一種煙草根黑腐病菌分子檢測引物及其快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業生物技術領域。具體涉及對煙草根黑腐病菌快速靈敏的分子檢 測，同時可用于煙草根黑腐病的早期診斷及病菌的檢測鑒定。
【背景技術】
[0002] 煙草根黑腐病是由根串珠霉[Thielaviopsisbasicola(Berk.etBr.)]引起的煙 草生產上的一種重要土傳病害，它遍布世界主要產煙區，使煙草生產遭受重大損失。該病原 菌可侵染為害多種植物，如煙草、棉花、豆類、花生、柑桔及多種觀賞植物。煙草根黑腐病是 世界性的病害，在我國云南、貴州、湖北等省發生較重，嚴重地塊發病率可達30%以上。山 東、河南、安徽、吉林、福建等省也有發生，近年來該病在我國有加重為害的趨勢。煙草根黑 腐病主要發生于煙株根系上，使根呈特異性的黑色腐爛，從幼苗至成株期均可發病。苗染病 引起"猝倒"，但根部發黑，別于猝倒病。病菌從根莖部侵入，病斑環繞莖部一周，向上侵至于 葉，下侵至側根，使整株幼苗枯死。較大煙株染病側根、根尖變黑，病株生長遲緩，植株矮小， 葉色黃褐。重病株拔起可見整株根系變黑褐、壞死，病株葉片變黃、變薄，嚴重影響煙草產量 和質量。病殘體和帶菌土壤是該病的初侵染源。條件適宜時分生孢子或厚垣孢子萌發產生 侵入絲由傷口侵入寄主表皮細胞，侵入后，菌絲在煙草表皮細胞間分枝蔓延，產生大量分生 孢子和厚垣孢子，進行再侵染。該病發病適溫17~23°C，15°C以下或26°C以上發較輕。相 對濕度在80%以上時發病重。低溫多雨或連陰雨天容易造成流行。該病菌可侵染豆科、萌 蘆科等30科120多種植物，與這些科植物連作發病重。低洼下濕地、瘠薄鹽堿地易發病。
[0003] 由于根黑腐病為土傳病害，通常與其它煙草根莖部的病害混合發生，給病害的正 確診斷造成困難。根黑腐病菌危害煙草在肉眼能夠觀察到病癥之前稱為危害早期階段，在 根黑腐病病害發生的早期階段，不能顯現出根部發黑，病斑環繞莖部、側根、根尖變黑等煙 草根黑腐病病癥。通常根黑腐病菌危害煙草5-6天才能觀察到病癥，因此，在煙草根黑腐病 害發生的早期難以針對性地進行有效防治，造成根黑腐病菌危害嚴重，引起較大的經濟損 失。因此，建立煙草根黑腐病菌特異性的快速分子檢測體系，及早對發病植株或土壤中帶菌 病原菌快速準確地進行檢測，對于及時采取科學合理的防治措施控制病害的發生、流行，減 少病害造成的經濟損失具有重要的指導意義。
[0004] 傳統用于對植物病原菌的檢測鑒定方法是首先利用選擇性培養基進行病原菌的 分離培養，獲得純培養菌株以后，根據菌落特征、孢子形態大小等形態學特征、致病性測定、 生理生化特性等進行鑒定。這些方法耗時費力，程序繁瑣，且病原菌的分離鑒定經驗性很 強。已有研究表明，煙草根黑腐病菌不同菌株間的形態差異明顯，有些菌株可產生大量的扇 形白化菌株，有些白化菌株的單孢菌落可回復到野生型，鑒定時易受人為環境等諸多因素 的干擾。此外，由于不能直接從植物帶病組織中檢測出病原菌，難以滿足病害防治所需的快 速、準確、靈敏的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期。
[0005] 近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，以聚合酶鏈式反應（PCR)技術為代表 的分子檢測方法得到了迅速的發展和應用。基于基因組DNA的PCR技術的快速發展有效地 彌補了傳統分類鑒定方法的不足，其具有的特異性、靈敏性和快速性等特點成為植物病原 菌分類和鑒定應用最廣泛的技術之一。由于PCR技術不需要對病原菌進行分離純化即可對 植物病組織進行快速檢測和診斷，因此可用于煙草根黑腐病顯癥前的早期診斷，為病害的 準確鑒定和及時防治提供科學依據。
[0006]目前針對植物病原菌的PCR檢測技術絕大部分是基于核糖體內轉錄間隔區 (rDNA-ITS)序列開發的特異性引物。國內外研究人員也對煙草根黑腐病菌的rDNA-ITS序 列開發了用于PCR技術的特異性擴增引物。但是越來越多的研究發現，在一些近緣種的病 原菌中，rDNA-ITS序列差異很小，以ITS為靶標設計的引物難以將它們區分開，因此需要開 發一些新的基因進行檢測。微管蛋白（Tubulin)是一類含有多個成員的蛋白質家族。真核 生物微管蛋白家族最常見的成員是α-微管蛋白和β-微管蛋白，它們是組成微管的主要 成分。β-tubulin基因包含有多個外顯子和內含子，多個外顯子具有保守性，而這些內含子 在不同物種之間有較大的變異，適合于設計引物進行分子檢測區分不同的物種。目前基于 β-tubulin基因開發對煙草根黑腐病菌的檢測技術在國內外均未見報道。

【發明內容】

[0007] 為解決現有對煙草根黑腐病菌的早期診斷困難、靈敏度低，致使難以提出及時、準 確防治科學依據，以及現有分子檢測中rDNA-ITS序列差異很小，以ITS為靶標設計的引物 難以將一些近緣種的病原菌區分開的技術問題，本發明提供一種靈敏度高、能早期診斷出 煙草根黑腐病菌，特異性強的分子檢測引物及結果準確、易于操作的煙草根黑腐病菌快速 分子檢測方法。
[0008] 本發明的技術方案如下：
[0009] 1. -種煙草根黑腐病菌分子檢測引物，其特征在于：所述煙草根黑腐病菌分子檢 測引物由上游引物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR組成，所述上游引物Tbas-tubF的堿 基序列如SEQIDN0:1所示，所述下游引物Tbas-tubR的堿基序列如SEQIDN0:2所示，目 標產物片段長度為254bp。
[0010] 2. -種煙草根黑腐病菌的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：
[0011] (1)從待檢煙草植物組織中提取基因組DNA;
[0012] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，用技術方案1所述的煙草根黑腐病菌分 子檢測引物進行PCR擴增；
[0013] (3)取5~8μ1步驟（2)的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經核酸生物染料 染色后在凝膠成像系統下拍照觀察，如果能特異性地擴增出一條254bp的片段，則待檢煙 草植物組織中存在煙草根黑腐病菌。
[0014] 3.根據技術方案2所述煙草根黑腐病菌的快速檢測方法，其特征在于：步驟（2) 所述PCR擴增的反應體系為：PCR反應體系總體積20μ1，其中10XreactionBuffer 2yl，100mmol/LMgCl2bufTer1.2yl，2.5mmol/LdNTP]\^叉1：11代1.6卩1，10卩1]1〇1/1^上游 引物11^8-1:油？0.4以1，10以1]1〇1凡下游引物113&8-1:油1?0.4以1，51]/以11^&9?〇15〇116抑86 〇. 1μ1，模板DNA1μ1，滅菌超純水補足總體積；PCR擴增程序為：94°C預變性4min，94°C變 性40s，60°C退火30s，72°C延伸40s，共35個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0015] 與現有技術相比，本發明的有益效果如下：
[0016] 1、特異性強：本發明是根據煙草根黑腐病菌β-tubulin基因序列與其他物種進 行多重比對分析后，設計出對煙草根黑腐病菌具有特異擴增作用的PCR檢測引物。本發明 通過對煙草根黑腐病菌、帶根黑腐病煙草組織、常見18種植物病原菌：煙草疫霉、致病疫 霉、辣椒疫霉、大?疫霉、棉疫霉、隱地疫霉、標桐疫霉、終極腐霉、瓜果腐霉、林棲腐霉、稻痕 病菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、花生黑腐病菌、立枯絲核菌、灰綠青霉、黑根霉、哈茨木霉、 隨機從土壤分離的真菌進行了檢測驗證，充分證明本發明引物的特異性強、檢測結果的可 靠性。
[0017] 2、靈敏度高、能夠對微量的煙草根黑腐病菌進行檢測：本發明設計的特異性引物 對煙草根黑腐病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10pg，能夠對微量的煙草根黑腐病菌 進行檢測。
[0018] 3、能夠早期檢測出煙草根黑腐病菌：本發明特異性引物及其檢測方法能夠對在根 黑腐病菌侵染煙草24h以及4天前即植株尚未顯病癥的早期階段均能檢測到根黑腐病原 菌，對根黑腐病菌進行準確的診斷和鑒定。
[0019] 4.實用性好：本發明設計的特異性引物可用于煙草根黑腐病菌帶病組織的早期 診斷和高靈敏度的微量快速檢測，因此，本方法的實用性強，可以滿足對帶菌組織中存在的 煙草根黑腐病菌進行及早、快速可靠的檢測和鑒定。
[0020] 5.操作簡便快捷：應用本發明檢測方法，從煙草黑腐病病樣組織清洗、病原菌DNA 提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳到獲得檢測結果，整個過程僅需要3~4小時，與常規生物 檢測方法相比，操作簡便快捷，大大縮短了鑒定所需的時間。
[0021] 綜上所述，本發明方法操作簡便、快捷、能夠對煙草根黑腐病進行早期診斷、檢測 靈敏度高達到l〇pg，對于煙草根黑腐病害的鑒定及早期監測，指導生產上對該病害進行及 時防治提供了及時準確的方法和科學依據。
[0022] 序列表中SEQIDN0 :1所示的是上游引物Tbas-tubF的堿基序列。
[0023] 序列表中SEQIDN0 :2所示的是下游引物Tbas-tubR的堿基序列。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明對煙草根黑腐病菌的特異性PCR擴增圖。圖中：M為DL2000DNA marker;泳道1~4為煙草根黑腐病菌；泳道5為煙草疫霉；泳道6為致病疫霉；泳道7為 辣椒疫霉；泳道8為大豆疫霉；泳道9為棉疫霉；泳道10為隱地疫霉；泳道11為棕櫚疫霉； 泳道12為終極腐霉；泳道13為瓜果腐霉；泳道14為林棲腐霉；泳道15為稻痕病菌；泳道 16為尖孢鐮刀菌；泳道17為禾谷鐮刀菌；泳道18為花生黑腐病菌；泳道19為立枯絲核菌； 泳道20為灰綠青霉；泳道21為黑根霉；泳道22為哈茨木霉；泳道23為土壤分離真菌；泳 道24為陰性對照。
[0025] 圖2本發明對煙草根黑腐病菌檢測的靈敏度擴增圖。圖中：M為DL2000DNA marker;泳道1為100ng;泳道2為10ng;泳道3為lng;泳道4為100pg;泳道5為10pg; 泳道6為lpg;泳道7為100fg;泳道8為10fg;泳道9為陰性對照。
[0026] 圖3本發明對煙草根黑腐病菌早期侵染組織檢測的結果圖。圖中：M為DL2000DNA marker;泳道1為健康煙草組織（陰性對照）；泳道2為根黑腐病菌侵染6小時的煙草組織； 泳道3為根黑腐病菌侵染12小時的煙草組織；泳道4為根黑腐病菌侵染24小時的煙草組 織；泳道5為根黑腐病菌侵染48小時的煙草組織；泳道6為根黑腐病菌侵染72小時的煙草 組織；泳道7為根黑腐病菌侵染5天的煙草組織；泳道8為根黑腐病菌DNA(陽性對照）。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡述本發明，但并不是對本發明的限 制，僅僅作示例說明。以下各實施例中使用的試劑、煙草品種紅花大金元均能從商業渠道購 買。以下各實施例中無特殊說明的為常規方法。
[0028] 實施例1本發明PCR引物設計及引物對煙草根黑腐病菌的特異性擴增
[0029] 一、引物設計及合成
[0030] 從GenBank下載煙草根黑腐病菌和其它物種的β-tubulin基因序列，用ClustalW 軟件進行多重多序列比對、分析，找到煙草根黑腐病菌β-tubulin基因的特異性序列； 利用Primers軟件進行引物設計，所設計的煙草根黑腐病菌分子檢測引物由上游引物 Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR組成，所述上游引物Tbas-tubF的堿基序列如SEQIDN0 : 1所示，所述下游引物Tbas-tubR的堿基序列如SEQIDNO:2所示，對煙草根黑腐病菌特異 性擴增的預期片段大小為254bp。設計好的引物由上海invitrogen公司進行合成。
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