一種穿膜多肽及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，涉及腫瘤相關的藥物領域，具體而言，本發明涉及一種 穿膜多肽，以及該多肽與抗腫瘤藥偶聯形成的偶聯物。
【背景技術】
[0002] 腦瘤及腦轉移瘤的發病率逐年上升。在對其治療方面，血腦屏障被認為是阻止化 療藥物進入腦組織進而影響療效的主要原因。血腦屏障是機體參與固有免疫的內部屏障之 一，由介于血循環與腦實質間的軟腦膜、脈絡叢的腦毛細血管壁和包于壁外的膠質膜所組 成，能阻擋病原生物和其他大分子物質由血循環進入腦組織和腦室。基本上100%的大分子 藥物，包括多肽、重組蛋白、單克隆抗體、基于RNA干擾技術的藥物、基因治療相關藥物等都 無法穿越血腦屏障，且大于98%的小分子藥物也無法穿過血腦屏障。目前，放射性治療與 化學療法只能延長患者生命4個月，因此本發明致力于研究使現有藥物更好的透過血腦屏 障。
[0003] 多肽由于其具有極性末端和非極性末端，因此在體內有較高的利用度，由于本身 是內源性物質所以毒性小，但是多肽直接作為藥物受到較大的限制，例如其穩定性差，不能 口服。近年來，多肽作為藥物輔助功能的應用逐漸成為了新藥研制的熱點之一。細胞穿膜肽 是20世紀中期開始認識到的一類具特殊功能的多肽分子，英文學術名稱一般寫為cell2-p enetrating-peptides (CPPs)。它們通常由5~30個氨基酸組成，典型的一般由8~16個氨 基酸構成，具有生物膜穿透功能，還可攜帶其它分子甚至超分子顆粒進入細胞中。正是因為 這種特殊的功能，它們被看作生物活性分子有效的細胞內轉運工具，具有廣泛的應用前景。
[0004] 近些年來多肽和藥物通過共價方式形成組合物的例子很多，例如：多肽 Penetratin和阿霉素共價耦合用于治療乳腺癌；多肽TAT和藥物P53共價耦合用于治療眼 癌轉移；多肽YTA4與甲氨蝶呤共價耦合治療乳腺癌。
【發明內容】
[0005] 以下是本發明的詳細描述：
[0006] (1)本發明所述的穿膜肽
[0007] 本發明所述的細胞穿膜肽，由13個氨基酸組成，而且是親水性和疏水性交替組合 的，氨基酸序列為：
[0008] RGGRVRRRWRGGR
[0009] 該多肽本身不具有生理活性，但是具有透過血腦屏障的作用，本發明還涉及該多 肽的制備方法及其應用。
[0010] (2)本發明所述的穿膜肽的制備方法
[0011] 本發明所需多肽是采用固相的方法制備的，固相合成是以固相載體樹脂為載體， 從C端即羧基端向N端即氨基端逐漸添加氨基酸的過程。
[0012] 本發明中優選樹脂：Fmoc-wang樹脂、2-cl-trt樹脂，樹脂取代度0. 24~0. 4.
[0013] 本發明所使用的保護氨基酸為：Fmoc-Arg(pbf)-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-Val-〇H, Fmoc-Trp-OH，反應過程中保護氨基酸3~5倍過量。
[0014] 本發明所使用的脫保護試劑為：哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，比例為10:90~ 30:70。
[0015] 本發明所使用的偶聯試劑為：①苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽 /1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑）-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯 /1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，③Ν，Ν'_二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)。
[0016] 本發明中，若使用第①或者第②種偶聯試劑，那么反應中過程中應添加縛酸劑： DIEA/NMP。
[0017] 本發明中所使用的切割試劑為：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比例 為：82· 5:5:5:5 ;2· 5〇
[0018] 本發明中所使用MS-IT-T0F確定分子量，使用HPLC純化粗肽
[0019] (3)本發明所述多肽與抗腫瘤藥物阿霉素的連接方法
[0021] 1)化合物II的合成
[0022] 50m 反應瓶中加入 1. 0g(l. 72mmol)阿霉素，0· 52g(5. 20mmol) 丁二酸酐，30mlTHF， 滴加0. 66g(5. 12mmol)N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，27°C攪拌6h，蒸干溶劑得蠟狀物，加水攪 拌，有黃色固體析出，抽濾，水洗兩次，干燥，得黃色固體1. 15g。
[0023] 2)化合物I的合成
[0024] 50m 反應瓶中加入 0· 22g(0. 32mmol)化合物 ΙΙ，0· 10g(0. 31mmol)0-苯并三氮 唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)，5mlDMF，氮氣保護，滴加0. 08g(0. 62mmol) N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，27°C攪拌lh后，加入0. 10g多肽，27°C攪拌3h后，終止反應。使 用MS-IT-T0F確定分子量，使用HPLC純化粗產物。
[0025] (4)本發明所述多肽與抗腫瘤藥物紫杉醇的連接方法
[0026]
[0027] 1)化合物III的合成
[0028] 50m 反應瓶中加入 1. 50g(l. 72mmol)紫杉醇，0· 52g(5. 20mmol) 丁二酸酐， 30mlTHF，滴加0. 66g(5. 12mmol)N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，27°C攪拌6h，蒸干溶劑得蠟狀 物，加水攪拌，有黃色固體析出，抽濾，水洗兩次，干燥，得黃色固體1. 15g。
[0029] 2)化合物IV的合成
[0030] 50m 反應瓶中加入 0· 22g(0. 32mmol)化合物 ΙΙΙ，0· 10g(0. 31mmol)0-苯并三氮 唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)，5mlDMF，氮氣保護，滴加0. 08g (0. 62mmol) N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，27°C攪拌lh后，加入0. 10g多肽，27°C攪拌3h后，終止反應。使 用MS-IT-T0F確定分子量，使用HPLC純化粗產物。
【附圖說明】
[0031] 圖1為合成多肽的HPLC測試結果圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0033] 在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0034] 實施例1:多狀的固相合成
[0035]