一種二羥基異喹啉及其從蜈蚣中制備的方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物領域，具體涉及從蜈蚣中提取一種新化合物3, 8-二羥基異喹啉 以及該活性物質在抗瘧疾活性、抗菌活性和抗腫瘤活性藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是人類健康的首要殺手。傳統腫瘤治療雖然具有一定療效，但由于化學 藥物非特異的細胞毒性，對患者具有較大的毒副作用，同時還容易產生耐藥性，給腫瘤患者 帶來巨大痛苦。從1972年Folkman提出了腫瘤血管增生學說以來，通過抑制腫瘤血管增生 來治療腫瘤的報道大量涌現，并取得了巨大成功。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉移的形態 學基礎。絕大多數惡性實體腫瘤如卵巢癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等都是血管依賴性腫瘤。 新生血管一方面為腫瘤生長提供營養和氧氣，另一方面還是腫瘤轉移的重要途徑。因此，抑 制腫瘤新生血管可以有效抑制腫瘤的發生、發展及轉移。
[0003] 蜈蚣為陸生節肢動物，全體共22個環節。頭部暗紅色或紅褐色，略有光澤，有頭板 覆蓋，頭板近圓形，前端稍突出，兩側貼有顎肢一對，前端兩側有觸角一對。軀干部第一背 板與頭板同色，其余20個背板為棕綠色或墨綠色，具光澤，自第四背板至第二十背板上常 有兩條縱溝線；腹部淡黃色或棕黃色，皺縮；自第二節起，每節兩側有步足一對；步足黃色 或紅褐色，偶有黃白色，呈彎鉤形，最末一對步足尾狀，故又稱尾足，易脫落。質脆，斷面有裂 隙。氣微腥，有特殊刺鼻的臭氣，味辛、微咸。功能主治息風鎮痙，功毒散結，通絡止痛。用 于小兒驚風，抽搐痙攣，中風口歪，半身不遂，破傷風，風濕頑痹，瘡瘍，瘰疬，毒蛇咬傷。
[0004] 蜈蚣中成分復雜，含兩種類似蜂毒的有毒成分，即組胺樣物質及溶血性蛋白質；尚 含脂肪油、膽留醇、蟻酸等。又曾分離出S -羥基賴氨酸；氨基酸有組氨酸、精氨酸、鳥氨酸、 賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、牛磺酸、谷氨酸。經文獻查閱， 有研究者（曲愛兵，趙維誠，梁良等蜈蚣組織提取物抗腫瘤活性的初步研究[J].實用腫瘤 學雜志，2003,17 (1) :29-30)采用MTT法檢測蜈蚣組織提取液，發現其對胃癌細胞和肝癌細 胞較強的細胞毒性。還有科研工作者（王碩，覃文慧多棘蜈蚣與少棘蜈蚣抗腫瘤作用研究 [J].中國實驗方劑學雜志，2011，13 :156-158)采用相同的方法檢測多棘巨蜈蚣和少棘巨 蜈蚣的勻漿液對人肝癌細胞Bel-7402的作用，確證了兩種蜈蚣均有較強的抗腫瘤作用。解 放軍第四五八醫院（韓莉，周永芹，韓鈺蜈蚣提取物誘導宮頸癌Hela細胞凋亡及其機制的 研究[J].時珍國醫國藥，2007，18(9) :2109-2111)以類似方法觀察蜈蚣對宮頸癌Hela細 胞增殖的影響，證明蜈蚣的乙醚、乙醇提取物對Hela細胞具有顯著的體外抗腫瘤活性。南 京師范大學江蘇省分子醫學生物技術重點實驗室（任文華，張雙全等少棘蜈蚣水提取物的 抗菌活性[J].中藥材，2007,01 :10-14)提取了蜈蚣水提物并確定其具有一定的抗菌活性。 但是目前尚未有研究證明蜈蚣中具有抗腫瘤或抗菌活性的組分具體是哪種物質，由于蜈蚣 提取物的組分復雜，而且可能還含有類似蜂毒的有毒成分，因此蜈蚣在制備抗腫瘤或抗菌 藥物領域中的應用一直受到限制。
[0005] 抗腫瘤生物堿中大多為異喹啉類生物堿，該類生物堿應用廣泛，其結構具有多樣 性。Rexahn 公司(Lee Young Bok, Ahn Chang-Ho, Cho Won-Jea. Substituted 3- (hetero) arylisquinolinamine derivatives for therapeutic applications. WO 2008063548 A2, 2008. 5. 29)擁有的5, 6或7取代3-氨基異喹啉衍生物可產生抗腫瘤作用，其能夠顯 著抑制耐紫杉醇（泰素）HCT-15人結腸癌細胞荷瘤裸鼠模型腫瘤的生長。中國專利申 請號為201210098631. 2,申請公布日為2012年7月25日的專利申請文件公開了二氫異 喹啉類化合物及其作為制備植物抗菌藥物的應用，該發明中合成了一系列二氫異喹啉類 化合物作為植物抗菌藥物，對多種植物病原菌具有良好的抑制作用。中國專利申請號為 201280041436. 4,申請公布日為2014年7月16日的專利申請文件公開了一種取代的2-烷 基-1-氧代-N-苯基-3-雜芳基-1，2, 3, 4-四氫異喹啉-4-酰胺，可用于預防和治療瘧疾。 雖然目前關于異喹啉類化合物用于抗菌或抗腫瘤治療的研究很多，關于其他結構的化合物 用于抗菌或抗腫瘤治療的研究也很多，但是蜈蚣中具體哪種組分物質具有抗腫瘤和抗菌功 能一直是領域內未知的，所以研究確定蜈蚣中的活性組分物質的具體結構具有非常重要的 醫學價值。

【發明內容】

[0006] 1.要解決的問題
[0007] 針對現有技術中蜈蚣的活性組分不明確、應用受到限制等問題，本發明提供一 種二羥基異喹啉及其從蜈蚣中制備的方法和應用，本發明從蜈蚣中提取的活性組分為 3, 8-二羥基異喹啉，具有抗瘧疾、抗菌和抗腫瘤的功能，首次確定了蜈蚣中活性組分的具體 結構，天然無毒性，活性效果好。
[0008] 2.技術方案
[0009] 為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：
[0010] -種二羥基異喹啉，其分子式為C9H7N02，為3, 8-二羥基異喹啉，分子量為161. 1， 結構式為：
[0012] 一種從蜈蚣中提取活性組分的方法，其步驟為：
[0013] a.用體積濃度為45-65 %的醇溶液制備蜈蚣醇提物；
[0014] b.采用葡聚糖凝膠層析法分離純化步驟a中的蜈蚣醇提物，收集多個組分樣品， 檢測確定其中抗腫瘤活性最好的組分樣品，記為組分樣品A，組分樣品A中含有上述的二羥 基異喹啉。
[0015] 優選地，步驟a中制備蜈蚣醇提物的步驟為：
[0016] (1)制備蜈蚣粉末，然后加入5-10倍蜈蚣粉末體積的PBS溶液進行超聲破碎勻 漿；
[0017] (2)對勻漿液冷凍離心，取上清液，冷凍干燥得到凍干的蜈蚣水提物；
[0018] (3)取步驟⑵中的得到的水提物加入蜈蚣粉末體積5-10倍的醇溶液進行勻漿， 然后在4°C條件下浸取，醇溶液的體積濃度為45-65% ;
[0019] (4)對浸取液再次冷凍離心，取上清液，冷凍干燥得到凍干的蜈蚣醇提物。
[0020] 優選地，步驟b中采用葡聚糖凝膠層析法分離純化蜈蚣醇提物的步驟為：
[0021] (1)將葡聚糖凝膠S印hadex G25注入層析柱中，用流動相沖洗，流動相為10~ 50 %乙醇；
[0022] (2)將蜈蟻醇提物配置成20~50mg/mL，在層析柱中上樣4~8mL，流速為0· 6~ 2mL/min，按照層析圖譜收集各組分樣品，對各組分樣品進行活性檢測，抗腫瘤活性最好的 組分記為組分樣品A。
[0023] -種制備上述的二羥基異喹啉的方法，其步驟為：
[0024] (a)用體積濃度為45-65 %的醇溶液制備蜈蚣醇提物；
[0025] (b)采用葡聚糖凝膠層析法分離純化步驟（a)中的蜈蚣醇提物，收集多個組分樣 品，檢測這些組分樣品的抗腫瘤活性，抗腫瘤活性最好的組分記為組分樣品A ;
[0026] (c)采用制備型RP-HPLC分離純化步驟（b)中得到的組分樣品A，進行梯度洗脫收 集多個活性峰組分，檢測這些活性峰組分的抗腫瘤活性，抗腫瘤活性最好的組分記為組分 B ；
[0027] (d)采用半制備型RP-HPLC分離純化步驟（c)中的組分B，進行梯度洗脫收集多個 活性峰組分，檢測這些活性峰組分的抗腫瘤活性，抗腫瘤活性最好的組分即為上述的二羥 基異喹啉。
[0028] 3, 8-二羥基異喹啉在制備抗瘧疾藥物、抗菌藥物及抗腫瘤藥物中的應用。
[0029] 優選地，所述的瘧疾為起源于寄生于人體的間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、惡性瘧原蟲 和卵形瘧原蟲。
[0030] 優選地，所述的菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、甲/乙型溶血 性鏈球菌、肺炎鏈球菌和嗜血流感桿菌。
[0031] 優選地，所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦、甲狀腺、胰腺、肺臟、肝臟、食管、胃、 乳腺、腎臟、膽囊、結腸或直腸、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發或繼發的癌以 及肉瘤。
[0032] 3.有益效果
[0033] 相比于現有技術，本發明的有益效果為：
[0034] (1)本發明經過大量的實驗摸索，首次從蜈蚣中發現了新化合物3, 8-二羥基異喹 啉以及其在抗瘧疾、抗菌和抗腫瘤藥物中的應用，實驗結果表明，3, 8-二羥基異喹啉可用于 治療癥疾，還具有殺菌的功能，同時還能治療實體腫瘤；所述的癥疾為寄生于人體的間曰癥 原蟲，三日瘧原蟲，惡性瘧原蟲和卵形瘧原蟲；所述的菌為大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠 假單胞菌，甲/乙型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌和嗜血流感桿菌；所述的腫瘤為起源于人的 頭頸部、腦、甲狀腺、胰腺、肺臟、肝臟、食管、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結腸或直腸、卵巢、子宮、 子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發或繼發的癌以及肉瘤；
[0035] (2)本發明通過不同的方法對蜈蚣粉末進行提取，采用MTT法對蜈蚣粉末的多種 提取液進行活性檢測，找到了抗腫瘤活性最佳的提取物，然后采用葡聚糖凝膠層析和制備 型高效液相等多種手段對該提取物分離純化，通過高效液相、質譜、氫譜、碳譜和紅外等手 段對分離的化合物進行分析，首次確定了蜈蚣醇提物活性組分中起到抗瘧疾、抗菌和抗腫 瘤活性的主要成分為3, 8-二羥基異喹啉；
[0036] (3)本發明通過大量實驗測試，得出乙醇浸取能從蜈蚣粉末中提取出最佳抗腫瘤 活性組分，去除或減少與抗腫瘤無關的組分，提取后的組分具有更