波長下測定吸光度的變化，每隔5s計數一次。H2O2的摩爾消光系數為43.6。過氧化氫酶酶活的定義為酶分鐘消耗1微摩爾H2O2所用的酶量為1 U。
[0009]2、應用菌株KAT-2發酵生產過氧化氫酶。工藝如下:
(1)種子液制備:
種子培養基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環單菌落置于50 ml種子液培養基中，55 °C培養12 h，轉速為180 r/min。
[0010](2)發酵產酶:
產酶培養基:酵母粉5-30 g/L，牛肉膏10-35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0011]發酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發酵培養基，發酵溫度為40?55°C，轉速為180 r/min，發酵時間為12-28 h，發酵液超聲破碎即為過氧化氫酶酶液。應用上述方法發酵獲得的酶液活力達到41426 U/mlo
[0012]本發明的有益效果:本發明首先提供了一株高產過氧化氫酶菌株，液體搖瓶培養酶活達41426 U/ml以上。該菌生長速度快，發酵時間短;培養基成分簡單，以酵母粉為氮源，牛肉膏為碳源的培養基可以極大促進該菌株產酶，發酵過程無需過氧化氫或乙醇等誘導，工藝簡單，成本低廉，該酶溫度穩定性好，其最適反應溫度為55 °C，在60 °C條件下保溫90min仍能保持60%以上的活性。應用該菌株及配套工藝制備的過氧化氫酶可以應用于食品加工和造紙紡織等工業，因此本發明提供的菌種及工藝具有廣泛的應用前景和明顯的經濟效益。
【具體實施方式】
[0013]應用菌株KAT-2發酵生產過氧化氫酶。工藝如下:
(1)種子液制備:
種子培養基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環單菌落置于50 ml種子液培養基中，55 °C培養12 h，轉速為180 r/min。
[0014](2)發酵產酶:
產酶培養基:酵母粉5-30 g/L，牛肉膏10-35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0015]發酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發酵培養基，發酵溫度為40?55°C，轉速為180 r/min，發酵時間為12?28 h，發酵液超聲破碎即為過氧化氫酶酶液。
[0016]實施例1:產酶菌株KAT-2的篩選及鑒定
挑取一環各菌株純培養分別轉接于含有50 ml前述液體種子培養基的三角瓶中，分別取一定量發酵液加入等體積過氧化氫觀察產氣泡情況。有氣泡產生者為過氧化氫酶產酶菌株，選擇產氣泡最劇烈的菌株KAT-2作為過氧化氫酶生產用菌。將菌株KAT-2的發酵液冰浴超聲破碎直至澄清，破碎條件為300 W，破碎2 s停頓3 s，將破碎液用roS緩沖液稀釋20倍測量酶活。過氧化氫酶活力測定方法為:2.9 ml反應液(02 M PBS pH 7.0,20 mM H2O2)迅速加入0.lml酶液中，在240nm波長下測定吸光度的變化，每隔5s計數一次。H202的摩爾消光系數為43.6。過氧化氫酶酶活的定義為酶分鐘消耗1微摩爾H202所用的酶量為1U。測得此時過氧化氫酶活性為1239 U/ml。取3 ml菌液用細菌基因組提取試劑盒提取該菌基因組，用細菌16S rDNA通用引物(27F和1492R)PCR擴增該菌的16S rDNA，擴增程序為94 °C變性1min，55 °C退火1 min，72 °C延伸2 min，擴增循環數為35個循環。PCR擴增產物送生物公司測序，序列如SEQ ID N0.1所示，在NCBI進行序列比對后確認該菌為解脲芽孢桿菌。
[0017]實施例2:菌株發酵生產過氧化氫酶
從斜面上挑取一環KAT-2純培養于盛有50 ml種子液體培養基的250 ml三角瓶中，55°C搖床上培養12 h，搖床轉速為180 r/min。以2%的接種量轉接至液體發酵培養基，250ml三角瓶的裝液量為50 ml產酶發酵培養基，培養條件為55 °C，搖床轉速180 r/min，培養15 h。取出發酵液冰浴超聲破碎直至澄清，破碎條件為300 W，破碎2 s停頓3 s。所獲澄清液體即為過氧化氫酶液，此時酶液活性達23147U/ml。
[0018]種子培養基為:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.產酶培養基:酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0。
[0019]實施例3 種子液制備:
種子培養基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環單菌落置于50 ml種子液培養基中，55 °C培養12 h，轉速為180 r/min。
[0020]發酵產酶:
產酶培養基:酵母粉15 g/L，牛肉膏25g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0021]發酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發酵培養基，發酵溫度為50°C，轉速為180 r/min，發酵時間為15 h。
[0022]該實施例酶產量達24571 U/ml。
[0023]實施例4:牛肉膏為氮源發酵產酶種子液制備:
種子培養基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環單菌落置于50 ml種子液培養基中，55 °C培養12 h，轉速為180 r/min。
[0024]發酵產酶:
產酶培養基:酵母粉15 g/L，牛肉膏30 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0。
[0025]發酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發酵培養基，發酵溫度為40°C，轉速為180 r/min，發酵時間為15 h。
[0026]牛肉膏為30 g/L時產酶量達23865 U/ml。
[0027]實施例5:氯化鈣為無機鹽發酵產酶種子液制備:
種子培養基為:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0.種子液制備方法:從固體瓊脂平板挑取一環單菌落置于50 ml種子液培養基中，55 °C培養12 h，轉速為180 r/min。
[0028]發酵產酶:
產酶培養基:酵母粉15 g/L，牛肉膏30 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0。
[0029]發酵條件:將種子液以2%接種量接種液體發酵培養基，發酵溫度為40°C，轉速為180 r/min，發酵時間為15 h。
[0030]該實施例產酶量達27780 U/ml。
[0031 ] 實施例6
以15 g/L酵母粉，30g/L牛肉膏，1 g/L NaCl，pH為7.0的培養基發酵產酶。以實施例2中的發酵條件和方法，當搖瓶發酵時間為16h時酶活達26752 U/ml，發酵28 h后酶活達到41426 U/mlo
[0032]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一株產過氧化氫酶的解脲芽孢桿菌，其特征在于:所述菌為解脲芽孢桿菌(Ureibacillus thermosphaericus)KAT_2，該菌種已于2015年12月9日保存于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M 2015733。2.用權利要求1所述解脲芽孢桿菌發酵生產過氧化氫酶的方法，其特征在于:用上述菌株為出發菌株，經種子液培養和以酵母粉為氮源、牛肉膏為碳源發酵生產過氧化氫酶。3.根據權利要求2所述的解脲芽孢桿菌發酵生產過氧化氫酶的方法，其特征在于:具體工藝為: (1)種子液培養: 種子液培養基:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH為7.0; 種子液制備:從固體瓊脂平板挑取一環單菌落置于50 ml種子液培養基中，55 °C培養.12 h，轉速為 180 r/min； (2)發酵產酶: 產酶培養基:酵母粉5?30g/L，牛肉膏10~35 g/L，CaCl2 1 g/L，pH為7.0; 發酵產酶:將種子液以2%接種量接種液體發酵培養基，發酵溫度為40?55 °C，轉速為.180 r/min，發酵時間為12?30 h，最終獲得過氧化氫酶液。
【專利摘要】一株解脲芽孢桿菌及及其生產高溫過氧化氫酶的方法，屬于生物工程領域。本發明提供了一株解脲芽孢桿菌，保藏編號為CCTCC？NO：M？2015733。該菌以酵母粉為氮源，牛肉膏為碳源促進產酶，經液體發酵可得到高產量的過氧化氫酶，酶活高達41426？U/ml。本發明過氧化氫酶制劑制備簡單、酶活性高，造價低廉，且溫度穩定性好，在紡織、造紙等領域有良好的應用前景。CCTCC NO：M 2009
【IPC分類】C12N9/08, C12R1/01, C12N1/20
【公開號】CN105483061
【申請號】CN201610034815
【發明人】林新堅, 陳濟琛, 田燕丹, 賈憲波, 鄭力
【申請人】福建省農業科學院土壤肥料研究所
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月20日