一種華法林藥物基因突變位點檢測的試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術及臨床分子診斷領域，尤其涉及一種華法林藥物基因突變位 點檢測的試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 華法林（warfarin)是目前臨床上廣泛使用的維生素K拮抗劑類口服抗凝血藥，通 過干擾環氧化型維生素K與氫醌型維生素K之間的轉化循環而產生抗凝效益，常用于靜脈 血栓栓塞、心肌梗死、缺血性腦卒中、心臟瓣膜置換術后、房顫等的抗凝治療和預防。由于華 法林治療窗口較窄，在臨床使用過程中，不同個體間的穩定治療劑量不盡相同，如果給藥量 不足會導致血栓形成，給藥量過大將會增加出血風險，甚至危及生命。因此，為不同個體選 擇合適的抗凝方案，已成為心臟術后患者遠期療效重要的影響因素之一。
[0003] 研究表明，華法林的用藥劑量除了受患者年齡、性別、體重、體表面積、營養狀態、 肝腎功能、飲食及使用藥物等臨床因素的影響外，華法林的靶酶VK0RC1和用藥劑量酶 CYP2C9的基因遺傳多態性是影響華法林用藥劑量差異性的主要因素。
[0004] 在藥效學方面，華法林通過抑制VK0RC1的活性，阻礙維生素K由環氧化物轉化成 氫醌，從而阻斷凝血因子II、VE、IX、X及抗凝蛋白C和S的活化達到抗凝的目的。大量研究 發現，在VK0RC1編碼區和非編碼區存在大量的多態性位點，其中VK0RC1啟動子的基因多態 性（_1639G>A)和內含子區域1173CXT基因多態性是影響華法林需求劑量中種族差異和個 體差異的最主要因素。當VK0RC1基因突變后轉錄活性下降，抗華法林的能力降低，從而在 藥物效應動力學方面影響華法林的作用。
[0005] 在藥代動力學方面，華法林是由R-和S-對映體組成的外消旋混合物，在肝臟中經 細胞色素酶P450代謝為非活性產物。其中S-華法林拮抗維生素K的能力是R-華法林的 3~5倍，在穩定狀態下，S-華法林能夠發揮60 %~70 %的抗凝作用，并主要經CYP2C9酶代 謝。CYP2C9是CYP系統的亞家族，該酶基因位于染色體10q24. 2上，全長約55kb，含有8個 內含子和9個外顯子，編碼490個氨基酸，分子量為55kd的蛋白質。CYP2C9基因編碼區存在 著單核苷酸多態性，與亞洲人群最為密切的是CYP2C9*2 (430OT)和CYP2C9*3 (1075A>C)。 研究表明，具有這兩種突變的個體所需華法林劑量明顯降低，出血的風險也隨之增加。因此 研究基因多態性與華法林劑量需求的關系，指導個體化用藥，具有重要的臨床意義。
[0006] 目前常用的檢測基因多態性的方法有DNA直接測序法、限制性片段長度多態性分 析法（PCR-PFLP)、高分辨溶解曲線（HRM)、基因芯片、液相芯片法、熒光定量PCR法等。測 序法是公認的基因突變檢測的金標準，能夠準確地顯示可能存在的具體突變類型，但測序 法所用的設備成本高、檢測時間稍長、操作繁瑣、靈敏度較低，而且結果判讀復雜，對操作者 要求較高，難以形成商業化的診斷產品。限制性片段長度多態性分析步驟繁多、靈敏度低， 而且檢測結果經常需要測序法確認，也不是適用于臨床檢測的簡便有效的方法。高分辨溶 解曲線是近年來興起的一種檢測基因突變、進行基因分型和SNP檢測的新工具，可以迅速 的檢測出核酸片段中單堿基的突變。但是該方法難于篩查純合突變，并且假陽性、假陰性較 高，PCR條件苛刻，不能分型，而且檢測結果需要測序法確認。基因芯片和液相芯片雖能準 確區分具體的突變類型，但是其對設備要求高，難以大規模推廣，多用于科研單位。
[0007] 熒光定量PCR法是分子診斷領域應用最廣泛的一種檢測手段，該方法靈敏度高、 操作簡便，適合大規模的臨床應用，特別是ABI公司的MGB探針技術在單核苷酸分型方面更 是具有廣闊的市場。MGB探針上的小溝結合物能夠提高探針的Tm值，設計的比普通Taqman 探針短，無背景熒光，而且具有能分辨一個堿基差異的能力，非常適合用于SNP分型檢測。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一種用于檢測VK0RC1和CYP2C9基因SNP位點的試劑盒及 檢測方法。
[0009] 本發明提供的試劑盒包括：PCR混合反應液、引物探針mix、酶mix，以及陽性對照 品。本發明所述的PCR混合反應液中包括PCRBuffer、MgC12、dNTPs。本發明所述的酶mix 包括UNG酶、TaqDNA聚合酶。本發明所述的引物探針mix包括檢測基因VK0RC1 (_1639G>A) SNP位點的引物及特異性MGB探針，或檢測基因VK0RC1 (1173C>T)SNP位點的引物及特異性 MGB探針，或檢測基因CYP2C9*2 (430C>T)SNP位點的引物及特異性MGB探針，或檢測基因 CYP2C9*3 (1075A>C)SNP位點的引物及特異性MGB探針；或檢測內參基因GAPDH的引物和探 針；本發明所述的陽性對照品包括VK0RC1 (_1639G>A)SNP位點野生型、突變型質粒DNA及內 參質粒DNA的混合物；或者VK0RC1 (1173C>T)SNP位點野生型、突變型質粒DNA及內參質粒 DNA的混合物；或者CYP2C9*2 (430OT)SNP位點野生型、突變型質粒DNA及內參質粒DNA的 混合物；或者CYP2C9*3 (1075A>C)SNP位點野生型、突變型質粒DNA及內參質粒DNA的混合 物。
[0010] 本發明提供的試劑盒可以在4管內完成VK0RC1基因及CYP2C9基因共4個SNP位 點的檢測，操作簡便，靈敏度高。其中反應管A檢測VK0RC1基因-1639G>A多態性，反應管 B檢測VK0RC1基因11730T多態性，反應管C檢測CYP2C9*2 (430OT)基因多態性，反應管 D檢測CYP2C9*3(1075A>C)基因多態性。
[0011] 本發明提供的試劑盒針對各基因的SNP位點設計等位基因特異性MGB探針、通用 上游引物和通用下游引物，所述特異性MGB探針優選在5'端連接有熒光發光基團，3'端連 接有熒光淬滅基團。所述的熒光發光基團為FAM或VIC，所述的熒光淬滅基團為MGB。具 體地，所述的檢測VK0RC1基因-1639G>ASNP位點的上游引物、下游引物、野生型探針、突 變型探針序列如SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示；所述的檢測 VK0RC1基因1173C>TSNP位點的上游引物、下游引物、野生型探針、突變型探針序列如SEQ IDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8所示；所述的檢測CYP2C9*2(430C>T)SNP 位點的上游引物、下游引物、野生型探針、突變型探針序列如SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、 SEQIDN0:11、SEQIDN0:12所示；所述的檢測CYP2C9*3(1075A>C)SNP位點的上游引物、下 游引物、野生型探針、突變型探針序列如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQ IDNO: 16所示。具體序列如下：

[0028] 本發明提供的試劑盒還用管家基因GAPDH作為內對照。所述內標探針為Taqman探 針，優選在5'端連接有熒光發光基團，3'端連接有熒光淬滅基團。所述的熒光發光基團為R0X，所述的熒光淬滅基團為BHQ2。所述內標上、下游引物及探針序及列如SEQIDN0:17、 SEQIDN0:18、SEQIDN0:19**。
[0032] 當所述引物探針包括如SEQIDNO: 1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所 示的序列中的一種或多種時，所述陽性對照品是VK0RC1 (_1639G>A)SNP位點野生型、突變 型質粒及內參質粒DNA的混合物；當所述引物探針包括如SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQ IDN0:7、SEQIDN0:8所示的序列中的一種或多種時，所述陽性對照品是VK0RC1(1173C>T) SNP位點野生型、突變型質粒及內參質粒DNA的混合物；當所述引物探針包括如SEQID N0:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11、SEQIDNO: 12所示的序列中的一種或多種時，所述陽 性對照品是CYP2C9*2 (430C>T)SNP位點野生型、突變型質粒及內參質粒DNA的混合物；當所 述引物探針包括如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16 所示的序 列中的一種或多種時，所述陽性對照品是CYP2C9*3 (1075A>C)SNP位點野生型、突變型質粒 及內參質粒DNA的混合物。
[0033] 本發明的第二個目的是提供一種華法林藥物基因VK0RC1和CYP2C9突變位點的檢 測方法。該方法具體是針對VK0RC1基因和CYP2C9基因的SNP位點設計等位基因特異性 MGB探針，其中SNP位點需要位于MGB探針中間靠近3'端的位置，但距3'末端至少有3個 堿基，然后再設計與該MGB探針相匹配的的通用上下游引物及內參引物探針。反應體系中 加入PCR混合反應液、酶mix、等位基因特異性MGB探針、各SNP位點的上下游引物、內參引 物探針進行熒光定量PCR的檢測。
[0034] 所述檢測VK0RC1基因-1639G>ASNP位點的引物探針序列包括如SEQIDN0:1、SEQ IDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示的一種或多種；所述檢測VK0RC1 基因 1173C>TSNP 位點的引物探針序列包括如SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8所示 的一種或多種；所述檢測CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的引物探針序列如SEQIDN0:9、SEQ IDN0:10、SEQIDN0:11、SEQID勵：12所示的一種或多種；所述檢測0￥?209*3(1075八>〇 SNP位點的引物探針序列如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16所 示的一種或多種。
[0035] 所述內參引物探針序列如SEQIDNO: 17、SEQIDNO: 18、SEQIDNO: 19所示。
[0036] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：采用等位基因特異性MGB探針對SNP位點 進行擴增檢測，設計簡單，操作方便，靈敏度高，結果易判讀。本發明方法中采用的熒光標記 探針是等位基因特異性MGB探針，縮短了探針序列，提高了檢測特異性，在一個反應管中即 可有效區分2種不同SNP位點。本發明的檢測試劑盒及檢測方法具有以下優點：（1)采用 等位基因特異性MGB探針技術，靈敏度高，特異性好，能有效阻止非特異性擴增；(2)采用多 重熒光PCR檢測技術，與